雷公藤內(nèi)生真菌Pestalotiopsis disseminata次級(jí)代謝產(chǎn)物研究

李 博，王 宇，潘華奇，梁洪玥，趙 楠，陳再興，劉 濤

(1.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧沈陽 110016；3.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 錦州121000；4.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110122)

雷公藤內(nèi)生真菌Pestalotiopsis disseminata次級(jí)代謝產(chǎn)物研究

李 博1，王 宇1，潘華奇2，梁洪玥3，趙 楠1，陳再興4，劉 濤1

(1.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧沈陽 110016；3.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 錦州121000；4.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110122)

采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜及PHPLC等手段對(duì)雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)內(nèi)生真菌廣布擬盤多毛孢(Pestalotiopsisdisseminata)的發(fā)酵次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，通過理化性質(zhì)及波譜學(xué)數(shù)據(jù)分析對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，從內(nèi)生真菌Pestalotiopsisdisseminata的次級(jí)代謝產(chǎn)物中共分離并鑒定了7個(gè)單體化合物，分別為7-羥基-5-甲氧基-4,6-二甲基苯酞(Ⅰ)、腺苷(Ⅱ)、尿苷(Ⅲ)、鄰苯二甲酸二正丁酯(Ⅳ)、鄰苯二甲酸二異丁酯(Ⅴ)、1,1′-二(1,1′-羧基乙基)醚(Ⅵ)、赤蘚醇(Ⅶ)，其中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ為首次從該屬真菌中分離得到，化合物Ⅰ、Ⅴ為首次從該種真菌中分離得到。

雷公藤；內(nèi)生真菌；廣布擬盤多毛孢；次級(jí)代謝產(chǎn)物

植物內(nèi)生菌是指在健康植物的組織和器官內(nèi)部度過全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現(xiàn)任何癥狀的菌群，它們可能存在于植物組織內(nèi)部的任何部位[1-2]，可以通過組織學(xué)方法從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離，或者通過從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物DNA 的方法來獲得。藥用植物的內(nèi)生真菌由于和藥用植物長期互惠共生，相互協(xié)調(diào)發(fā)展，往往可以產(chǎn)生一些與宿主植物自身代謝產(chǎn)物相同、相似或較為獨(dú)特的次級(jí)代謝產(chǎn)物，并且從這些較為獨(dú)特的次級(jí)代謝產(chǎn)物中往往更容易發(fā)現(xiàn)新的活性物質(zhì)。目前，從藥用植物中已獲得了大量的內(nèi)生真菌，有些內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生具有生物活性的天然產(chǎn)物(如喜樹堿[3-4]、紫杉醇及長春新堿等[5])，并表現(xiàn)出抗炎[6]、抗癌[7]、免疫抑制[8]及殺蟲[9]等多種生物功能。藥用植物內(nèi)生真菌被認(rèn)為是生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的重要來源之一[10]。

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)又名黃藤、黃藤木、斷腸草等，為衛(wèi)矛科一年生藤本植物，是我國傳統(tǒng)常用中藥。《中國藥用植物志》中記載：其味苦、澀，性寒、有毒，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗生育及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，臨床用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[11]、腎炎等自身免疫性疾病[12]。然而，目前關(guān)于雷公藤的研究主要集中在化學(xué)成分的提取分離及臨床應(yīng)用方面，有關(guān)雷公藤內(nèi)生真菌的研究報(bào)道相對(duì)較少。

鑒于此，作者采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜及半制備型HPLC(PHPLC)等手段對(duì)雷公藤內(nèi)生真菌廣布擬盤多毛孢(Pestalotiopsisdisseminata)的發(fā)酵次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，以期發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的免疫抑制活性化合物。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種、試劑與儀器

雷公藤植株，2015年8月采自福建省寧德市柘榮縣，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室許亮教授鑒定為雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)；實(shí)驗(yàn)菌種分離自該雷公藤植株，經(jīng)中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所潘華奇助理研究員鑒定為廣布擬盤多毛孢(Pestalotiopsisdisseminata)真菌，存放于中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室。

Sephadex LH-20型凝膠，英國GE Healthcare 公司；HP-20型大孔吸附樹脂，日本三菱公司；柱色譜用硅膠G(100～200目、200～300目)和薄層色譜用硅膠GF254，青島海洋化工有限公司；常規(guī)用試劑均為分析純；高效液相色譜用試劑為色譜純。

AVANCE 600型核磁共振儀，德國Bruker公司；HITACHI 1110型半制備型高效液相色譜儀、1410型紫外檢測器，日本日立公司；EYELA N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會(huì)社；BSA124S型分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HEQ-F160型振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-1FD型凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Sinochrom ODS-BP型色譜柱(10 mm×250 mm，5 μm)，大連依利特分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵

將斜面保藏菌種接種到培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d；然后將培養(yǎng)基平板切成小塊接種到裝有200 mL PDA發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于28 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)10 d，得到發(fā)酵液14.6 L。

PDA發(fā)酵培養(yǎng)基配制：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮后切成小塊，加水1 000 mL煮沸30 min，紗布過濾，在濾液中加入20 g葡萄糖，充分溶解后，分裝。

1.2.2 提取分離

將發(fā)酵液在8 000 r·min-1下離心15 min，分離菌絲體與發(fā)酵液。菌絲體用丙酮超聲提取3次，每次1 h，合并提取液，減壓回收得到浸膏。發(fā)酵液用大孔吸附樹脂吸附后，依次用水、15%乙醇、95%乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集95%乙醇洗脫液，減壓回收得到浸膏。合并上述兩部分浸膏得到粗浸膏53.8 g。粗浸膏經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇(體積比100∶0→0∶100)梯度洗脫，得到10個(gè)組分Fr.1～10。Fr.1(1.5 g)經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯(體積比100∶0→7∶3)梯度洗脫，得到組分Fr.1-1～5，其中Fr.1-3經(jīng)PHPLC分離，用80%甲醇洗脫，進(jìn)一步分離純化得到化合物Ⅳ(8.8 mg)和化合Ⅴ(10.4 mg)；Fr.1-5經(jīng)PHPLC分離，用80%甲醇洗脫，進(jìn)一步分離純化得到化合物Ⅰ(9.8 mg)。Fr.6(2.2 g)經(jīng)硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇(體積比15∶1→1∶1)梯度洗脫，得到組分Fr.6-1～6，其中Fr.6-6經(jīng)PHPLC分離，用28%甲醇洗脫，進(jìn)一步分離純化得到化合物Ⅶ(5.8 mg)和化合物Ⅲ(10.2 mg)。Fr.7(2.8 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，甲醇洗脫，得到組分Fr.7-1～6，其中Fr.7-6經(jīng)PHPLC分離，用30%甲醇洗脫，進(jìn)一步分離純化得到化合物Ⅱ(8.5 mg)。Fr.5(1.5 g)經(jīng)甲醇反復(fù)重結(jié)晶得到化合物Ⅵ(20.1 mg)。

1.2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

通過理化性質(zhì)及波譜學(xué)數(shù)據(jù)分析對(duì)化合物Ⅰ～Ⅶ進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2 結(jié)果與討論

從雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)內(nèi)生真菌廣布擬盤多毛孢(Pestalotiopsisdisseminata)的發(fā)酵次級(jí)代謝產(chǎn)物中共分離得到7個(gè)化合物，其理性質(zhì)及波譜學(xué)數(shù)據(jù)如下：

化合物Ⅰ：無色針狀結(jié)晶(氯仿-甲醇)，10%硫酸乙醇顯灰紫色。1HNMR(CDCl3,600 MHz)，δ：7.68(1H,s,7-OH),5.20(2H,s,H-2),3.77(3H,s,5-OCH3),2.20(3H,s,6-CH3),2.14(3H,s,4-CH3);13CNMR(CDCl3,150 MHz)，δ：173.0(C-1),163.8(C-5),153.8(C-7),143.4(C-3),118.5(C-6),116.5(C-4),105.1(C-8),70.1(C-2),60.3(5-OCH3),11.4(4-CH3),8.5(6-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，故確定該化合物為7-羥基-5-甲氧基-4,6-二甲基苯酞(7-hydroxy-5-methoxy-4,6-dimethylphthalide)。

化合物Ⅱ：白色無定形粉末，紫外照射下有暗斑、無熒光。1HNMR(DMSO-d6，600 MHz)，δ：8.38(1H,s,H-2),8.17(1H,s,H-8),7.37(2H,brs,NH2),5.88(1H,d,J=6.0 Hz,H-1′),5.46(1H,s,H-2′),4.64(1H,brs,H-3′),4.17(1H,brs,H-4′),3.60(1H,d,J=12.0 Hz,H-5′a),3.58(1H,d,J=12.0 Hz,H-5′b)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致，故確定該化合物為腺苷 (adenosine)。

化合物Ⅲ：白色無定形粉末。1HNMR(DMSO-d6,600 MHz)，δ：11.33(1H,brs,NH),7.91(1H,d,J=8.4 Hz,H-6),5.81(1H,d,J=5.4 Hz H-1′),5.68(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),5.42(1H,brs,OH),5.13(2H,brs,OH),4.06(1H,t,J=6.6 Hz,H-2′),4.00(1H,t,J=6.6 Hz,H-3′),3.87(1H,dd,J=7.2 Hz、3.6 Hz,H-4′),3.65(1H,m,H-5′a),3.58(1H,m,H-5′b)；13CNMR(DMSO-d650 MHz)，δ：163.5(C-4),151.1(C-2),141.1(C-6),102.1(C-5),88.1(C-1′),85.2(C-4′),73.9(C-2′),70.3(C-3′),61.2(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故確定該化合物為尿苷(uridine)。

化合物Ⅳ：無色油狀物。1HNMR(CDCl3，600 MHz)，δ：7.72(2H,m,H-3,6),7.53(2H,m,H-4,5),4.31(4H,t,J=7.2 Hz,H-1′,1″),1.72(4H,m,H-2′,2″),1.44(4H,m,H-3′,3″),0.96(6H,t,J=7.2 Hz,H-4′,4″)。根據(jù)δ7.72(2H,m)和δ7.53(2H,m)處呈現(xiàn)的峰形，推測該化合物可能具有鄰位對(duì)稱取代的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，構(gòu)成AA′XX′自旋偶合系統(tǒng)。結(jié)合文獻(xiàn)[16]數(shù)據(jù)，確定該化合物為鄰苯二甲酸二正丁酯(dibutyl phthalate)。

化合物Ⅴ：無色油狀物。1HNMR(CDCl3，600 MHz)，δ：7.73(2H,m,H-3,6),7.54(2H,m,H-4,5),4.10(4H,d,J=6.6 Hz,H-1′,1″),2.04(2H,m,H-2′,2″),1.00(12H,d,J=6.6 Hz,H-3′,3″,4′,4″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故確定該化合物為鄰苯二甲酸二異丁酯 (diisobutyl phthalate)。

化合物Ⅵ：白色無定形粉末，紫外照射下無暗斑、有熒光，10%硫酸乙醇不顯色。1HNMR(DMSO-d6，600 MHz)，δ：6.76(1H,brs,COOH),3.83(1H,brs,H-1,1′),1.22(3H,brs,H-2,2′)；13CNMR(DMSO-d6，150 MHz)，δ：177.1(COOH),68.3(C-1,1′),21.1(C-2,2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故確定該化合物為1,1′-二(1,1′-羧基乙基)醚[1,1′-bis(1,1′-carboxyethyl)ether]。

化合物Ⅶ：無色結(jié)晶(甲醇)。1HNMR(DMSO-d6,600 MHz)，δ：3.45(2H,m,H-2,3),3.35(4H,m,H-1,4)，均為連氧碳上的氫信號(hào)；13CNMR(DMSO-d6,150 MHz)中只有2個(gè)碳信號(hào)63.42和72.87，由此推測其可能為對(duì)稱結(jié)構(gòu)。結(jié)合文獻(xiàn)[18]數(shù)據(jù)，確定該化合物為赤蘚醇(erthyritol)。

化合物Ⅰ～Ⅶ的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 化合物Ⅰ～Ⅶ的結(jié)構(gòu)式

3 結(jié)論

從雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook. f.)內(nèi)生真菌廣布擬盤多毛孢(Pestalotiopsisdisseminata)的發(fā)酵次級(jí)代謝產(chǎn)物中共分離得到7個(gè)化合物，分別為7-羥基-5-甲氧基-4,6-二甲基苯酞(Ⅰ)、腺苷(Ⅱ)、尿苷(Ⅲ)、鄰苯二甲酸二正丁酯(Ⅳ)、鄰苯二甲酸二異丁酯(Ⅴ)、1,1′-二(1,1′-羧基乙基)醚(Ⅵ)、赤蘚醇(Ⅶ)，其中化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ為首次從該屬真菌中分離得到，化合物Ⅰ、Ⅴ為首次從該種真菌中分離得到。

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Secondary Metabolites of Endophytic Fungus Pestalotiopsis disseminata Isolated from ripterygium wilfordii Hook. f.

LI Bo1,WANG Yu1,PAN Hua-qi2,LIANG Hong-yue3,ZHAO Nan1,CHEN Zai-xing4,LIU Tao1

(1.DepartmentofNaturalProductsChemistry,SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China;2.InstituteofAppliedEcology,ChineseAcademyofSciences,Shenyang110016,China;3.SchoolofPharmacy,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121000,China;4.CentralLaboratory,SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China)

The secondary metabolites ofPestalotiopsisdisseminata,a endophytic fungus isolated fromTripterygiumwilfordiiHook.f.,were isolated and purified through silica gel and Sephadex LH-20 gel column chromatography as well as PHPLC method,and the structures of obtained compounds were identified by physicochemical properties and spectral data.Results showed that,seven compounds which isolated from the secondary metabolites ofPestalotiopsisdisseminatawere identified as 7-hydroxy-5-methoxy-4,6-dimethylphthalide(Ⅰ),adenosine(Ⅱ),uridine(Ⅲ),dibutyl phthalate(Ⅳ),diisobutyl phthalate(Ⅴ),1,1′-bis(1,1′-carboxyethyl) ether(Ⅵ),erthyritol(Ⅶ),respectively.Compounds Ⅱ,Ⅲ,Ⅵ and Ⅶ were firstly obtained fromPestalotiopsisgenus,and compounds Ⅰ and Ⅴ were firstly found from fungusPestalotiopsisdisseminata.

TripterygiumwilfordiiHook.f.;endophytic fungus;Pestalotiopsisdisseminata;secondary metabolite

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302672)，遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(L2013315)

2016-08-17

李博(1987-)，女，遼寧沈陽人，講師，研究方向：中藥及天然藥物活性成分和質(zhì)量控制，E-mail:libo06101409@126.com；通訊作者：劉濤，副教授，E-mail:taoliu0307@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.12.005

李博，王宇，潘華奇，等.雷公藤內(nèi)生真菌Pestalotiopsisdisseminata次級(jí)代謝產(chǎn)物研究[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(12)：27-30.

R 284.1

A

1672-5425(2016)12-0027-04