水溶性的半胱氨酸-β-環(huán)糊精鉑配合物的合成及生物活性研究

趙美霞，姚文靜，朱冰潔，陳迪鳳，張亞宏

(河南大學(xué) 河南省天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004)

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水溶性的半胱氨酸-β-環(huán)糊精鉑配合物的合成及生物活性研究

趙美霞，姚文靜，朱冰潔，陳迪鳳，張亞宏

(河南大學(xué) 河南省天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004)

利用半胱氨酸修飾的β-環(huán)糊精與K2PtCl4反應(yīng)得到了水溶性的鉑配合物(Pt(L-Cys-β-CD)Cl2).通過質(zhì)譜、元素分析和核磁等手段對(duì)合成的鉑配合物進(jìn)行表征.利用MTT法對(duì)該鉑配合物的抗腫瘤活性進(jìn)行研究.主要選擇K562，HepG2和7701三種細(xì)胞對(duì)這種鉑配合物的細(xì)胞毒性進(jìn)行研究，結(jié)果表明該鉑配合物具有較高的細(xì)胞抑制率.其在K562細(xì)胞中的IC50值為(89.5 ± 2.6) μmol/L.更有意義的是，這種鉑配合物對(duì)正常細(xì)胞7701的細(xì)胞毒性要明顯低于另外兩種癌細(xì)胞.因此，該類鉑配合物有望作為潛在的抗腫瘤藥物.

半胱氨酸；β-環(huán)糊精；鉑配合物；生物活性研究；抗腫瘤藥物

作為抗腫瘤藥物，鉑配合物的發(fā)展已經(jīng)成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，基于鉑的抗腫瘤藥物已有很多報(bào)道[1-5].為了更有效的提高其抗腫瘤活性，鉑配合物應(yīng)該被轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)要具有較好的水溶解性[6-7].目前，提高疏水抗腫瘤藥物的水溶性最常用的方法是利用載體或進(jìn)行生物分子修飾，但是很多載體系統(tǒng)由于需要比較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，或者由于較差的體內(nèi)選擇性，使其生物應(yīng)用受到限制[8].通過鏈接生物基團(tuán) (例如氨基酸，多肽，嘌呤和嘧啶等) 可以得到具有靶向性的鉑配合物，即在癌細(xì)胞中具有較好活性而在正常細(xì)胞中具有較低的細(xì)胞毒性[9-11].并且很多生物基團(tuán)修飾的鉑配合物可以有效的與DNA結(jié)合[12-13].

β-環(huán)糊精 (β-CD) 是一種由7個(gè)葡萄糖單元組成的寡糖，是由疏水的空腔和一個(gè)親水的外表面組成的環(huán)狀低聚糖.β-CD可以用作藥物賦形劑提高疏水性藥物分子的溶解度，穩(wěn)定性和生物利用度[14-16].本文中我們把配體半胱氨酸修飾到β-CD上，以考察這種生物活性配體的存在是否可調(diào)節(jié)鉑復(fù)合物細(xì)胞毒性.半胱氨酸修飾的β-CD可提高鉑配合物的溶解性和穩(wěn)定性，同時(shí)可以更好的與鉑結(jié)合.我們利用質(zhì)譜、元素分析和核磁對(duì)合成的配合物進(jìn)行了表征.此外，我們對(duì)Pt(L-Cys-β-CD)Cl2進(jìn)行了細(xì)胞毒性研究，結(jié)果表明這種鉑配合物具有較高的細(xì)胞抑制率，同時(shí)具有一定的細(xì)胞選擇性，即在正常細(xì)胞中的細(xì)胞毒性低于在癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 化學(xué)藥品和試劑

β-CD，對(duì)甲苯磺酰氯，三乙醇胺，L-Cysteine (L-Cys)和K2PtCl4購自上?；瘜W(xué)試劑廠.β-CD反應(yīng)之前利用二次蒸餾水重結(jié)晶3次，然后95 ℃干燥12 h.其他有機(jī)溶劑購于EM科學(xué)試劑.胎牛血清(FBS)和DMEM血清購自Invitrogen，MTT購自Sigma.

1.2 配體半胱氨酸修飾的β-CD的制備

半胱氨酸修飾的β-CD的制備方法如下：L-Cys和對(duì)甲苯磺酰氯環(huán)糊精以1∶3的比例溶于30 mL水和20 mL三乙醇胺的混合溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，加熱到85 ℃攪拌反應(yīng)24 h，點(diǎn)板監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程.低壓蒸出大部分溶劑，然后在劇烈攪拌條件下，把剩余液體倒入至500 mL無水乙醇中，1 h后把該液體置于4 ℃冰箱中，18 h后得到大量淺黃色沉淀.離心得到淺黃色固體產(chǎn)品，用去離子水做洗脫液過G25葡聚糖柱，然后再用水和乙醇的混合溶液重結(jié)晶3次，得到純凈的固體產(chǎn)品，產(chǎn)率為69.5% (L-Cys-β-CD).

1.3 半胱氨酸修飾的β-CD鉑配合物的合成

取0.5 mmol半胱氨酸修飾的β-CD和0.5 mmol的K2PtCl4溶解在50 mL水中，60 ℃條件下避光攪拌48 h.然后，反應(yīng)液冷卻至室溫.離心得固體產(chǎn)物，然后過G-25柱子純化得到黃色固體產(chǎn)物，產(chǎn)率為63.6%.

[Pt(L-Cys-β-CD)Cl2]·8H2O,1H NMR (DMSO-d6, TMS):δ= 1.02～1.24 (m, 2H), 2.72～2.88 (m, 2H), 3.12～3.15 (m, 2H), 3.26～3.62 (m, 45H), 4.26～4.54 (m, 7H), 4.82～4.91 (m, 7H), 5.65～5.91 (m, 14H), 7.93 (m, 1H); 元素分析 (%), C45H75Cl2N4O36PtS·8H2O: 理論值: C 32.79, H 5.56, N 0.85; 實(shí)驗(yàn)值: C 32.91, H 5.42, N 0.91.

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

K562，HepG2和7701細(xì)胞用含10% (體積比) 胎牛血清 (FBS) 的DMEM培養(yǎng)基于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，其中含有1% (體積比) 的雙抗 (每毫升69 μg青霉素和100 μg鏈霉素).將細(xì)胞置于37 ℃，含5% CO2且濕度為90%的培養(yǎng)箱中孵育.

1.5 細(xì)胞毒性研究

細(xì)胞毒性采用如文獻(xiàn)中所述MTT法測定[17].細(xì)胞培養(yǎng)傳代3、4次后，當(dāng)細(xì)胞生長到對(duì)數(shù)期時(shí)，將細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整活細(xì)胞濃度為5 × 104/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，于37 ℃，含5% CO2且濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸出舊培養(yǎng)基，再分別加入用培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的鉑配合物 (10、50、100、150、200 μmol/L).樣品的具體制備方法如下，樣品溶于DMSO中，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔.加入樣品的96孔板置于37 ℃，含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育48 h，然后加入MTT 20 μL/孔 (2.5 g/L)，4 h后棄上清液，加入DMSO 100 μL/孔，振蕩5 min左右，用M200酶標(biāo)儀測定OD值，波長設(shè)置為570 nm和690 nm雙波長.沒有加入樣品的孔的細(xì)胞存活率作為對(duì)照，設(shè)為100%.

2 結(jié)果與討論

2.1 Pt(L-Cys-β-CD)Cl2鉑配合物的合成與表征

鉑配合物Pt(L-Cys-β-CD)Cl2通過K2PtCl4與配體L-Cys-β-CD反應(yīng)得到 (圖1).利用質(zhì)譜和核磁對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征.電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)是一種表征鉑配合物形成的重要方法，質(zhì)譜結(jié)果表明，m/z1 502.1的峰為Pt(L-Cys-β-CD)Cl2的離子峰，m/z780.9的峰歸屬于[Pt(L-Cys-β-CD)Cl2]2+吸附一個(gè)鈉離子和兩個(gè)水分子的離子峰，而m/z751.0為[Pt(L-Cys-β-CD)Cl2]2+的離子峰.

然后我們又利用核磁氫譜對(duì)Pt(L-Cys-β-CD)Cl2的形成進(jìn)行了表征，表明了Pt(L-Cys-β-CD)Cl2的穩(wěn)定存在.

圖1 Pt(L-Cys-β-CD)Cl2鉑配合物合成示意圖

2.2 Pt(L-Cys-β-CD)Cl2鉑配合物的細(xì)胞毒性研究

我們利用3種細(xì)胞(K562, HepG2 和 7701)對(duì)Pt(L-Cys-β-CD)Cl2鉑配合物的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究.利用MTT法得到的Pt(L-Cys-β-CD)Cl2鉑配合物的IC50值列于表1中.當(dāng)Pt(L-Cys-β-CD)Cl2鉑配合物的濃度為100 μmol/L時(shí)，對(duì)3種細(xì)胞的成活率的結(jié)果見圖2.由圖中結(jié)果我們可以看到，Pt(L-Cys-β-CD)Cl2鉑配合物對(duì)細(xì)胞的成活率具有一定的抑制作用.有趣的是Pt(L-Cys-β-CD)Cl2鉑配合物對(duì)正常細(xì)胞7701細(xì)胞的抑制率明顯低于兩種癌細(xì)胞.總之，我們合成的水溶性的Pt(L-Cys-β-CD)Cl2鉑配合物具有一定細(xì)胞選擇性.

表1 Pt(L-Cys-β-CD)Cl2鉑配合物的細(xì)胞毒性

Table 1 Cytotoxicity activity of Pt(L-Cys-β-CD)Cl2complex

SampleIC50(μmol/L)K562HepG27701Pt(L-Cys-β-CD)Cl289.5±2.692.3±3.1128.3±2.8

圖2 Pt(L-Cys-β-CD)Cl2配合物濃度為100 mol/L時(shí)3種細(xì)胞的成活率結(jié)果

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)合成了水溶性半胱氨酸修飾的β-CD鉑配合物，其具有較好的抑制細(xì)胞生長的作用.質(zhì)譜、核磁及元素分析結(jié)果均表明我們成功合成了Pt(L-Cys-β-CD)Cl2鉑配合物.同時(shí)這種Pt(L-Cys-β-CD)Cl2鉑配合物具有一定的細(xì)胞選擇性.因此，這種鉑配合物可以作為潛在的抗腫瘤藥物.

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[責(zé)任編輯：劉紅玲]

Synthesis and bioactivity of the water-solubleL-cysteine-β-cyclodextrin platinum complexes

ZHAO Meixia*, YAO Wenjing, ZHU Bingjie, CHEN Difeng, ZHANG Yahong

(KeyLaboratoryofNaturalMedicineandImmuneEngineeringofHenanProvince,HenanUniversity,Kaifeng475004,HenanChina)

We synthesized a water-solubleL-cysteine-β-cyclodextrin platinum complex (Pt(L-Cys-β-CD)Cl2), and the platinum complex was obtained by the reaction of the ligandL-cysteine-modifiedβ-cyclodextrin with K2PtCl4.The Pt(L-Cys-β-CD)Cl2complex has been characterized using ESI-MS, elemental analysis and1H NMR.The antitumor activity of Pt(L-Cys-β-CD)Cl2complex has been studied by MTT assay.The in vitro cytotoxicity of the platinum complex was evaluated in K562, HepG2 and 7701 cells and higher cell inhibition ratio was observed.Interestingly, the Pt(L-Cys-β-CD)Cl2complex was less toxic on the normal 7701 cells than other two types of cancer cells.So the type of Pt complexes could be used as potential antitumor drug.

L-cysteine；β-cyclodextrin； platinum complex； bioactivity； antitumor drug

2016-07-22.

國家自然科學(xué)基金(U1204201, 221501044), 河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(13A150063, 16A150004), 河南省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目-基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究(132300410228)，河南省青年骨干教師項(xiàng)目(2015).

趙美霞(1977-), 女, 副教授, 研究方向?yàn)樯餆o機(jī)化學(xué).*

R969.1

A

1008-1011(2016)06-0711-03