枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究進(jìn)展

蘇艷莉，孫盛明，朱健，謝駿，戈賢平

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510380；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214081；3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇 無(wú)錫 214081)

枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究進(jìn)展

蘇艷莉1，2，孫盛明3，朱健3，謝駿1，戈賢平2*

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510380；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214081；3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇 無(wú)錫 214081)

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是革蘭氏陽(yáng)性菌，主要以芽孢形態(tài)存在，穩(wěn)定性和抗逆性強(qiáng)，抗菌性能好，其作為綠色免疫增強(qiáng)劑之一可部分替代抗生素，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中適量使用枯草芽孢桿菌已成為一種健康養(yǎng)殖方式。枯草芽孢桿菌通過(guò)發(fā)揮自身營(yíng)養(yǎng)功效、分泌抑菌物質(zhì)等方式調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)微生態(tài)平衡、提高免疫力和抗病力，從而促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)、減少病害發(fā)生以及改善養(yǎng)殖環(huán)境。本文綜述了枯草芽孢桿菌的特性、作用機(jī)理、適宜添加量以及使用方式和現(xiàn)狀，并進(jìn)一步展望未來(lái)的研究方向，使其應(yīng)用更加廣泛，促進(jìn)中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康發(fā)展。[中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2016,6(6):32-39]

枯草芽孢桿菌；水產(chǎn)養(yǎng)殖；水質(zhì)；免疫調(diào)節(jié)；適宜添加量；作用機(jī)理

從20世紀(jì)70年代開(kāi)始，中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化、規(guī)模化的養(yǎng)殖模式日趨成熟，人們對(duì)水產(chǎn)品的需求量以每年8.9%～9.1%的速度增長(zhǎng)；高密度、大容量、頻繁投餌的養(yǎng)殖方式使養(yǎng)殖水體環(huán)境日益惡化，水中及池底有機(jī)物沉積，溶解氧減少，氨氮、磷酸鹽等有害物質(zhì)增多，水體微生態(tài)平衡被打破，影響魚(yú)類(lèi)正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致病害頻發(fā)，嚴(yán)重時(shí)造成大量死亡，損失巨大[1-3]。然而養(yǎng)殖過(guò)程中過(guò)量且頻繁使用抗生素，雖然能有效控制某些疾病的發(fā)生，但會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)菌群失調(diào)，并讓有害微生物產(chǎn)生耐藥性，造成水產(chǎn)品藥物殘留，通過(guò)食物鏈間接對(duì)人體健康產(chǎn)生威脅，因此人們迫切地希望能夠找到抗生素的替代品來(lái)抑制病原菌，減少病害的發(fā)生，增大養(yǎng)殖效益[4-5]。

益生菌，最早是在1974年由Parker[6]定義為“有助于腸道微生物平衡的生物和物質(zhì)”，1988年Fuller[7]將其修改為“通過(guò)改善腸道微生物平衡，有益地影響宿主動(dòng)物的活的微生物飼料添加劑”，該定義比較科學(xué)且應(yīng)用最廣。1986年，Kozasa[8]首次將益生菌概念引入水產(chǎn)養(yǎng)殖中，把分離出的東洋芽孢桿菌(Bacillustoyoi)作用于感染了愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella)的日本鰻鱺(Anguillajaponica)，發(fā)現(xiàn)死亡率有所下降。此后，益生菌的概念在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到較快發(fā)展，即為能夠順利進(jìn)入養(yǎng)殖動(dòng)物腸道并黏附于腸道壁，提高動(dòng)物健康水平，對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生益生作用的一類(lèi)活的微生物培養(yǎng)物。因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用益生菌的研究隨著環(huán)境友好型可持續(xù)養(yǎng)殖模式的推廣而越來(lái)越多，該研究為發(fā)展健康綠色的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)提供了一定的理論依據(jù)[9-11]。

芽孢桿菌是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)最早的細(xì)菌之一，而枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是最常用、最具特色的一類(lèi)芽孢桿菌，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用研究比較多，該菌對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物和人無(wú)病原性、毒性及毒副作用，易于生產(chǎn)和保存。楊鋒等[12]將篩選分離出的枯草芽孢桿菌經(jīng)過(guò)90 ℃水浴、6 h人工胃液浸潤(rùn)以及4 h豬膽液處理后，發(fā)現(xiàn)其存活率都接近于80%，甚至高達(dá)90%，說(shuō)明該菌穩(wěn)定性好，抗逆性極強(qiáng)。目前國(guó)內(nèi)外已有枯草芽孢桿菌的菌種分離鑒定、生產(chǎn)方式、加工工藝、作用機(jī)理以及分子遺傳學(xué)等方面[13-14]的研究報(bào)道，本文對(duì)枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用以及相應(yīng)的作用機(jī)理進(jìn)行分析總結(jié)，以期為在水產(chǎn)養(yǎng)殖中更好地使用枯草芽孢桿菌提供參考。

1 枯草芽孢桿菌的特性

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，又稱枯草桿菌，隸屬于桿菌綱(Bacilli)，芽孢桿菌目(Bacillales)，芽孢桿菌科(Bacillaceae)，是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，能產(chǎn)生芽孢，營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，繁殖快，競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)強(qiáng)，通常存在于空氣、水、灰塵、土壤和沉積物中[15-16]。枯草芽孢桿菌作為一種益生菌具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)耐酸堿、耐高溫、耐擠壓，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，在飼料制粒過(guò)程中以及在腸道酸性環(huán)境中都比較穩(wěn)定；2)耐干燥，方便保存和運(yùn)輸，孢子的存在形式極大地減少了對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分的消耗，保證飼料品質(zhì)；3)無(wú)毒、無(wú)污染、無(wú)殘留，安全性高；4)生境多樣，可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類(lèi)豐富，這決定了其具有極強(qiáng)的分泌功能，能分泌多種酶類(lèi)(如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等)及營(yíng)養(yǎng)代謝產(chǎn)物(如多種氨基酸和維生素類(lèi)物質(zhì)等)[17-18]。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，枯草芽孢桿菌一般分為兩種用途：一種是作為飼料添加劑，與多數(shù)微生物飼料添加劑作用一致，具有促生長(zhǎng)、改善腸道菌群組成、免疫調(diào)節(jié)等功能；另一種是微生物調(diào)控劑，用于改善水質(zhì)，抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖，創(chuàng)造優(yōu)良的水生生態(tài)環(huán)境[19-20]。劉青等[21]以枯草芽孢桿菌為主，搭配其他益生菌混合使用，對(duì)有機(jī)質(zhì)進(jìn)行分解，并達(dá)到凈化水質(zhì)、修復(fù)水體的效果。Wang[22]在凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)的飼料中添加光合細(xì)菌和枯草芽孢桿菌后，發(fā)現(xiàn)蝦體內(nèi)消化酶活性顯著提高，從而促進(jìn)其生長(zhǎng)。朱學(xué)芝等[23]和謝佳磊等[24]同樣在凡納濱對(duì)蝦和克氏原鰲蝦(Pro-cambarusclarkii)的飼料中添加枯草芽孢桿菌均發(fā)現(xiàn)其血清酶氧化酶(PO)活性顯著升高，并且凡納濱對(duì)蝦血清酸性磷酸酶活性也顯著提高；夏耘等[25]用含1.0×1010cfu/g枯草芽孢桿菌的飼料飼喂花鱸(Lateolabraxjaponicus)20 d后，發(fā)現(xiàn)其組織中過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶以及血清溶菌酶活性顯著提高，說(shuō)明枯草芽孢桿菌通過(guò)作用于動(dòng)物體內(nèi)相關(guān)酶類(lèi)或免疫因子來(lái)顯著增強(qiáng)機(jī)體抗氧化及免疫能力。

2 枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用及作用機(jī)理

2.1 凈化養(yǎng)殖水體，改善養(yǎng)殖環(huán)境

由于高密度養(yǎng)殖、餌料殘余，以及養(yǎng)殖時(shí)間長(zhǎng)，池底動(dòng)物殘骸和糞便沉積，導(dǎo)致有機(jī)物質(zhì)增多，水質(zhì)惡化，氨氮和亞硝酸氮等有害營(yíng)養(yǎng)鹽不斷增加，影響?zhàn)B殖動(dòng)物的健康生長(zhǎng)?？莶菅挎邨U菌改善水質(zhì)的作用機(jī)理為：該菌能快速定植于水體中，通過(guò)位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)或營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)排斥有害病菌的生長(zhǎng)繁殖，形成優(yōu)勢(shì)菌群，從而改變水體和底泥的微生物組成和結(jié)構(gòu)[19]；或直接分泌細(xì)菌素等活性物質(zhì)抑制或殺死病原菌，以達(dá)到改善水質(zhì)的目的[26]。當(dāng)然枯草芽孢桿菌還能通過(guò)分泌各種胞外酶和活性物質(zhì)，快速分解池中有機(jī)物，為單細(xì)胞藻類(lèi)生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng)素；同時(shí)藻類(lèi)通過(guò)光合作用又能產(chǎn)生溶解氧，供有機(jī)物分解以及水中微生物和動(dòng)物的呼吸消耗，因此形成一個(gè)穩(wěn)定的生態(tài)循環(huán)，有效改善并維持良好的水生生態(tài)環(huán)境[27]。鄒文娟等[28]在污水處理中同時(shí)使用光合細(xì)菌(Photosyntheticbacteria)和枯草芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)混合菌的處理效果要優(yōu)于單個(gè)細(xì)菌，其中亞硝酸鹽氮、氨氮、活性磷酸鹽和CODMn的去除率分別是71.96%、86.13%、87.08%和58.73%。杭小英等[29]在羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)養(yǎng)殖池塘中投用枯草芽孢桿菌制劑后，水體中氨氮、亞硝酸態(tài)氮的最大降解率分別為59.61%和86.70%，說(shuō)明枯草芽孢桿菌確實(shí)能夠有效改善養(yǎng)殖水質(zhì)，降低有害有機(jī)物濃度。

2.2 促進(jìn)消化吸收，提高生長(zhǎng)性能

枯草芽孢桿菌具有極強(qiáng)的分泌功能，能夠產(chǎn)生多種胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等活性物質(zhì)，在動(dòng)物腸道酸性條件下具有很好的穩(wěn)定性，能夠協(xié)助機(jī)體消化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)飼料中營(yíng)養(yǎng)素的降解，提高飼料利用率[30]。邱燕等[31]研究得出飼料中添加枯草芽孢桿菌能夠提高草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)的特定生長(zhǎng)率、降低餌料系數(shù)，促進(jìn)草魚(yú)對(duì)飼料的吸收利用。江永明等[32]在34.5 g的奧尼羅非魚(yú)(O.niloticus×O.aureus)飼料中添加3.0×108cfu/g枯草芽孢桿菌投喂56 d后，魚(yú)體增重率顯著高于對(duì)照組。沈斌乾等[33]用枯草芽孢桿菌投喂青魚(yú)(Mylopharyngdonpiceus)，發(fā)現(xiàn)腸蛋白酶活性增加，并隨著飼料中枯草芽孢桿菌添加量的增加而顯著上升，添加量達(dá)到2×107cfu/g后，活性繼續(xù)增加但不顯著，說(shuō)明達(dá)到一定閾值后，枯草芽孢桿菌的作用可能達(dá)到了飽和。

枯草芽孢桿菌的促生長(zhǎng)作用機(jī)理還包括：其菌體自身具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富有不飽和脂肪酸、細(xì)菌多糖及各種輔酶，具有調(diào)節(jié)魚(yú)體微生態(tài)平衡的作用。同時(shí)還能夠合成VB、VC、VE、VK等維生素及氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，參與新陳代謝，可促進(jìn)機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)、鐵、鈣等的消化吸收，從而加快生長(zhǎng)速度[34]。仇明等[34]研究發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)叉尾鮰(Letaluruspunetaus)魚(yú)種的腸體比隨飼料中枯草芽孢桿菌添加量的增加而呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明飼料中添加枯草芽孢桿菌可能會(huì)促進(jìn)腸道發(fā)育，增加腸壁厚度及腸黏膜高度，使腸絨毛更密，改善腸黏膜形態(tài)，增大腸道與營(yíng)養(yǎng)物的接觸面積，從而促進(jìn)消化道對(duì)飼料的吸收利用，提高飼料效率[31,35]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖中養(yǎng)殖品種在各個(gè)生長(zhǎng)階段，其腸道環(huán)境因時(shí)而異，對(duì)菌種以及添加量的要求也有所不同，同時(shí)養(yǎng)殖水體環(huán)境的差異也會(huì)導(dǎo)致用量和效果的差異(表1)。因此，如果在時(shí)間和對(duì)象上盲目使用，菌種就不能充分發(fā)揮預(yù)期效果。根據(jù)養(yǎng)殖動(dòng)物不同品種、規(guī)格大小、生長(zhǎng)階段以及環(huán)境因素等差異，確定制劑的用量，使益生菌能夠更好地應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際[20]。

表1 目前可參考的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)飼料中枯草芽孢桿菌的適宜需求量的研究結(jié)果

Tab.1 Dietary of suitable demand ofBacillussubtilisin aquaculture animals based on references at present

水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物Aquacultureanimals適宜需求量/(cfu·g-1)Suitabledemand參考文獻(xiàn)Reference青魚(yú)(Mylopharyngdonpiceus)2.0×107～5.0×108沈斌乾等[33]卵形鯧鯵(Trachinotusovatus)5.62×107Zhangetal.[36]黃河鯉(CyprinuscarpioHuanghevar.)3.0×107～4.5×107殷海成等[37]團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)2.0×107孫盛明等[38]大菱鲆(Scophthalmusmaximus)1.0×107胡凡光等[39]吉富羅非魚(yú)(GIFT,Oreochromisnilotic-us)2.82×107程遠(yuǎn)等[30]尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)5.0×106～1.0×107Tellietal.[40]、Alyetal.[41]大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)1.35×107Aietal.[42]軍曹魚(yú)(Rachycentroncanadum)1.0×107Gengetal.[43]羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)3.0×106cSeenivasanetal.[44]凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)1.0×105(BM5)、1.0×108(BM8);6.0×106～6.0×107Zokaeifaretal.[45];丁賢等[46]克氏原鰲蝦(Pro-cambarusclarkii)1.0×106～5.0×106謝佳磊等[24]

2.3 對(duì)腸道菌落數(shù)目及組成的影響

動(dòng)物腸道不僅是消化器官，同時(shí)也是防御外界病原菌(由食物帶入)的第一道防線，因此保持腸的完整性對(duì)正常營(yíng)養(yǎng)吸收和機(jī)體防御是至關(guān)重要的[35,47]。事實(shí)上，腸道內(nèi)有多種細(xì)菌菌群共存，相互影響相互作用，維持穩(wěn)態(tài)，機(jī)體才能夠健康無(wú)病?？莶菅挎邨U菌是一種常見(jiàn)的好氧益生菌，在腸道內(nèi)定植后會(huì)迅速消耗游離氧，造成厭氧環(huán)境，促進(jìn)乳酸桿菌等有益厭氧菌的生長(zhǎng)，從而降低腸道pH，間接抑制了其他病原菌的生長(zhǎng)繁殖[18]?；蛘呤歉?jìng)爭(zhēng)性抑制，益生菌首先黏附于腸道黏膜表面，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)生存空間、附著位點(diǎn)、營(yíng)養(yǎng)素等，阻止病原菌的生長(zhǎng)繁殖，改善腸道菌群組成，減少腸道內(nèi)致病問(wèn)題[44,48]。李衛(wèi)芬等[48]研究草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)腸道菌群結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)現(xiàn)添加枯草芽孢桿菌處理組中腸道芽孢桿菌和假單胞菌數(shù)量極顯著增加，而致病性弧菌和大腸桿菌數(shù)量卻極顯著減少，說(shuō)明枯草芽孢桿菌有效改善了草魚(yú)腸道菌群組成。孫盛明等[38]分析枯草芽孢桿菌對(duì)團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)腸道菌群結(jié)構(gòu)時(shí)利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)對(duì)腸道菌群進(jìn)行分離及后續(xù)克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)飼料中添加枯草芽孢桿菌降低了腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性，表明團(tuán)頭魴攝食了含枯草芽孢桿菌的飼料后腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。沈錦玉等[49]在飼料中添加枯草芽孢桿菌B115，發(fā)現(xiàn)翹嘴紅鲌(Erythroculterilishaeformis)、銀鯽(Carassiusauratusgibelio)、日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)腸道內(nèi)的有益菌群(如乳酸菌和雙歧桿菌)顯著增加。

2.4 對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物免疫力和抗病力的影響

魚(yú)類(lèi)體內(nèi)本身就有多種免疫因子，如溶菌酶、補(bǔ)體、堿性磷酸酶等，能有效抵御外來(lái)病原菌，其活力大小反映了抵御能力的大小，同時(shí)也反映出免疫功能的強(qiáng)弱(表2)?？莶菅挎邨U菌增強(qiáng)免疫功能的作用機(jī)理之一：在動(dòng)物腸道內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)性抑制其他有害菌的生存與繁殖，有利于有益菌的生長(zhǎng)，腸道菌群結(jié)構(gòu)得到改善與優(yōu)化，從而間接提高了動(dòng)物免疫力。另外其細(xì)胞壁的主要成分為葡聚糖，能發(fā)揮免疫刺激物的作用[37]，有效提高干擾素和巨噬細(xì)胞的活性，刺激動(dòng)物胸腺和脾等免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育，通過(guò)提高免疫球蛋白和抗體水平來(lái)刺激免疫，提高T、B淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的反應(yīng)性，激發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫，提高群體免疫力[20,51,55]，說(shuō)明腸道內(nèi)的正常菌群是機(jī)體免疫屏障，對(duì)入侵微生物具有巨大的拮抗作用，枯草芽孢桿菌是通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡以及發(fā)揮免疫活性等作用來(lái)刺激黏膜和全身免疫系統(tǒng)的發(fā)育從而提高機(jī)體免疫能力。

枯草芽孢桿菌增強(qiáng)免疫功能的作用機(jī)理之二：枯草芽孢桿菌分泌抗菌物質(zhì)(細(xì)菌素、過(guò)氧化氫、有機(jī)酸等)，有效降低腸道pH，增加過(guò)氧化氫濃度，可以不同程度地抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖或殺死周?chē)渌惙N有害菌群，同時(shí)反過(guò)來(lái)與益生菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而保持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)，提高機(jī)體抗病能力[30,51]。細(xì)菌素可能是益生菌與其他菌種競(jìng)爭(zhēng)而釋放的抑菌物質(zhì)，也被稱為抗菌肽，也有可能是其自身的代謝物質(zhì)，或兩種情況都有可能。這類(lèi)抗菌肽一般都帶有正電荷，少于50個(gè)氨基酸殘基，含有兩性區(qū)或疏水區(qū)；而通常情況下，病原菌的細(xì)胞膜都富含磷脂，細(xì)胞壁呈現(xiàn)酸性，因此帶正電荷且含有兩性區(qū)或疏水區(qū)的細(xì)菌素能穿過(guò)靶細(xì)胞的細(xì)胞膜從而殺死靶細(xì)胞[15,56]。

枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的具體應(yīng)用與作用機(jī)理見(jiàn)圖1。

表2 目前可參考的飼料中枯草芽孢桿菌對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物免疫因子影響的研究結(jié)果

Tab.2 Effects of dietary ofBacillussubtilison immune factors in aquaculture animals based on references at present

水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物Aquacultureanimals免疫因子Immunefactor參考文獻(xiàn)Reference凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)酚氧化酶原、溶菌酶、絲氨酸蛋白酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶Liuetal.[4]刺參(Apostichopusjaponicus)抗菌物質(zhì)伏永傳[20]黃河鯉(CyprinuscarpioHuanghevar.)白細(xì)胞吞噬活性、血清抗體、溶菌酶殷海成等[37]金頭鯛(SparusaurataL.)白細(xì)胞介素、半胱天冬酶、環(huán)氧合酶Cerezuelaetal.[47]卡特拉魚(yú)(Catlacatla)溶菌酶、總蛋白、堿性磷酸酶Sangmaetal.[50]草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)血清補(bǔ)體C3、IgM陳南南[51]、沈文英等[52]黑鯛(Sparusmacrocephalus)肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、超氧化物歧化酶李盈鋒等[53]羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus×O.au-reus)堿性磷酸酶、抗菌活力、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血清補(bǔ)體C3、溶菌酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶程遠(yuǎn)等[30]、劉慧玲等[54]

圖1 枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用Fig.1 Applications of Bacillus subtilis in aquaculture

3 枯草芽孢桿菌的使用方式與存在問(wèn)題

枯草芽孢桿菌等益生菌在實(shí)踐生產(chǎn)中使用方式主要有：1)制備成含有大量益生菌的活菌制劑，混合于飼料中投喂養(yǎng)殖動(dòng)物；2)直接投放于養(yǎng)殖水體；3)通過(guò)餌料生物對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生影響；4)通過(guò)注射或浸浴產(chǎn)生效應(yīng)。然而上述益生菌的使用方法仍存在一些問(wèn)題。

益生菌無(wú)論在生產(chǎn)還是使用過(guò)程中都容易受到多個(gè)因素的影響。比如某些微生物在飼料制粒過(guò)程中易受損失活，導(dǎo)致使用效果不佳。解決方法之一是隨用隨配，在投喂之前混合益生菌和飼料，這樣可以一定程度上保證菌種的活性，但使用劑量還不是太清楚，且操作起來(lái)不方便。

將菌種直接投入養(yǎng)殖水體可保持其一定的活性，但在此之前水體中已形成穩(wěn)定的微生物群落，因此需要人為改變，定向培育優(yōu)勢(shì)菌群并發(fā)揮其作用，形成新的微生物動(dòng)態(tài)平衡。使用時(shí)，首先要根據(jù)水生環(huán)境選擇合適的菌種；其次，確保濃度與活菌數(shù)，只有達(dá)到一定數(shù)量才會(huì)有較好的效果，同時(shí)還要盡可能地營(yíng)造適合菌種的生長(zhǎng)環(huán)境，這樣才能快速發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)菌群，達(dá)到預(yù)期效果。

將菌種加入餌料生物的食物或養(yǎng)殖水體中，通過(guò)食用菌種將其帶入腸道，生存定植，有利于養(yǎng)殖動(dòng)物幼體的生長(zhǎng)發(fā)育。但是有益菌在餌料生物體內(nèi)的動(dòng)向暫不清楚，而且很難控制餌料生物攜帶的有益菌數(shù)量。

注射或浸浴法就是讓養(yǎng)殖動(dòng)物體與益生菌直接接觸，這樣便能夠快速激活動(dòng)物的免疫系統(tǒng)。但要想最大程度刺激機(jī)體的免疫機(jī)制，則需保證正確的濃度和劑量。不過(guò)同樣的問(wèn)題就是濃度、劑量和作用時(shí)間都很難控制，并且注射引起的機(jī)械受損會(huì)使病原菌乘機(jī)而入。

4 現(xiàn)狀與展望

枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用十分廣泛，但是在生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中仍存在一些問(wèn)題：1)在陸生動(dòng)物體內(nèi)使用較多，研究充足，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用中其分子作用機(jī)制仍然是不清楚的；2)水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用較多的益生菌并不是從水產(chǎn)動(dòng)物或生活環(huán)境中篩選出來(lái)，而是來(lái)自某些陸生動(dòng)物，這就造成益生菌株無(wú)法定殖或不穩(wěn)定、效果較差；3)目前劑型單一，同時(shí)缺乏理論指導(dǎo)，無(wú)法滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖的多樣化需求；4)由于養(yǎng)殖動(dòng)物的品種不一、各個(gè)生長(zhǎng)階段的營(yíng)養(yǎng)需求及適應(yīng)條件不同、水環(huán)境因素(pH、溶氧、水溫等)的影響以及其自身存在的缺陷等等，無(wú)法控制使用劑量與作用時(shí)間，最終都會(huì)導(dǎo)致效果不佳，達(dá)不到理想效果[20,51,55]。

綜上說(shuō)明，中國(guó)微生態(tài)制劑的研究還處于初級(jí)階段，仍然存在很多問(wèn)題有待進(jìn)一步解決。首先應(yīng)該加強(qiáng)相關(guān)的基礎(chǔ)研究，弄清楚枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的分子作用機(jī)理，使得之后的生產(chǎn)實(shí)踐都有理可依；其次可以研究制劑的生產(chǎn)，優(yōu)化加工工藝，并且確保制劑能夠長(zhǎng)期高效保存；針對(duì)不同品種、規(guī)格的養(yǎng)殖動(dòng)物以及養(yǎng)殖環(huán)境，可以確定不同的用量和作用時(shí)間，加強(qiáng)高效性和專一性；同時(shí)要明白單一依靠某種菌種達(dá)到凈化水質(zhì)，且又要求對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生有益效應(yīng)，這一點(diǎn)在實(shí)際應(yīng)用中是很難實(shí)現(xiàn)的，故此需要綜合利用不同菌種的協(xié)同作用，互相影響互相補(bǔ)充，才能達(dá)到最佳效果[45,50,57]?？莶菅挎邨U菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的研究與發(fā)展具有極其廣闊的前景，需要進(jìn)一步地去探索與研究，將這些問(wèn)題一一解決，使其應(yīng)用越來(lái)越廣泛，以帶來(lái)更大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，并促進(jìn)中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康發(fā)展。

[1] 劉衛(wèi)東, 蘇浩, 鄧立康. 微生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2001, 20(2): 28-31.

[2] 陳永青, 林亮, 楊鶯鶯, 等. 微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J]. 生態(tài)科學(xué), 2005, 24(1): 80-83.

[3] 劉忠穎, 劉洋, 鮑相渤, 等. 水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌的研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2010, 29(8): 501-504.

[4] Liu K F, Chiu C H, Shiu Y L, et al. Effects of the probiotic,BacillussubtilisE20, on the survival, development, stress tolerance, and immune status of white shrimp,Litopenaeusvannameilarvae [J]. Fish Shellfish Immun, 2010, 28(5/6): 837-844.

[5] Santos L, Ramos F. Analytical strategies for the detection and quantification of antibiotic residues in aquaculture fishes: A review [J]. Trends Food Sci Tech, 2016, 52(3): 16-30.

[6] Parker R B. Probiotics, the other half of the antibiotics story [J]. Anim Nutr Health, 1974, 29: 4-8.

[7] Fuller R. Probiotic in man and animals [J]. J Appl Bacterio, 1989, 66(5): 365-378.

[8] Kozasa M. Toyocerin (Bacillustoyoi) as growth promoter for animal feeding [J]. Microbiol Aliment Nutr, 1986, 4(2): 121-135.

[9] 俞勇, 李會(huì)榮, 李筠, 等. 益生菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2001, 8(2): 92-96.

[10] Dawood M A O, Koshio S. Recent advances in the role of probiotics and prebiotics in carp aquaculture: A review [J]. Aquaculture, 2016, 454(28): 243-251.

[11] Newaj-Fyzul A, Al-Harbi A H, Austin B. Review: Developments in the use of probiotics for disease control in aquaculture [J]. Aquaculture, 2014, 431(2): 1-11.

[12] 楊鋒, 章亭洲. 枯草芽孢桿菌生物學(xué)特性的研究[J]. 飼料研究, 2011(3): 38-40.

[13] Tseng D Y, Ho P L, Huang S Y, et al. Enhancement of immunity and disease resistance in the white shrimp,Litopenaeusvannamei, by the probiotic,BacillussubtilisE20 [J]. Fish Shellfish Immun, 2009, 26(2): 339-344.

[14] Guo X, Chen D D, Peng K S, et al. Identification and characterization ofBacillussubtilisfrom grass carp (Ctenopharynodonidellus) for use as probiotic additives in aquatic feed [J]. Fish Shellfish Immun, 2016, 52(3): 74-84.

[15] 王曉閣. 枯草芽孢桿菌研究進(jìn)展與展望[J]. 中山大學(xué)研究生學(xué)刊(自然科學(xué)版), 2012, 33(3): 14-23.

[16] 李明, 雙寶, 李海濤, 等. 枯草芽孢桿菌的研究與應(yīng)用[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 40(9): 111-114.

[17] 張小平. 枯草芽孢桿菌SC02和施氏假單胞菌F1M對(duì)草魚(yú)養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響及機(jī)理研究[D]. 杭州：浙江大學(xué), 2014.

[18] 惠明, 竇麗娜, 田青, 等. 枯草芽孢桿菌的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(27): 11623 -11624.

[19] 岳強(qiáng). 類(lèi)球紅細(xì)菌和枯草芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖水體的凈化作用[D]. 保定：河北大學(xué), 2012.

[20] 伏傳永. 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)對(duì)刺參腐皮綜合病致病菌的拮抗作用以及對(duì)水質(zhì)的影響[D]. 青島：中國(guó)海洋大學(xué), 2008.

[21] 劉青, 袁觀潔. 微生物凈水劑在流動(dòng)水體修復(fù)中的應(yīng)用[J]. 華中科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 25(1): 82-84.

[22] Wang Y B. Effect of probiotics on growth performance and digestive enzyme activity of the shrimpPenaeusvannamei[J]. Aquaculture, 2007, 269(1/2/3/4): 259-264.

[23] 朱學(xué)芝, 鄭石軒, 潘慶軍, 等. 芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫和生化指標(biāo)的影響[J]. 飼料研究, 2007(4): 56-59.

[24] 謝佳磊, 肖丹, 殷蝶, 等. 枯草芽孢桿菌對(duì)克氏原螯蝦免疫機(jī)能的影響[J].淡水漁業(yè), 2007, 37(6):24-27.

[25] 夏耘, 余德光, 郁二蒙, 等. 飼料中添加抗菌肽和枯草芽孢桿菌對(duì)花鱸生長(zhǎng)和非特異性免疫功能的影響[J]. 淡水漁業(yè), 2012, 42(1): 52-57.

[26] 邱寶生, 林煒鐵, 楊繼國(guó), 等. 益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2004, 23(7): 39-41.

[27] 張念海. 新型芽抱桿菌益生菌的富營(yíng)養(yǎng)化水體改良作用[D]. 廣州：暨南大學(xué), 2011.

[28] 鄒文娟, 許曉慧, 王國(guó)武, 等. 光合細(xì)菌和枯草芽孢桿菌在污水處理中的應(yīng)用[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 37(9): 199-201.

[29] 杭小英, 葉雪平, 施偉達(dá), 等. 枯草芽孢桿菌制劑對(duì)羅氏沼蝦養(yǎng)殖池塘水質(zhì)的影響[J]. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2008, 27(2): 197-200.

[30] 程遠(yuǎn), 黃凱, 黃秀蕓, 等. 飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)性能、免疫力和抗氧化功能的影響[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2014, 26(6): 1503-1512.

[31] 邱燕, 蔡春芳, 代小芳, 等. 枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能與腸道黏膜形態(tài)的影響[J]. 中國(guó)飼料, 2010(19): 34-36.

[32] 江永明, 付天璽, 張麗, 等. 微生物制劑對(duì)奧尼羅非魚(yú)生長(zhǎng)及消化酶活性的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2011, 35(6): 998-1004.

[33] 沈斌乾, 陳建明, 郭建林, 等. 飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)青魚(yú)生長(zhǎng)、消化酶活性和魚(yú)體組成的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2013, 37(1): 38-53.

[34] 仇明, 王愛(ài)民, 封功能, 等. 枯草芽孢桿菌對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰生長(zhǎng)性能及肌肉營(yíng)養(yǎng)成分影響[J]. 糧食與飼料工業(yè), 2010(7): 46-49.

[35] Cerezuela R, Fumanal M, Tapia-Paniagua S T, et al. Changes in intestinal morphology and microbiota caused by dietary administration of inulin andBacillussubtilisin gilthead sea bream (SparusaurataL.) specimens [J]. Fish Shellfish Immun, 2013, 34(5): 1063-1070.

[36] Zhang Q, Yu H, Tong T,et al. Dietary supplementation ofBacillussubtilisand fructooligosaccharide enhance the growth, non-specific immunity of juvenile ovate pompano,Trachinotusovatusand its disease resistance againstVibriovulnificus[J]. Fish Shellfish Immun, 2014, 38(1): 7-14.

[37] 殷海成, 趙紅月, 黃進(jìn), 等. 枯草芽孢桿菌對(duì)免疫和未免疫黃河鯉免疫功能和抗病力的影響[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2013, 25(7): 1559-1567.

[38] 孫盛明, 蘇艷莉, 張武肖, 等. 飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)團(tuán)頭魴幼魚(yú)生長(zhǎng)性能、肝臟抗氧化指標(biāo)、腸道菌群結(jié)構(gòu)和抗病力的影響[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2016, 28(2): 507-514.

[39] 胡凡光, 郭萍萍, 麻丹萍, 等. 飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)促進(jìn)大菱鲆生長(zhǎng)及養(yǎng)殖水環(huán)境的影響[J]. 漁業(yè)現(xiàn)代化, 2014, 41(2): 7-11.

[40] Telli G S, Ranzani-Paiva M J T, Carla Dias D,et al. Dietary administration ofBacillussubtilison hematology and non-specific immunity of Nile tilapiaOreochromisniloticusraised at different stocking densities [J]. Fish Shellfish Immun, 2014, 39(2): 305-311.

[41] Aly S M, Ahmed Y A G, Aharrrb A A A, et al. Studies onBacillussubtilisandLactobacillusacidophilus, as potential probiotics, on immune response and resistance of tilapia nilotica (Oreochriomisnilotics) to challenge infections [J]. Fish Shellfish Immun, 2008, 25(1/2):128-136.

[42] Ai Q H, Xu H T, Mai K S,et al. Effects of dietary supplementation ofBacillussubtilisand fructooligosaccharide on growth performance, survival, non-specific immune response and disease resistance of juvenile large yellow croaker,Larimichthyscrocea[J]. Aquaculture, 2011, 317(1): 155-161.

[43] Geng X, Dong X H, Tan B P,et al. Effects of dietary chitosan andBacillussubtilison the growth performance, non-specific immunity and disease resistance of cobia,Rachycentroncanadum[J]. Fish Shellfish Immun, 2011, 31(3): 400-406.

[44] Seenivasan C, Radhakrishnan S, Muralisankar T, et al.Bacillussubtilison survival, growth,biochemical constituents and energy utilization of the freshwater prawnMacrobrachiumrosenbergiipost larvae [J]. Egyp J Aquat Res, 2012, 38(3): 195-203.

[45] Zokaeifar H, Babaei N, Saad C R, et al. Administration ofBacillussubtilisstrains in the rearing water enhances the water quality, growth performance, immune response, and resistance againstVibrioharveyiinfection in juvenile white shrimp,Litopenaeusvannamei[J]. Fish Shellfish Immun, 2014, 36(1): 68-74.

[46] 丁賢, 李卓佳, 陳永青, 等. 芽孢桿菌對(duì)凡納對(duì)蝦生長(zhǎng)和消化酶活性的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2004, 11(6): 580-584.

[47] Cerezuela R, Meseguer J, ángeles Esteban M. Effects of dietary inulin,Bacillussubtilisand microalgae on in testinalgene expression in gilthead sea bream (SparusaurataL.) [J]. Fish Shellfish Immun, 2013, 34(3): 843-848.

[48] 李衛(wèi)芬, 沈濤, 陳南南, 等. 飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)消化酶活性和腸道菌群的影響[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 27(3): 221-225.

[49] 沈錦玉, 沈智華, 尹文林, 等. 飼喂枯草芽孢桿菌對(duì)銀鯽等水生動(dòng)物腸道菌群及消化酶活性的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2004, 28(B12): 146-150.

[50] Sangma T, Kami D. DietaryBacillussubtilisFPTB13 and chitin, single or combined, modulate systemic and cutaneous mucosal immunity and resistance of catla,Catlacatla(Hamilton) against edwardsiellosis [J]. Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2015, 43(9): 8-15.

[51] 陳南南. 餌料中添加芽抱桿菌對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)的影響及機(jī)理探討[D]. 杭州：浙江大學(xué), 2010.

[52] 沈文英, 李衛(wèi)芬, 梁權(quán), 等. 飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)性能、免疫和抗氧化功能的影響[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2011, 23(5): 881-886.

[53] 李盈鋒, 齊鑫, 華穎, 等. 枯草芽孢桿菌對(duì)黑鯛幼魚(yú)生長(zhǎng)、消化酶活性及抗氧化功能的影響[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2014, 35(1): 37-42.

[54] 劉慧玲, 黃翔鵠, 李長(zhǎng)玲, 等. 不同濃度的枯草芽孢桿菌對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)苗的養(yǎng)殖水體水質(zhì)及其抗病力的影響[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖, 2009, 30(10): 5-9.

[55] 曹海鵬. 抗嗜水氣單胞菌解淀粉芽孢桿菌的抗菌機(jī)理研究及其微膠囊制劑的安全性評(píng)價(jià)[D]. 上海海洋大學(xué), 2013.

[56] 李雄彪, 馬慶英, 崔云龍. 凝結(jié)芽孢桿菌抗菌作用機(jī)制[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2006, 18(1): 78-79.

[57] Hai N V. Research findings from the use of probiotics in tilapia aquaculture: A review [J]. Fish Shellfish Immun, 2015, 45(2): 592-597.

Advances of Bacillus subtilis application in aquaculture

SU Yanli1，2, SUN Shengming3, ZHU Jian3, XIE Jun1, GE Xianping2*

(1. Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fishery Resource Application & Cultivation, Ministry of Agriculture, Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences,Guangzhou 510380, China; 2. WuXi Fishery College, Nanjing Agricultural University, Wuxi 214081, China;3. Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China)

Bacillussubtilisis a gram-positive bacterium which is mainly presented the form of spores. It has the property of stability, strong resistance and good antimicrobial. As one of the green immunopotentiators,Bacillussubtiliscan partially replace antibiotics, which has become a healthy aquaculture mode. By itself nutritional effect and secreting antimicrobial substances,Bacillussubtiliscan regulate the micro-ecological balance in animals body, enhance animals immunity and disease resistance, and thus promote animals growth and reduce disease occurrence as well as improve cultural environment. This paper summarizedBacillussubtilischaracteristics and action mechanism, as well as the suitable addition amount and the usage mode in aquaculture. Then it illustrated the current situation and the future work in order to make it more widely applied in aquaculture, and promote the healthy development of aquaculture in China. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(6):32-39]

Bacillussubtilis; aquaculture; water quality; immune regulation; suitable dosage; mechanism

GE Xianping, gexp@ffrc.cn

2016-08-05；接收日期2016-09-20

國(guó)家大宗淡水魚(yú)類(lèi)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系華東養(yǎng)殖崗位(CARS-46-14)；十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAD25B07)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2015C06XK01)

蘇艷莉(1994-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖,13961676002@163.com 通信作者：戈賢平，研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料, gexp@ffrc.cn

S96

A

2095-1833(2016)06-0032-08