斑點叉尾鮰冬季大規(guī)模死亡病原分離與鑒定

楊移斌，劉天強，陽濤，胥寧，董靖，楊秋紅，劉永濤，艾曉輝*

(1.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430223；3. 通威股份有限公司動物保健研究所，四川成都 610041)

斑點叉尾鮰冬季大規(guī)模死亡病原分離與鑒定

楊移斌1,2，劉天強3，陽濤3，胥寧1,2，董靖1,2，楊秋紅1,2，劉永濤1,2，艾曉輝1,2*

(1.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430223；3. 通威股份有限公司動物保健研究所，四川成都 610041)

2016 年1—2月湖南安化地區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖的斑點叉尾鮰暴發(fā)大規(guī)模死亡，死亡率接近80%，發(fā)病魚體重為1.5～2.0 kg。本研究從患病瀕死魚肝、脾、腎分離到1 株致病菌，對其進行常規(guī)理化特性、分子生物學、人工感染實驗以及藥敏性檢測。結(jié)果顯示，分離菌株理化特性與魯氏耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)特征相符，與NCBI中登錄的魯氏耶爾森氏菌的16S rDNA基因同源性達99%以上，在系統(tǒng)發(fā)育樹上與魯氏耶爾森氏菌聚為一族。人工感染魚出現(xiàn)與自然發(fā)病相似癥狀，并能夠從發(fā)病魚組織中再次分離到相同病原菌，表明魯氏耶爾森氏菌為斑點叉尾鮰該病病原菌。該分離菌株對氟苯尼考、多西環(huán)素及新霉素等藥物高度敏感，本研究為斑點叉尾鮰暴發(fā)性出血病防控提供了理論依據(jù)。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標準，2016,6(6):53-58]

斑點叉尾鮰；魯氏耶爾森氏菌；16S rDNA；病害防控；鑒定

斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)，又稱溝鯰，屬鯰形目(Siluriformes)、鮰科(Ictaluridae)，于1984 年由湖北水產(chǎn)研究機構(gòu)引進中國養(yǎng)殖。斑點叉尾鮰具有肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富、無肌間刺等優(yōu)點，深受廣大消費者的喜愛。其對中國養(yǎng)殖環(huán)境適應(yīng)性較強，因此受到國內(nèi)養(yǎng)殖者推崇，養(yǎng)殖范圍及規(guī)模不斷擴大，產(chǎn)量不斷提高，目前斑點叉尾鮰養(yǎng)殖已在湖南、湖北、安徽和廣東等全國30 多個省(市)有分布。但近年來由于養(yǎng)殖品種的種質(zhì)退化，養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化，斑點叉尾鮰在養(yǎng)殖過程中常遇到各種病害，死亡率通常很高，使斑點叉尾鮰養(yǎng)殖具有較大的風險，阻礙了其養(yǎng)殖業(yè)的進一步發(fā)展。目前報道的斑點叉尾鮰病害病原主要有氣單胞菌屬[1-2]、愛德華氏菌[3]、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌[4]、海豚鏈球菌[5]等。

2016 年1—2月湖南安化地區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖的斑點叉尾鮰暴發(fā)大規(guī)模死亡，發(fā)病涉及同一水域大部分網(wǎng)箱，死亡率接近80%，發(fā)病魚體重為1.5～2.0 kg。由于當時氣溫較低，養(yǎng)殖的斑點叉尾鮰已經(jīng)不進食，給病害防控帶來了極大的難度。本研究從患病的斑點叉尾鮰體內(nèi)分離到一株高致病性的菌株，通過回歸感染、鑒定及藥敏分析等研究，確定了斑點叉尾鮰該病的病原菌及其種類，為斑點叉尾鮰養(yǎng)殖中冬季病害防控提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用魚

具備典型癥狀的患病斑點叉尾鮰取自湖南安化水庫網(wǎng)箱養(yǎng)殖基地；回歸感染用魚規(guī)格(150±5) g，購自武漢白沙洲水產(chǎn)市場，魚體無傷痕，體格健壯，活力強，暫養(yǎng)7 d后無異常進行實驗。

1.1.2 實驗試劑

細菌生化微量鑒定管、藥敏紙片、營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、BHI液體及瓊脂培養(yǎng)基與水解酪蛋白瓊脂均購自杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒、DNA分子Marker均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床診斷

對發(fā)病水域養(yǎng)殖條件、發(fā)病斑點叉尾鮰規(guī)格及發(fā)病情況進行現(xiàn)場調(diào)查；取瀕死病魚進行臨床診斷，確定該病的典型癥狀，并取病魚鰓、肝、腎及脾等重要組織器官進行光學顯微觀察。

1.2.2 病原菌分離純化

取具有典型癥狀患病瀕死斑點叉尾鮰的肝、腎、脾，在無菌條件下，在營養(yǎng)瓊脂及腦心浸出液平板上劃線。將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中24 h，挑取形態(tài)大小一致的優(yōu)勢菌落進一步純化培養(yǎng)。分離純化到的菌株加入濃度為25%的甘油，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 人工回歸感染

將分離純化后的菌株接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水洗下菌苔，參照麥氏比濁法調(diào)整菌懸液濃度為5. 9 × 107CFU/mL。

選取健康斑點叉尾鮰分為實驗組和對照組，每組實驗用斑點叉尾鮰數(shù)量均為10尾，實驗組和對照組都設(shè)置2個重復(fù)。實驗時，水體溶氧保持在6.0～7.5 mg/L，魯氏耶爾森氏菌在20 ℃下能分泌溶血素的能力增強，細菌毒力較大[6]，越易導致水生動物致病，故設(shè)定感染水溫為18～20 ℃，實驗過程中保持水質(zhì)良好，不投喂餌料。在實驗組每尾斑點叉尾鮰胸鰭基部注射制備的菌懸液，注射量為0.2 mL/尾，對照組在其胸鰭基部注射同等劑量的無菌生理鹽水。每隔3 h觀察斑點叉尾鮰的活動情況，以及體表是否出現(xiàn)異常癥狀，發(fā)病死亡病例及時進行記錄，并對瀕臨死亡的斑點叉尾鮰進行解剖，觀察器官組織變化情況，同時進行細菌的再分離，實驗周期為7 d。

1.2.4 病原菌形態(tài)觀察及生理生化特征測定

將分離純化得到病原菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落大小及形態(tài)特征，并挑取形態(tài)一致的單個菌落進行革蘭氏染色，其他生理生化指標參照參考文獻[7]及微量生化反應(yīng)管說明書進行測定。

1.2.5 病原菌16S rDNA基因部分序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

提取分離純化得到的菌株總DNA作為模板，利用通用引物27F: 5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3'，反向1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，此階段35個循環(huán)，72 ℃溫育10 min[7]。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測得的序列與NCBI 中的BLAST 進行相似性分析，用Mega5.1軟件中Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.6 藥敏特性分析

分離菌株藥物敏感特性測定采用國際通用的紙片擴散法(K-B法)，將分離純化得到的菌株接種于營養(yǎng)肉湯，28 ℃搖床(200 r/min)培養(yǎng)18 h后，稀釋菌液濃度至107CFU/mL，取200 μL均勻涂布于MH瓊脂平板上，貼上不同的藥敏紙片，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測量其抑菌圈直徑(mm)，根據(jù)杭州微生物試劑有限公司藥敏紙片抑菌圈標準，確定致病菌株對藥物的敏感程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

2016年1—2月湖南安化網(wǎng)箱養(yǎng)殖斑點叉尾鮰出現(xiàn)大規(guī)模暴發(fā)性持續(xù)性死亡，發(fā)病魚體主要集中在體重為1.5～2.0 kg的斑點叉尾鮰，發(fā)病迅速，發(fā)病死亡率很高，發(fā)病水溫在5～15 ℃。經(jīng)調(diào)查，斑點叉尾鮰養(yǎng)殖區(qū)域養(yǎng)殖用水未受到大規(guī)模污染，養(yǎng)殖水質(zhì)狀況符合漁業(yè)用水標準。通過對患病瀕死斑點叉尾鮰臨床診斷，發(fā)現(xiàn)該病的典型癥狀為發(fā)病初期病魚表現(xiàn)為行動遲緩，體質(zhì)瘦弱；體表胸鰭及頭部有明顯的出血癥狀，解剖發(fā)現(xiàn)組織器官有不同病變及充血，尤其是腎及脾嚴重充血等，腹腔有大量腹水；腸道多黏液，腸壁薄而發(fā)紅，有出血癥狀。鏡檢沒有發(fā)現(xiàn)寄生蟲等感染。

2.2 病原分離純化

選取具備典型癥狀瀕死斑點叉尾鮰，解剖后對肝、腎和脾進行無菌接種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在肝腎脾上均分離到一株優(yōu)勢菌，菌落在普通營養(yǎng)瓊脂上形態(tài)特征為灰白色、圓形、表面光滑、邊緣整齊，直徑為0.3～0.8 mm；優(yōu)勢菌株在腦心浸出液瓊脂上形成透明白色、圓形、表面光滑、邊緣整齊，直徑為0.4～0.9 mm的菌落。對該菌株挑取單一菌落于營養(yǎng)瓊脂上進一步分離純化，獲得純培養(yǎng)的菌株，暫命名為AH02。

2.3 回歸感染

調(diào)節(jié)AH02菌液濃度為5.9×107CFU/mL后，人工攻毒感染斑點叉尾鮰，發(fā)現(xiàn)感染后斑點叉尾鮰在7 d內(nèi)全部死亡。發(fā)病和死亡魚體表現(xiàn)出與自然發(fā)病相似的癥狀，如重要組織器官病變及出血，腹腔有大量腹水等，而對照無異常情況。對人工回歸感染瀕死的病魚體再次分離菌種，得到與菌株AH02形態(tài)特征一致的菌株，再分離菌株經(jīng)后續(xù)鑒定顯示與及菌株AH02為同一種。經(jīng)人工回歸感染實驗，表明分離菌株AH02對斑點叉尾鮰具有很強的致病性。

2.4 病原菌主要生理生化特征

分離菌株AH02為革蘭氏陰性桿菌，具有運動性，吲哚實驗為陰性，生理生化特征見表1，菌株AH02生理生化特征與魯氏耶爾森氏菌Yersiniaruckeri基本一致。

表1 AH02菌株的生理生化特征

Tab. 1 Physiological and biochemical characteristics of strain AH02

測定項目TestitemAH02Y.ruckeri吲哚Indoletest--甲基紅Methylred++V-P試驗Voges-Proskauertest--硫化氫H2S--明膠液化Gelatinliquefaction+d運動性Motility++尿素Urea--賴氨酸Lysine-(+)精氨酸Arginine--鳥氨酸Ornithine++檸檬酸鹽Citrate--七葉苷Esculoside--丙二酸Malonicacid--木糖Xylose--麥芽糖Maltose++阿拉伯糖Arabinose--海藻糖Trehalose++果糖Fructose-+蔗糖Sucrose--棉子糖Raffinose--纖維二糖Cellobiose--鼠李糖Rhamnose--肌醇Inositol--山梨醇Sorbitol+-甘露醇Mannitol++D-阿東醇D-adonitol--蜜二糖Melibiose--水楊苷Salicin--乳糖Lactose--D-葡萄糖產(chǎn)氣D-glucoseaerogenesis-(-)D-葡萄糖產(chǎn)酸D-glucoseacidproductionproduction++

注：“+”示陽性；“-”示陰性；“(+)”示陽性反應(yīng)超過24 h； “(-)”示陰性反應(yīng)超過24 h； “d”示11%～89%菌株為陽性。

2.5 分離菌株16S rDNA基因部分序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹的建立

通過提取分離純化得到的菌株DNA，以其為PCR模板擴增16S rDNA基因。經(jīng)測序后在NCBI中進行比對分析，分離菌株AH02的16S rDNA基因與魯氏耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri；登錄號：FJ908709.1，HQ222844.1，KJ606914.1，LAB681666.1)同源性為99%。選取GenBank中部分魯氏耶爾森氏菌和常見腸桿菌的16S rDNA基因序列，利用Neighbor-Joining 方法進行系統(tǒng)發(fā)育學分析，結(jié)果顯示分離菌株AH02均與魯氏耶爾森氏菌聚為一簇(圖1)。

2.6 藥敏實驗

實驗測定了分離菌株AH02對14種抗生素的敏感性(表2)。結(jié)果顯示，菌株AH02對氟苯尼考、新霉素、多西環(huán)素、左氧氟沙星、鏈霉素、妥布霉素、慶大霉素及丁胺卡那霉素高度敏感；對頭孢拉定、阿奇霉素中度敏感；對苯唑西林、磺胺異噁唑、克林霉素及利福平不敏感。

3 討論

魯氏耶爾森氏菌隸屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)，該菌主要引起鮭鱒等冷水性魚類暴發(fā)紅嘴病[8-9]，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，魯氏耶爾森氏菌已經(jīng)成為中國淡水魚類突發(fā)性出血病主要病原之一，其主要癥狀表現(xiàn)為魚體表有出血，重要組織器官嚴重充血出血具有腹水，從而常導致大量死亡[10]。國內(nèi)已經(jīng)報道鰱、鳙[11]、鱘[12-13]等感染魯氏耶爾森氏菌發(fā)病。本研究在湖南安化診斷的斑點叉尾鮰病害與此類似，而通過病原鑒定及人工回歸感染也確定了該病的病原菌為魯氏耶爾森氏菌。本研究開展魯氏耶爾森氏菌抗生素敏感性研究，結(jié)果顯示其對氟苯尼考、新霉素、多西環(huán)素、左氧氟沙星、鏈霉素、妥布霉素、慶大霉素及丁胺卡那霉素高度敏感。藥敏實驗與楊移斌等[13]分離的鱘魯氏耶爾森氏菌HD0923對多西環(huán)素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、鏈霉素、左氧氟沙星、慶大霉素等藥物高度敏感的結(jié)果一致，故在斑點叉尾鮰養(yǎng)殖生產(chǎn)上可選擇水產(chǎn)常用抗生素如多西環(huán)素、氟苯尼考等進行治療。但一般魚類病原耐藥性存在嚴重的地區(qū)性，建議采用抗生素治療時先做藥敏實驗，以達到較好的治療效果。本研究中魯氏耶爾森氏菌AH02對一些常用抗生素產(chǎn)生了較強耐藥性，這說明在斑點叉尾鮰養(yǎng)殖過程中病害防控措施需進一步改進。雖然目前藥物治療仍然是防治病害的主要手段，但嘗試新的措施亦未嘗不可，如注射疫苗法或者藥物與生態(tài)防治結(jié)合法等。

圖1 根據(jù)菌株AH02 16S rDNA基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence homolog of strain AH02

藥物Drug菌圈直徑判斷標準/mmJudgmentstandardofinhibitionzonediameter不敏感Resistant中度敏感Mediumsensitivity高度敏感Highlysensitive藥物含量/(μg·片-1)Dose抑菌圈直徑/mmInhibitionzonediameter敏感性Sensitivity苯唑西林Oxacillin≤1011～12≥1310不敏感頭孢拉定Cefadroxil≤1415～17≥183017中度敏感磺胺異噁唑Sulfisoxazole≤1213～16≥173000不敏感氟苯尼考Florfenicol≤1213～17≥187530高度敏感克林霉素Clindamycin≤1415～20≥2120不敏感利福平Rifampicin≤1617～19≥2050不敏感阿奇霉素Azithromycin≤1314～17≥181515中度敏感新霉素Neomycin≤1213～16≥173025高度敏感多西環(huán)素Doxycycline≤1213～15≥163024高度敏感左氧氟沙星Levofloxacin≤1314～16≥17530高度敏感鏈霉素Streptomycin≤1112～14≥151017高度敏感妥布霉素Tobramycin≤1213～14≥151020高度敏感慶大霉素Gentamicin≤1213～14≥151026高度敏感丁胺卡那霉素Amikacin≤1415～16≥173025高度敏感

本研究中斑點叉尾鮰發(fā)病時期處在冬天，水溫在5～15 ℃，而此時斑點叉尾鮰已經(jīng)停食，體質(zhì)相對較弱，而此時魯氏耶爾森氏菌卻活力較強，并能分泌較多毒素[6]，導致病害的大規(guī)模暴發(fā)。而在整個發(fā)病期間由于鮰不吃食，故只能通過外部消毒進行處理，而無法伴餌投喂，導致持續(xù)性死亡，引起較大經(jīng)濟損失。這個病例說明，在高密度養(yǎng)殖模式下，病害頻發(fā)的同時病原特性正在發(fā)生變化，一是病原種類的多樣化，二是病原的致病條件范圍進一步擴大。為確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全，建議嚴格控制抗生素類藥物的使用，加強魚類病害預(yù)防措施的研發(fā)，探討新的科學養(yǎng)殖模式，實現(xiàn)水產(chǎn)健康養(yǎng)殖，保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全。

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Isolation and identification of pathogenic bacterium from Ictalurus punctatus

YANG Yibin1,2, LIU Tianqiang3,YANG Tao3, XU Ning1,2, DONG Jing1,2, YANG Qiuhong1,2, LIU Yongtao1,2, AI Xiaohui1,2*

(1.Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223, China;2. Hu Bei Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center, Wuhan 430223, China;3. Animal Health Research Institute,Tongwei Co., LTD, Chengdu 610041, China)

In January—February 2016, a massive death ofIctaluruspunctatusby cage culture outbroke in Anhua region of Hunan province, and it was caused nearly 80% mortality rate, the body weight of onset fish being 1.5 ～ 2.0 kg. A predominant bacterium was isolated from the liver, spleen, and kidney of the infectedIctaluruspunctatusduring the disease outbreak period. The bacterium was identified by common biochemical tests and molecular biology experiments. And artificial infection tests and antibiotic sensitivity tests were also performed. Results showed that the physiological and biochemical characteristics of the bacterium were coincident well withYersiniaruckeri, and its 16S rDNA gene sequences had more than 99% homology toYersiniaruckeri, indicating that it belonged toYersiniaruckerifamily by phylogenetic analysis in NCBI. In addition, the artificially infectedIctaluruspunctatusexhibited similar clinical signs with the naturally infected cases, and the bacterium was able to be re-isolated from theIctaluruspunctatus. It showed thatYersiniaruckeriwas the pathogen for theIctaluruspunctatusdisease. The isolated bacterium was sensitive to florfenicol, doxycycline, neomycin and some other drugs. This study provided theoretical basis for the prevention and control of the explosive hemorrhagic disease ofIctaluruspunctatus. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(6):53-58]

Ictaluruspunctatus;Yersiniaruckeri; 16S rDNA; disease prevention and control；identification

AI Xiaohui, aixh@yfi.ac.cn

2016-06-24；接收日期：2016-08-24

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203085)；通威合作項目(TWAH20150615)

楊移斌(1988-)，男，實習研究員，研究方向為水生動物病害臨床診斷及其防控技術(shù)，yangyb1988@126.com 通信作者：艾曉輝，研究員，研究方向為水產(chǎn)品質(zhì)量安全，aixh@yfi.ac.cn

S94

A

2095-1833(2016)06-0053-06