粗糙脈孢菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶工藝優(yōu)化

周正東，李學(xué)如

(西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031)

粗糙脈孢菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶工藝優(yōu)化

周正東，李學(xué)如

(西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031)

從青儲(chǔ)飼料中分離得到一株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的絲狀真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和26S rDNA D1/D2區(qū)序列比對(duì)分析，確認(rèn)該菌株屬粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)探討了碳源、氮源、無機(jī)鹽、料水比、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響。確定最適產(chǎn)酶工藝為：碳源麩皮與稻草稈的質(zhì)量比6∶4、氮源3%(NH4)2SO4、料水比1∶1.5(g∶mL)、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間60 h，無機(jī)鹽KH2PO4和MgSO4對(duì)產(chǎn)酶影響不顯著，在最適產(chǎn)酶工藝下，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶酶活達(dá)到251.27 U·g-1以上。

粗糙脈孢菌；纖維素酶；固態(tài)發(fā)酵

我國(guó)農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量約9億t，且呈不斷增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)[1-2]。常規(guī)的焚燒、填埋返田以及堆肥等處理方法存在環(huán)境污染嚴(yán)重和利用率低等弊端[2]。農(nóng)作物秸稈的主要成分為纖維素和半纖維素，利用微生物或其產(chǎn)生的纖維素酶可將秸稈中不能被大多數(shù)生物利用的木質(zhì)纖維素降解為可利用的低分子糖，從而為農(nóng)作物秸稈生物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化提供了一條有效途徑[3]。此外，以秸稈為原料通過微生物發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶在釀造工業(yè)、飲料加工業(yè)、紡織工業(yè)、飼料添加劑等領(lǐng)域有著很高的應(yīng)用價(jià)值[4]。研究表明，許多絲狀真菌具有分泌纖維素酶和半纖維素酶的能力[5]，如粗糙脈孢菌產(chǎn)纖維素酶的能力與瑞氏木霉(Trichoderma)相近。林良才等[6]對(duì)粗糙脈孢菌降解木質(zhì)纖維素的機(jī)制進(jìn)行了較細(xì)致的分析。作者通過形態(tài)學(xué)和26S rDNA D1/D2區(qū)序列比對(duì)分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期從青儲(chǔ)飼料中分離得到的一株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的絲狀真菌進(jìn)行鑒定，并以農(nóng)作物秸稈為原料對(duì)該菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為產(chǎn)纖維素酶的粗糙脈孢菌的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與培養(yǎng)基

粗糙脈孢菌NCL，從青儲(chǔ)飼料中分離獲得。

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，自來水1 000 mL，自然pH值。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：250 mL三角瓶裝料10 g干基質(zhì)。碳源(麩皮、稻草稈、玉米稈、玉米芯)、氮源(硫酸銨、酵母膏、蛋白胨)、料水比等根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行不同組合。

1.2 材料、試劑與儀器

麩皮、稻草稈、玉米稈和玉米芯等，采自成都溫江等地；稻草稈、玉米稈和玉米芯均烘干粉碎過20目篩。

真菌DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、PCR純化試劑盒等，Omega公司；四水合酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、一水檸檬酸、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀等均為分析純。

3，5-二硝基水楊酸(DNS)試劑：稱取DNS 3.15 g，加水500 mL，攪拌3～5 s，水浴至45 ℃。逐步加入100 mL氫氧化鈉溶液(200 g·L-1)，不斷攪拌至溶液清澈透明。逐步加入四水合酒石酸鉀鈉91.0 g、苯酚2.5 g和無水亞硫酸鈉2.5 g，繼續(xù)45 ℃水浴加熱，同時(shí)補(bǔ)加水300 mL，不斷攪拌直至完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫，用去離子水定容至1 000 mL。用燒結(jié)玻璃過濾器過濾，濾液儲(chǔ)存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7 d后使用，有效期180 d。

檸檬酸鹽緩沖液(pH=5.5)：稱取一水檸檬酸10.5 g、氫氧化鈉5.0 g，加800 mL水溶解，調(diào)pH值至5.5，用去離子水定容至1 000 mL。

9902型PCR儀，美國(guó)Life Technologies公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；GeneGenius型全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)UVP公司；V-1100D型可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；D3024R型高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽洛捷克公司；ZHWY-2102C型恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：在內(nèi)置載玻片的PDA平板上接種一環(huán)粗糙脈孢菌，30 ℃培養(yǎng)3 d后取出載玻片，在顯微鏡下觀察菌落、菌絲及孢子的形態(tài)。

26S rDNA分子鑒定：參照文獻(xiàn)[7]稍做改進(jìn)。將菌種接種于PDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖瓶培養(yǎng)3 d，離心收集菌絲體，洗滌，加液氮研磨。按真菌DNA提取試劑盒操作步驟提取基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA，然后用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增26S rDNA的D1/D2區(qū)片段。PCR擴(kuò)增的上游引物為：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-GG-3′，下游引物為：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)：DNA模板2 μL，PCR反應(yīng)混合液25 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol)，補(bǔ)加ddH2O到50 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化與測(cè)序：按照PCR純化試劑盒操作步驟純化PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物的測(cè)序委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

序列比對(duì)及菌株的鑒定：輸入菌株26S rDNA的D1/D2區(qū)片段測(cè)序結(jié)果，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對(duì)，鑒定菌株的種屬。

1.3.2 菌株固態(tài)發(fā)酵

按麩皮與稻草稈質(zhì)量比6∶4在250 mL三角瓶中裝料10 g干基質(zhì)，加入2% 硫酸銨、10 mL水，30 ℃培養(yǎng)24 h后扣瓶，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)2 d后，取出發(fā)酵產(chǎn)物，40 ℃過夜烘干。

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)探討碳源、氮源、無機(jī)鹽、料水比、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響。

1.3.3 纖維素酶酶活的測(cè)定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：先用檸檬酸鹽緩沖液配制10 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，再稀釋成0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1、1.8 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.00 mL(2組平行)于刻度試管中，再分別加入2 mL水和2 mL DNS試劑，沸水浴5 min。自來水冷卻至室溫，用水定容至25 mL，測(cè)定540 nm處吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液含葡萄糖的毫克數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到線性回歸方程：y=2.867x+0.080，R2=0.9980。

纖維素酶酶活測(cè)定：發(fā)酵結(jié)束，取樣，烘干，按NY/T 912-2004[8]測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶酶活。

酶活力單位定義：將37 ℃、pH值為5.5下，4 mg·mL-1羧甲基纖維素鈉溶液每分鐘降解釋放1 μmol還原糖所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的鑒定

從青儲(chǔ)飼料中分離得到一株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的絲狀真菌，其在PDA平板上生長(zhǎng)3 d的形態(tài)如圖1所示。

菌落形態(tài) 菌絲及孢子形態(tài)(×200)

圖1 菌株在PDA平板上的生長(zhǎng)形態(tài)

Fig.1 Morphological images of the strain on PDA plate

由圖1可知，菌株在PDA平板上呈擴(kuò)散狀生長(zhǎng)，菌絲為疏松網(wǎng)狀的長(zhǎng)菌絲，在氣生菌絲的頂部形成分枝鏈，分生孢子呈橘黃色，成熟的孢子呈串珠狀排列(圖1b)。這些形態(tài)特征與魏景超[9]的《真菌鑒定手冊(cè)》和張妍妍等[10]描述的粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)形態(tài)相吻合。

將PCR擴(kuò)增26S rDNA的 D1/D2區(qū)片段測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該菌株與數(shù)據(jù)庫中的NeurosporacrassaEFB06相似度達(dá)100%。結(jié)合形態(tài)特征與26S rDNA分子鑒定，初步確認(rèn)該菌株屬粗糙脈孢菌，將其命名為NCL。

2.2 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶工藝優(yōu)化

2.2.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

纖維素酶是一種誘導(dǎo)酶，在以農(nóng)作物秸稈為培養(yǎng)基基質(zhì)的發(fā)酵過程中，農(nóng)作物秸稈既是纖維素酶生長(zhǎng)的碳源同時(shí)又是纖維素酶產(chǎn)生的誘導(dǎo)物。4種不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響如表1所示。

表1 4種不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響/(U·g-1)

Tab.1 Effect of four different carbon sources on enzyme-production/(U·g-1)

碳源稻草稈麩皮玉米稈玉米芯酶活201.56220.75138.9437.58

由表1可知，以稻草稈或麩皮為碳源時(shí)，粗糙脈孢菌NCL的產(chǎn)酶效果較好。

進(jìn)一步考察兩者質(zhì)量比對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 麩皮與稻草稈的質(zhì)量比對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

由圖2可知，最適麩皮與稻草稈質(zhì)量比為6∶4。麩皮比例適當(dāng)可以促進(jìn)產(chǎn)酶，當(dāng)比例超過60%后酶活反而有所降低。這可能是因?yàn)?，麩皮比例過高時(shí)，其含有的可溶性糖較高反而抑制了纖維素酶的產(chǎn)生[11]。

2.2.2 料水比對(duì)產(chǎn)酶的影響

確定培養(yǎng)基麩皮與稻草稈質(zhì)量比為6∶4后，考察不同料水比(g∶mL，下同)對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)料水比為1∶1、1∶1.5和1∶2時(shí)，菌株產(chǎn)纖維素酶酶活分別為229.11 U·g-1、237.72 U·g-1和219.43 U·g-1，在料水比為1∶1.5時(shí)酶活最高，但三者之間差異不顯著，表明粗糙脈孢菌NCL能在一個(gè)比較寬泛的料水比環(huán)境中產(chǎn)纖維素酶。因此，選擇最適料水比為1∶1.5。

2.2.3 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)考察酵母膏、蛋白胨和硫酸銨3種氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見表2。進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表2可知，發(fā)酵培養(yǎng)基的合適氮源組合為：1%酵母膏，2%蛋白胨，3%硫酸銨。從表3可看出，3種氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響程度為：硫酸銨>蛋白胨>酵母膏，其中硫酸銨的影響程度遠(yuǎn)大于蛋白胨和酵母膏?？紤]到顯著性大小和實(shí)際生產(chǎn)成本，選取硫酸銨作為唯一氮源進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)考察(NH4)2SO4、KH2PO4和MgSO4對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見表4。

由表4可知，KH2PO4和MgSO4的極差(R)與空白極差相近，表明培養(yǎng)基中添加KH2PO4和MgSO4對(duì)產(chǎn)酶影響不大；培養(yǎng)基中添加3%或4%的(NH4)2SO4對(duì)產(chǎn)酶影響十分接近。因此，粗糙脈孢菌NCL在 3%(NH4)2SO4作唯一氮源的培養(yǎng)基中能獲得較好的產(chǎn)酶效果。

表2 氮源對(duì)產(chǎn)酶影響的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of orthogonal experiment for the effect of nitrogen source on enzyme-production

編號(hào)酵母膏%蛋白胨%硫酸銨%空白列酶活U·g-11001-186.682012-204.603023-217.744102-212.165113-214.956121-206.197203-212.968211-194.249222-217.74k1203.01203.93195.70206.46k2211.10204.60211.50207.92k3208.31213.89215.22208.05R8.099.9619.521.59

表3 方差分析

Tab.3 Variance analysis of orthogonal experiment

因素偏差平方和自由度F比顯著性酵母膏101.43221.69*蛋白胨185.94239.76*硫酸銨644.122137.72**誤差4.682

注:F0.05(2,2)=19.00，F(xiàn)0.01(2，2)=99.00；*表示具有顯著性；**表示具有極顯著性。

2.2.5 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響(表5)

表5 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

Tab.5 Effect of culture temperature on enzyme-production

溫度/℃263034酶活/(U·g-1)211.36242.17243.88

由表5可知，26 ℃培養(yǎng)時(shí)酶活最低，30 ℃和34 ℃培養(yǎng)時(shí)酶活較為接近。因此，選擇最適培養(yǎng)溫度為30 ℃。

2.2.6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

按麩皮與稻草稈質(zhì)量比6∶4裝料10 g干基質(zhì)，加入3%(NH4)2SO4、15 mL水，在30 ℃下考察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，前24 h，酶活一直處于較低水平；24～36 h，酶活呈指數(shù)急速上升，這是因?yàn)?，一方面菌絲體開始旺盛生長(zhǎng)，另一方面是培養(yǎng)12 h后扣瓶使得發(fā)酵物的通氣情況得到改善；60 h后，酶活趨于穩(wěn)定。因此，選擇最適培養(yǎng)時(shí)間為60 h。

表4 無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶影響的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.4 Results of orthogonal experiment for the effect of inorganic salt on enzyme-production

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.3 菌株最適產(chǎn)酶工藝驗(yàn)證

在最適產(chǎn)酶工藝[麩皮與稻草稈質(zhì)量比為6∶4、250 mL三角瓶裝料10 g干基質(zhì)、加入3%(NH4)2SO4作為氮源、添加15 mL水使料水比為1∶1.5、30 ℃培養(yǎng)60 h]下進(jìn)行5批次粗糙脈孢菌NCL固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵產(chǎn)物纖維素酶酶活都穩(wěn)定在251.27 U·g-1以上。表明，本實(shí)驗(yàn)所得最適產(chǎn)酶工藝可行。

3 結(jié)論

經(jīng)形態(tài)學(xué)和26S rDNA D1/D2區(qū)序列比對(duì)分析，確認(rèn)從青儲(chǔ)飼料中分離得到的一株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的絲狀真菌屬粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)。該菌產(chǎn)纖維素酶的最適工藝為：碳源麩皮與稻草稈質(zhì)量比6∶4，氮源3%(NH4)2SO4、料水比1∶1.5(g∶mL)、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間60 h，在此工藝下，菌株產(chǎn)纖維素酶酶活達(dá)251.27 U·g-1以上。

[1] 畢于運(yùn),高春雨,王亞靜,等.中國(guó)秸稈資源數(shù)量估算[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2009，25(12):211-217.

[2] 彭春艷,羅懷良,孔靜.中國(guó)作物秸稈資源量估算與利用狀況研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)資源與區(qū)劃,2014,35(3):14-20.

[3] ZNAMEROSKI E A,GLASS N L.Using a model filamentous fungus to unravel mechanisms of lignocellulose deconstruction[J].Biotechnology for Biofuels,2013，6(1):1-7.

[4] 趙琪,李亞蘭,陳子欣,等.纖維素酶應(yīng)用研究的最新進(jìn)展[J].廣州化工,2014，42(6):21-23.

[5] SUN J,TIAN C,DIAMOND S,et al.Deciphering transcriptional regulatory mechanisms associated with hemicellulose degradation inNeurosporacrassa[J].Eukaryotic Cell,2012,11(4):482-493.

[6] 林良才,李金根,王邦,等.粗糙脈孢菌木質(zhì)纖維素降解利用研究進(jìn)展[J].生物加工過程,2014，12(1):28-36.

[7] 陳鋒菊,李百元,楊冰,等.一種經(jīng)濟(jì)快速提取絲狀真菌基因組DNA的方法[J].生命科學(xué)研究,2010，14(2):122-124.

[8] NY/T 912-2004,飼料添加劑 纖維素酶活測(cè)定[S].

[9] 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1979:198-199.

[10] 張妍妍,劉佩卉,劉新利.粗糙脈孢菌及其在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用研究[J].山東科學(xué),2011，24(3):37-42.

[11] 汪世華,胡開輝,楊燕凌.纖維素酶固體發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,27(1):65-66,69.

Optimization on Cellulase Production with Neurospora crassa by Solid-State Fermentation

ZHOU Zheng-dong，LI Xue-ru

(SchoolofLifeScienceandEngineering,SouthwestJiaotongUniversity,Chengdu610031,China)

A mycelial fungus with strong ability of producing cellulase was screened from ensilage and identified asNeurosporacrassaby the analysis of morphology and 26S rDNA D1/D2 sequence alignment.The effects of factors on producing cellulase withNeurosporacrassaby solid-state fermentation were investigated by a single factor experiment and an orthogonal experiment.The optimal fermentation conditions were as follows:the mass ratio of wheat bran to rice straw was 6∶4,nitrogen source was 3%(NH4)2SO4,material-water ratio was 1∶1.5(g∶mL),culture temperature was 30 ℃,culture time was 60 h,inorganic salt KH2PO4and MgSO4had no significant effect on cellulase production.The enzyme activity of produced cellulase reached up to above 251.27 U·g-1under above optimal conditions.

Neurosporacrassa;cellulase;solid-state fermentation

四川省科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012FZ0048)

2016-06-22

周正東(1993-)，男，湖南龍山人，碩士研究生，研究方向：微生物技術(shù)，E-mail：1016992297@qq.com；通訊作者：李學(xué)如，教授，E-mail：xueruli@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.12.008

周正東，李學(xué)如.粗糙脈孢菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶工藝優(yōu)化[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(12)：38-41，47.

TQ 352.78 TQ 920.1

A

1672-5425(2016)12-0038-04