槐角丸微生物限度檢查方法驗證研究

摘要：目的 建立槐角丸的微生物限度檢查方法。方法 采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法進行計數(shù)方法驗證，采用直接接種法進行控制菌檢查方法驗證。結(jié)果 可采用常規(guī)法進行霉菌和酵母菌總數(shù)測定，需采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）進行細菌總數(shù)測定，可采用直接接種法進行控制菌檢查。

關(guān)鍵詞：槐角丸；微生物限度檢查；方法驗證

槐角丸具有清腸疏風(fēng)，涼血止血的功效。用于血熱所致的腸風(fēng)便血，痔瘡腫痛。因其治療效果確切，患者對其普遍認同，因而廣泛用于臨床。由于現(xiàn)行收載的檢查項下，沒有規(guī)定具體的微生物限度檢查方法，為此對槐角丸按照《中國藥典2010年版一部》進行微生物限度檢查方法驗證，從而有效地提高了微生物污染菌的檢出率，保證了檢查結(jié)果的有效性和可靠性。

1 儀器與材料

1.1儀器 MJ-Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；SPX-150型生化培養(yǎng)箱（上海金慧科電子有限公司）；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2試驗菌 枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]。

1.3試驗試材 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、氯化鈉蛋白胨緩沖液，以上培養(yǎng)基均由北京陸橋技術(shù)有限公司提供。

稀釋液：①0.9%無菌氯化鈉溶液（用于菌液稀釋）；②pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（用于供試品制備）。

1.4供試品 槐角丸批號150501，藥品批準文號國藥準字Z61021362，由陜西利君現(xiàn)代中藥有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1菌液的制備 按照《中國藥典2010年版一部》附錄要求，采用10倍稀釋法將5種陽性菌分別稀釋至50～100cfu/ml的菌懸液，備用。

2.2供試液的制備 取供試品10g，加入到100ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，振搖使充分溶解，離心（500r/min，3min），取上清液作為1：10供試液，備用。

2.3方法驗證

2.3.1計數(shù)方法驗證

2.3.1.1常規(guī)法 取供試液1ml和已制備好的5種陽性菌液分別1ml加入到培養(yǎng)皿中，加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)皿傾注15～20ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，35℃培養(yǎng)3d，加入白色念珠菌、黑曲霉的培養(yǎng)皿傾注15～20ml玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，25℃培養(yǎng)5d，作為試驗組，同法測定所加的試驗菌作為菌液組，測定供試品的本底菌作為供試品對照組，進行3次獨立試驗。采用平皿計數(shù)法，計算回收率：試驗組菌回收率（%）=[（試驗組菌數(shù)-供試品對照組菌數(shù)）/菌液組菌數(shù)]×100%，結(jié)果見表1。

結(jié)果白色念珠菌、黑曲霉的回收率>70%，表明霉菌和酵母菌可采用常規(guī)法進行檢查，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收率<70%，表明供試品對這兩種細菌有一定程度的抑菌性，需采用培養(yǎng)基稀釋法進行進一步的方法驗證。

2.3.1.2 培養(yǎng)基稀釋法 分別取供試液（0.5ml/皿）和（0.2ml/皿），再分別加入試驗菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌各50～100cfu/皿，同常規(guī)法進行試驗，測定回收率。見表2。

由表2結(jié)果看，采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5ml/皿），兩種陽性菌的回收率仍小于70%，而采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）兩種陽性菌的回收率均大于70%，表明可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）對本供試品進行細菌總數(shù)測定。

2.3.2控制菌方法驗證 直接接種法。

2.3.2.1大腸埃希菌 參照《中國藥典2010年版一部》附錄控制菌檢查大腸埃希菌檢查項下的方法進行試驗，見表3。

2.3.2.2大腸菌群 參照《中國藥典2010年版一部》附錄控制菌檢查大腸菌群檢查項下的方法進行試驗，見表4。

表3、表4試驗結(jié)果表明，試驗組和陽性對照組均分別檢出大腸埃希菌和大腸菌群；陰性對照組均未檢出試驗菌?？刹捎弥苯咏臃N法進行控制菌中大腸埃希菌和大腸菌群的檢查。

3 討論

本實驗對槐角丸的微生物限度檢查方法按照《中國藥典2010年版一部》進行方法驗證，結(jié)果可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）進行細菌總數(shù)檢查，可采用常規(guī)法進行霉菌和酵母菌計數(shù)，可采用直接接種法進行控制菌的檢查。

本試驗研究結(jié)果表明，槐角丸對細菌中金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌具有較強的的抑制作用，不能采用常規(guī)法直接對槐角丸進行細菌總數(shù)測定?；苯峭枞接苫苯恰⒌赜芴?、黃芩、枳殼、當(dāng)歸、防風(fēng)組成。由于槐角丸組成較為復(fù)雜，一些組成成分本身對微生物有不同程度的抑制作用[2]，具體哪種中藥成分或者幾種中藥成分的共同抑菌作用還有待于進一步研究。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄79-86.

[2]路俊仙，崔璐，等.不同種質(zhì)黃芩體外抑菌作用的研究[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2009（06）.編輯/周蕓霏