利用PCR技術(shù)鑒別畜禽肉中禽源性成分研究

摘要：為了建立一種快速、特異的禽源性成分檢測(cè)方法，以線粒體16S rRNA基因序列為靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)雞、鴿、鵪鶉特異性引物，以常見畜禽肉（包括羊肉、牛肉、豬肉、兔肉、鴿肉、鵪鶉肉、雞肉、鴨肉、鵝肉等）DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和特異性檢測(cè)。結(jié)果表明，篩選的引物能夠有效地對(duì)動(dòng)物源性成分進(jìn)行檢測(cè)，方便簡(jiǎn)潔，可快速鑒別畜禽肉食品中含有的雞源性、鴿源性、鵪鶉源性成分。

關(guān)鍵詞：禽源性成分；16S rRNA基因；PCR；鑒別

中圖分類號(hào)：TS251.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）15-4021-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.056

Abstract： In order to establish a quick and specific peculiar method， which could identify the components of poultry origin. 16S rRNA gene sequence was use as target site， the specific primers of chicken， pigeon meat and quail meat were designed. The DNA of common livestock and poultry meat including mutton， beef， pork， rabbit meat， pigeon meat， quail meat， chicken， duck and goose were used as template. Though PCR amplification and specific detection， a quick determination method was established to identify the components of poultry origin. The results showed that the selected primer could identify the components of animal origin effectively and quickly. The method was convenient and concise， and could detect the chicken origin， pigeon origin and quail origin in poultry food quickly and accurately.

Key words： components of poultry origin；16S rRNA gene；PCR；identification

肉與肉制品摻雜、摻假是目前食品質(zhì)量控制面臨的重要挑戰(zhàn)。一些不法商家或個(gè)人為了追求自身利益以低價(jià)劣質(zhì)的肉冒充高價(jià)優(yōu)質(zhì)的肉，嚴(yán)重侵犯了消費(fèi)者的合法權(quán)益，更直接影響著消費(fèi)者的健康。因此，對(duì)食品中原料肉進(jìn)行摻假、摻雜檢驗(yàn)顯得尤為重要，其重點(diǎn)就是快速、準(zhǔn)確地鑒定肉品成分來源[1]。

PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡(jiǎn)便、快速高效等特點(diǎn)，在肉類摻假檢測(cè)方面具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，已成為肉制品品種鑒別最常用的方法之一[2]。目前，PCR技術(shù)由于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在國(guó)內(nèi)外肉類摻假的研究中已得到廣泛應(yīng)用，并取得創(chuàng)新性成果[3-5]。

在目標(biāo)基因選擇方面，動(dòng)物線粒體基因組DNA序列具有高度的物種特異性，是設(shè)計(jì)肉類成分定性檢測(cè)的首選靶點(diǎn)，包括細(xì)胞色素b（Cyt b）基因、12S rRNA、16S rRNA、D-Loop基因等[6-8]。本研究選擇16S rRNA基因序列為靶基因，通過基因序列比對(duì)，設(shè)計(jì)篩選出雞、鴿和鵪鶉的特異性引物，以羊肉、牛肉、豬肉、兔肉、鴿肉、鵪鶉肉、雞肉、鴨肉、鵝肉9種肉的DNA為模板，建立運(yùn)用PCR技術(shù)鑒別雞肉、鴿肉和鵪鶉肉的快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以市售合格的雞、鴨、鵝、豬、牛、羊、兔、鴿以及鵪鶉肉為材料，每種動(dòng)物樣品充分?jǐn)囁榛靹颍?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 采用離心柱式組織基因組DNA小量抽提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取總DNA。提取的總DNA樣品溶于100 μL洗脫液TE中，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)16S rDNA序列用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)篩選出各物種的特異性引物對(duì)，由上海生工生物工程有限公司合成。取適量引物用高壓滅菌后的超純水溶解，配制成10 μmol/L儲(chǔ)備液。引物序列、Tm值與擴(kuò)增片段大小詳見表1。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和檢測(cè) PCR擴(kuò)增體系（25 μL）：2×Tag Master Mix（南京博爾迪公司）12.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，模板1 μL，滅菌水10.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60～62 ℃30 s，72 ℃ 60 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 4 min。反應(yīng)完成后將PCR產(chǎn)物取出，利用1.5%低溶點(diǎn)瓊脂糖（Promega公司）凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序 PCR產(chǎn)物電泳后割膠回收純化，交由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，所有序列采用雙向測(cè)序，以便比對(duì)核實(shí)，測(cè)序結(jié)果與GenBank上已知序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同動(dòng)物PCR檢測(cè)結(jié)果

分別對(duì)每種動(dòng)物設(shè)計(jì)3對(duì)引物，經(jīng)過反應(yīng)條件優(yōu)化，并用同一種引物對(duì)所選擇的9種動(dòng)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終每種動(dòng)物篩選出一對(duì)特異性引物，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，具體見圖1。將PCR產(chǎn)物回收、純化、測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank上的已知序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示，雞的測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表序列（GenBank登錄號(hào)分別為AB086102.1、GU261713.1、GU261678.1）、鴿子的測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表序列（GenBank登錄號(hào)分別為X87858.1、KP258178.1）、鵪鶉的測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表序列（GenBank登錄號(hào)分別為AF302070.1、AB073301.1）的同源性均在99%以上，與預(yù)期結(jié)果基本一致，確定分別為雞肉、鴿肉和鵪鶉肉成分。

2.2 引物特異性分析

以羊肉、牛肉、豬肉、兔肉、鴿肉、鵪鶉肉、雞肉、鴨肉、鵝肉9種肉的DNA為模板，分別對(duì)所設(shè)計(jì)篩選的有關(guān)雞肉、鴿肉、鵪鶉肉的引物進(jìn)行特異性分析，具體見圖2。圖2中陽性對(duì)照分別為雞肉、鴿肉和鵪鶉肉。

由圖2可見，利用雞的引物，只有雞肉的DNA模板能擴(kuò)增出444 bp的目的條帶；利用鴿子的引物，只有鴿肉模板能擴(kuò)增出600 bp的目的條帶；利用鵪鶉的引物，只有鵪鶉肉的DNA模板能擴(kuò)增出767 bp的目的條帶。

3 討論

近年來，動(dòng)物源性食品摻假、過分添加各種添加劑、使用非食用性原料和成分等食品安全事件頻發(fā)。一項(xiàng)對(duì)近千種肉制品的檢測(cè)分析表明，有近20%的產(chǎn)品存在標(biāo)識(shí)與品種不完全相符的現(xiàn)象[2]。因此，建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，研究動(dòng)物源性食品安全檢測(cè)技術(shù)，對(duì)食品進(jìn)行動(dòng)物源性成分鑒定，有利于維護(hù)消費(fèi)者利益，保障人民生命安全，也有利于肉類產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為基礎(chǔ)的技術(shù)已逐步成為肉類種屬鑒定的核心方法。研究者根據(jù)不同物種基因序列的差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR反應(yīng)實(shí)現(xiàn)食品中特征基因片段的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，繼而通過電泳檢測(cè)鑒別食品中可能的物種來源。Girish等[6]基于線粒體12S rRNA基因，應(yīng)用PCR-RFLP成功鑒定了牛肉、水牛肉、綿羊肉及山羊肉。Ghovvati等[4]基于線粒體12S rRNA和16S rRNA基因應(yīng)用多重PCR技術(shù)對(duì)反芻動(dòng)物、家禽和豬進(jìn)行鑒別。Soares等[9]應(yīng)用雙重PCR在豬肉中成功檢測(cè)到禽肉。陳文炳等[10]應(yīng)用單重PCR和雙重PCR分別對(duì)食品中豬肉、牛肉、羊肉、雞肉等肉類成分進(jìn)行鑒定。陳冬等[11]利用牦牛、普通牛、水牛作為研究材料，在牛線粒體12S rRNA基因通用引物擴(kuò)增片段區(qū)域發(fā)現(xiàn)3個(gè)特異的酶切位點(diǎn)，可用于混合鮮牛肉及制品的牛種來源的鑒別。何瑋玲等[12]基于動(dòng)物線粒體細(xì)胞色素b基因的差異性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩組各5條長(zhǎng)度不同的多重PCR引物，建立并優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系，通過電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物分子量差異，實(shí)現(xiàn)4種肉類（豬肉、牛肉、羊肉和雞肉）的快速鑒別。王穎等[13]以豬線粒體12S rRNA基因序列為靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物和探針，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，建立了豬源性成分檢測(cè)方法。

本研究主要根據(jù)雞、鴿、鵪鶉線粒體基因組編碼基因16S rRNA序列的位點(diǎn)差異設(shè)計(jì)各物種特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，經(jīng)過多次反復(fù)試驗(yàn)，建立了快速、準(zhǔn)確的雞肉、鴿肉、鵪鶉肉PCR鑒定方法，該方法樣品用量少，反應(yīng)體系簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求不高，成本低廉，在下一步工作中，將開展16S rRNA序列熒光定量PCR技術(shù)，進(jìn)一步研發(fā)食品中不同動(dòng)物源性成分分析方法，為肉制品質(zhì)量安全控制探索新的途徑，為保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益提供技術(shù)支撐，并為保護(hù)肉類產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供技術(shù)監(jiān)督。

參考文獻(xiàn)：

[1] 何瑋玲，黃 明，張 馳.食品中肉類成分種屬鑒別技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2012，33（3）：304-307.

[2] BALLIN N Z，VOGENSEN F K，KARLSSON A H. Species determination-can we detect and quantify meat adulteration？[J]. Meat Science，2009， 83（2）：165-174.

[3] YIN R H， BAI W L， WANG J M， et al. Development of an assay for rapid identification of meat from yak and cattle using polymerase chain reaction technique[J]. Meat Science，2009， 83（1）：38-44.

[4] GHOVVATI S，NASSIRI M R，MIRHOSEINI S Z，et al. Fraud identification in industrial meat products by multiplex PCR assay[J].Food Control，2009，20（8）：696-699.

[5] 陳 冬，柏 凡，周明亮，等.基于線粒體12S rRNA基因鑒別混合牛肉及制品的牛種來源[J].遺傳，2008，30（8）：1008-1014.

[6] GIRISH P S，ANJANEYULU A S R，VISWAS K N，et al. Meat species identification by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP） of mitochondrial 12S rRNA gene[J]. Meat Science，2005，70（1）：107-112.

[7] MURUGAIAH C， NOOR Z M， MASTAKIM M， et al. Meat species identification and Halal authentication analysis using mitochondrial DNA[J]. Meat Science，2009，83（1）：57-61.

[8] MANE B G， MENDIRATTA S K， TIWARI A K. Polymerase chain reaction assay for identification of chicken in meat and meat products[J]. Food Chemistry，2009，116（3）：806-810.

[9] SOARES S，AMARAL J S，MAFRA I，et al. Quantitative detection of poultry meat adulteration with pork by a duplex PCR assay[J].Meat Science，2010，85（3）：531-536.

[10] 陳文炳，邵碧英，廖憲彪，等.加工食品中若干動(dòng)物成分的PCR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用研究[J].食品科學(xué)，2005，26（8）：338-342.

[11] 陳 冬，柏 凡，周明亮，等.基于線粒體12S rRNA基因鑒別混合牛肉及制品的牛種來源[J].遺傳，2008，30（8）：1008-1014.

[12] 何瑋玲，張 馳，楊 靜，等.食品中4種肉類成分多重PCR的快速鑒別方法[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（9）：1873-1880.

[13] 王 穎，史艷宇，劉金華，等.熒光定量PCR方法檢測(cè)畜肉食品中豬源性成分[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2013，4（5）：1529-1534.