α-酸糖蛋白手性柱對(duì)56種手性化合物的拆分

張紫恒，楊 娜，胡 聰，杜 洋，袁黎明

(云南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650500)

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α-酸糖蛋白手性柱對(duì)56種手性化合物的拆分

張紫恒，楊 娜，胡 聰，杜 洋，袁黎明*

(云南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650500)

采用α-酸糖蛋白手性固定相(Chiral-AGP)，固定流動(dòng)相pH、流速，化合物樣品濃度，考察酸性、堿性、中性手性化合物和21個(gè)氨基酸在α-酸糖蛋白手性柱上的拆分情況.應(yīng)用高效液相色譜法，α-酸糖蛋白手性柱對(duì)上述手性樣品拆分，一共有8個(gè)中性化合物、3個(gè)堿性化合物、6個(gè)酸性化合物和5個(gè)氨基酸得到手性對(duì)映分離.探討了α-酸糖蛋白手性柱對(duì)酸性、中性、堿性樣品的拆分能力并進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果證明α-酸糖蛋白手性柱拆分中性化合物和酸性化合物效果最好，拆分堿性化合物和氨基酸效果不好，為α-酸糖蛋白手性柱適合于拆分哪一類型的手性化合物提供參考.

α-酸糖蛋白；手性拆分；液相色譜；手性化合物

手性(chirality)一詞，來(lái)源于希臘語(yǔ)中的“cheir”,是指物體與它的鏡像互不重疊的現(xiàn)象，是人類賴以存在的自然界的本質(zhì)屬性之一[1].目前最廣泛采用的手性分析技術(shù)是高效液相色譜(HPLC),其可分為手性固定相法、手性試劑衍生化法和手性流動(dòng)相添加劑法.手性固定相法因其簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn),已成為分析和分離對(duì)映體的最重要的方法[2-4].由于手性化合物存在著對(duì)映異構(gòu)分子之間具有不同的光學(xué)性能和生物活性，其拆分在藥學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域具有十分重要的意義[5].酸糖蛋白手性柱(Chiral-AGP)因其α-酸糖蛋白(AGP)是一種非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，它不但能耐高濃度的有機(jī)溶劑，也耐高溫以及較高或較低的pH，用途十分廣泛，是所有手性柱中應(yīng)用范圍最廣的，可以分離所有類型化合物，胺(伯、仲、叔、季胺)、酸(強(qiáng)和弱)、非光解質(zhì)(酰胺，酯，醇，亞砜等)[6-7].本研究通過(guò)考察不同種類的手性化合物應(yīng)用高效液相色譜在Chiral-AGP上的拆分效果，確定其在哪種類型的手性化合物上有更優(yōu)越的拆分效果，為使用Chiral-AGP的實(shí)驗(yàn)員提供更好的選擇.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

大連依利特液相色譜儀(伊利特分析儀器有限公司，大連)配有P230Ⅱ型高壓恒流泵和UV230Ⅱ型紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器，儀器控制和數(shù)據(jù)采集EC-2006液相色譜工作站，手性色譜柱酸糖蛋白手性柱(Chiral-AGP)購(gòu)于大賽璐有限公司；手性化合物和氨基酸購(gòu)于Fluka和Sigma公司，乙酸銨、乙酸均為分析純購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，甲醇、異丙醇為進(jìn)口色譜純?cè)噭溆嘣噭閲?guó)產(chǎn)分析純.

1.2 色譜條件

色譜柱:Chiral-AGP柱(150 mm×4.6 mm,性質(zhì)穩(wěn)定的α-酸糖蛋白牢固地鍵合到粒徑為5μm的球形硅膠上的手性固定相)；流動(dòng)相： 0.01 mol/L乙酸銨(pH=5.8)∶2-丙醇=95∶5(體積比，下同)，柱溫：室溫，流動(dòng)相流速：0.9 mL/min，壓力上線：140 kg/cm2，檢測(cè)波長(zhǎng)200、254 nm.流動(dòng)相使用前用0.45 μm濾膜過(guò)濾，并經(jīng)超聲波脫氣.以1,3,5三叔丁基苯為溶質(zhì)，測(cè)定死時(shí)間.

1.3 樣品和流動(dòng)相的制備

樣品制備：35種液相手性樣品溶于純色譜純甲醇，21種氨基酸溶于高純水，濃度均為1 g/L.

流動(dòng)相制備：首先配制0.01 mol/L乙酸銨，用乙酸調(diào)節(jié)其pH為5.8，再按照流動(dòng)相所需比例制備，使用前用0.45 μm濾膜過(guò)濾，然后超聲脫泡.

2 結(jié)果與討論

2.1 酸糖蛋白手性柱對(duì)中性手性化合物的拆分性能

手性柱：Chiral-AGP柱，0.01 mol/L乙酸銨緩沖液(pH=5.8)-異丙醇(95∶5)為流動(dòng)相，流速為0.9 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量5 μL，此條件下拆分15個(gè)中性手性化合物，其中有8個(gè)手性化合物得到了很好的拆分效果，分別是3號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、10號(hào)、13號(hào)、14號(hào).具體拆分結(jié)果見(jiàn)圖1及表1.

圖1 8個(gè)中性化合物在Chiral-AGP柱上的拆分譜圖

Table 1 Results of resolution for 15 neutral chiral compounds on Chiral-AGP column

序號(hào)中性手性化合物保留因子(κ'1)分離因子(α)分離度(Rs)1號(hào)氧氟沙星9.57--2號(hào)1-(9-蒽基)-2,2,2-三氟乙醇---3號(hào)1-(1-萘基)-乙醇4.651.562.194號(hào)1,1'-聯(lián)-2-萘酚---5號(hào)1,2-二苯基乙二醇0.801.491.616號(hào)聯(lián)糠醛0.321.551.077號(hào)1,2-二苯乙醇酮2.651.191.258號(hào)二氫黃酮12.231.451.089號(hào)反-1,2-二苯環(huán)氧乙烷9.85--10號(hào)特羅格爾堿4.481.440.6711號(hào)3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)甲苯酰胺4.07--12號(hào)華法林---13號(hào)吡喹酮3.201.230.7514號(hào)奧美拉唑0.80--15號(hào)1-對(duì)氯苯基-乙醇0.74--

2.2 酸糖蛋白手性柱對(duì)堿性手性化合物的拆分性能

色譜條件：同3.1.拆分12個(gè)堿性手性化合物，有3個(gè)手性化合物得到較好的拆分效果，分別是17號(hào)、21號(hào)和22號(hào).具體拆分結(jié)果見(jiàn)圖2及表2.

圖2 3個(gè)堿性化合物在Chiral-AGP柱上的拆分譜圖

表2Chiral-AGP柱對(duì)12個(gè)堿性手性化合物的拆分結(jié)果

Table2Chiral-AGPcolumnof11basicchiralcompoundssplitresults

序號(hào)堿性手性化合物保留因子(κ'1)分離因子(α)分離度(Rs)16號(hào)馬來(lái)酸氯苯那敏4.01--17號(hào)鹽酸普萘洛爾11.211.130.8418號(hào)阿替洛爾0.71--19號(hào)美托洛爾0.87--20號(hào)沙丁胺醇---21號(hào)氨氯地平18.231.200.5422號(hào)鹽酸克倫特羅3.141.392.1923號(hào)硫酸特布他林1.87--24號(hào)腎上腺素1.34--25號(hào)2-氨基-1-丁醇---26號(hào)四咪唑1.78--27號(hào)佐匹克隆---

2.3 酸糖蛋白手性柱對(duì)酸性手性化合物的拆分性能

色譜條件：同3.1.此條件下拆分8個(gè)酸性手性化合物，其中有6個(gè)手性化合物得到了很好的拆分效果，分別是28號(hào)、30號(hào)、31號(hào)、32號(hào)、33號(hào)和35號(hào).具體拆分結(jié)果見(jiàn)圖3及表3.

圖3 6個(gè)酸性化合物在Chiral-AGP柱上的拆分譜圖

Table 3 Resolution results of eight acidic chiral compounds on Chiral-AGP column

序號(hào)酸性手性化合物保留因子(κ'1)分離因子(α)分離度(Rs)28號(hào)DL-扁桃酸0.024.350.3929號(hào)DNB-亮氨酸0.30--30號(hào)布洛芬1.291.230.4231號(hào)酮洛芬2.931.371.0232號(hào)萘普生3.631.250.9533號(hào)氟比洛芬6.701.341.3834號(hào)西替利嗪12.34--35號(hào)馬來(lái)酸噻嗎咯爾0.0528.085.69

2.4 酸糖蛋白手性柱對(duì)氨基酸手性化合物的拆分性能

色譜條件：檢測(cè)波長(zhǎng)為200nm，其他條件同3.1.此條件下拆分21個(gè)氨基酸，其中有5個(gè)得到了一定的拆分效果，分別是谷氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和纈氨酸，具體拆分結(jié)果見(jiàn)圖4及表4.

圖4 5個(gè)氨基酸化合物在Chiral-AGP柱上的拆分譜圖

Table4Resolutionresultsof21aminoacidonChiral-AGPcolumn

氨基酸手性化合物保留因子(κ'1)分離因子(α)分離度(Rs)DL-丙氨酸0.0848.887.23DL-纈氨酸0.17--DL-亮氨酸0.03--DL-異亮氨酸0.02--DL-脯氨酸0.05--DL-苯丙氨酸0.04--DL-色氨酸0.50--DL-酪氨酸0.10--DL-對(duì)羥基苯甘氨酸0.24--DL-苯甘氨酸0.26--DL-絲氨酸0.059.41.21DL-蘇氨酸0.116.551.01DL-半胱氨酸0.26--DL-甲硫氨酸0.18--DL-天冬酰胺0.14--DL-谷酰胺0.082.750.61DL-天冬氨酸0.062.410.56DL-谷氨酸0.09--DL-賴氨酸---DL-精氨酸0.86--DL-組氨酸0.92--

2.5 討論

Chiral-AGP手性柱在高效液相色譜分離分析中具有廣泛應(yīng)用且適用于所有手性化合物的對(duì)映體分離，包括：胺類化合物、酸性化合物和非質(zhì)子化合物.本實(shí)驗(yàn)中主要考察了Chiral-AGP手性柱對(duì)中性化合物、堿性化合物，酸性化合物以及氨基酸手性樣品的手性分離情況.結(jié)果表明，在高效液相色譜檢測(cè)中，Chiral-AGP手性色譜柱對(duì)酸性、堿性、中性手性化合物以及氨基酸中都有拆分效果，其中Chiral-AGP手性柱對(duì)15中性化合物拆分，有8個(gè)手性化合物得到較好的拆分效果；對(duì)8個(gè)酸性化合物拆分，有6個(gè)手性化合物得到較好拆分效果；對(duì)12個(gè)堿性化合物拆分，有3個(gè)手性化合物得到較好拆分效果；對(duì)21個(gè)氨基酸拆分，有5個(gè)氨基酸得到一定的拆分效果.由于Chiral-AGP手性固定相是α-酸糖蛋白，在酸性條件下比較穩(wěn)定，在流動(dòng)相為酸性(pH=5.8)并添加一定量的緩沖溶液的情況下，根據(jù)“三點(diǎn)作用”經(jīng)典手性識(shí)別理論，酸性化合物與中性化合物對(duì)映體更容易與α-酸糖蛋白發(fā)生可逆相互作用，根據(jù)形成締合物的難易程度和穩(wěn)定程度使得另一對(duì)映體優(yōu)先洗脫，經(jīng)過(guò)多次平衡之后，達(dá)到對(duì)映體的分離.同時(shí)在酸性流動(dòng)相環(huán)境下，堿性化合物和氨基酸與流動(dòng)相的H+、緩沖液產(chǎn)生某些弱相互作用力，與固定相比較難產(chǎn)生一定的吸附作用力，因此堿性化合物和氨基酸并不能夠容易地在Chiral-AGP手性柱上得到理想的拆分效果.因此，Chiral-AGP手性柱在拆分中性和酸性化合物呈現(xiàn)出優(yōu)異的對(duì)映體分離效果；在分離堿性手性化合物和氨基酸時(shí)效果不太好.因此，中性及酸性化合物可以選擇用Chiral-AGP手性柱拆分，堿性化合物和氨基酸可以選擇其他對(duì)此類化合物有更好的拆分性能的商品柱進(jìn)行拆分.

3 結(jié)論

選擇色譜條件：流動(dòng)相乙酸銨緩沖液(pH=5.8)-異丙醇，流速0.9 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量5 μL，用Chiral-AGP手性柱拆分56種手性化合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有22種手性化合物得到較好的手性拆分，充分證明了商品Chiral-AGP手性柱是一種優(yōu)秀的手性柱.從試驗(yàn)結(jié)果可以得出該商品柱在弱酸性環(huán)境下能夠更好地拆分酸性及中性手性化合物.

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[責(zé)任編輯：吳文鵬]

Enantiomeric separation of 56 racemates by HPLC usingα-acid glycoprotein chiral stationary phase

ZHANG Ziheng, YANG Na, HU Cong, DU Yang, YUAN Liming*

(CollegeofChemistryandChemicalEngineering,YunnanNormalUniversity,Kunming650500,Yunnan,China)

Fixed pH, velocity and compounds’ concentration of mobile phase, enantiomeric separation of acid, alkali, neutral chiral compounds and 21 amino acids was explored by HPLC using Chiral-AGP.A total of eight neutral compounds, three basic compounds, six acidic compounds and five amino acids had been enantiomeric separated applying HPLC, usingα-Acid Glycoprotein chiral stationary phase.The capability of Chiral-AGP to chiral resolution of acid, alkali, neutral chiral compounds was investigated.The results proved that the acid and neutral compounds can be used in the best resolution, however, the effect of resolution is poor for alkali and amino acids.This paper offers a reference for the apphication of chiral AGP to separate chiral compounds.

α-acid glycoprotein; chiral separation; liquid chromatography; chiral compounds

2016-07-26.

國(guó)家自然科學(xué)基金(21275126).

張紫恒(1990-), 男, 碩士生，研究方向?yàn)楦叻肿踊瘜W(xué)與物理.*

O658

A

1008-1011(2016)06-0737-05