鴨FMO3基因魚(yú)腥味敏感位點(diǎn)的檢測(cè)

摘要：畜禽產(chǎn)品的魚(yú)腥味問(wèn)題嚴(yán)重影響肉蛋奶產(chǎn)品的風(fēng)味和人們對(duì)畜禽產(chǎn)品的接受能力，F(xiàn)MO3基因的突變會(huì)引發(fā)魚(yú)腥味綜合征。通過(guò)DNA池和測(cè)序技術(shù)檢測(cè)導(dǎo)致雞蛋、鵪鶉蛋產(chǎn)生魚(yú)腥味的FMO3基因敏感位點(diǎn)在鴨中是否存在，尋找鴨蛋魚(yú)腥味產(chǎn)生的原因。結(jié)果表明，在鴨FMO3基因第7外顯子，共檢測(cè)到6個(gè)SNPs，均為同義突變，在FATGY高度保守區(qū)未檢測(cè)到堿基突變，即導(dǎo)致雞蛋和鵪鶉蛋產(chǎn)生魚(yú)腥味的FMO3基因敏感位點(diǎn)在鴨中并沒(méi)有檢測(cè)到。

關(guān)鍵詞：鴨；FMO3基因；突變；魚(yú)腥味

中圖分類號(hào)：Q78；S834 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）15-4018-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.055

Abstract： Fish-odour in meat，cow milk and eggs seriously affect the flavor and reception ability of domestic animal products.The fish-odour syndrome is due to the loss-of function mutation in FMO3 gene. DNA pooling and sequencing were used to screen the mutation site of FMO3 gene，which leaded to the fishy off-flavor in chicken and quail eggs，thus exploring the cause of fish-odour in duck eggs. The results showed that 6 synonymous mutations were detected in exon 7，and no SNPs in highly conserved region（FATGY motif） of duck FMO3 gene. It indicated that the mutation site leading to the fishy off-flavor in chicken and quail eggs was not observed in duck.

Key words： duck； FMO3 gene； mutation； fish-odour

人與動(dòng)物肝臟中的含黃素單氧化酶（Flavin-containing monooxygenase 3，F(xiàn)MO3）可促進(jìn)食物中的三甲胺（Trimethylamine，TMA）氧化成無(wú)氣味的N-氧化三甲胺（Trimethylamine N-oxide，TMAO）隨體液排出體外[1]。FMO3基因的突變可導(dǎo)致三甲胺氧化能力下降，隨體液排出的三甲胺產(chǎn)生濃重的魚(yú)腥味，即引發(fā)魚(yú)腥味綜合征[2]。魚(yú)腥味綜合征在人類中是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳疾病，現(xiàn)已證實(shí)人FMO3基因的兩個(gè)無(wú)義突變（E305X和E314X）會(huì)導(dǎo)致黃素單氧化酶完全失活，進(jìn)而引起人類魚(yú)腥味綜合征[3]；牛奶中的魚(yú)腥味與FMO3基因R238X無(wú)義突變有關(guān)[4，5]；在褐殼蛋中魚(yú)腥味綜合征較為明顯，這是由雞FMO3基因FATGY高度保守區(qū)的一個(gè)錯(cuò)義突變（T329S）引起的[6]；當(dāng)飼料中含有魚(yú)粉、菜子粕或過(guò)量的膽堿時(shí)，極易誘發(fā)帶有這種基因缺陷的蛋雞產(chǎn)生魚(yú)腥味雞蛋[7，8]。魚(yú)腥味雞蛋中三甲胺含量是正常雞蛋（0.1 μg/g）的10倍以上，三甲胺的沉積會(huì)產(chǎn)生非常難聞的氣味，嚴(yán)重降低了雞蛋的品質(zhì)和口感。德國(guó)羅曼公司已將T329S突變位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記應(yīng)用于魚(yú)腥味綜合征性狀的選擇并成功建立了無(wú)魚(yú)腥味蛋雞群體。隨后，在鵪鶉中也發(fā)現(xiàn)FMO3基因FATGY高度保守區(qū)存在錯(cuò)義突變（T329I），可能會(huì)產(chǎn)生類似于雞中的遺傳效應(yīng)；同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與鵪鶉蛋中TMA含量高度相關(guān)的Q319X無(wú)義突變，該突變至少降低了FMO3酶40%的活性，引起魚(yú)腥味鵪鶉蛋的出現(xiàn)[9]。

畜禽產(chǎn)品的魚(yú)腥味問(wèn)題嚴(yán)重影響肉蛋奶產(chǎn)品的風(fēng)味和人們對(duì)畜禽產(chǎn)品的接受能力。本試驗(yàn)旨在通過(guò)分子遺傳手段，檢測(cè)導(dǎo)致雞蛋、鵪鶉魚(yú)腥味的FMO3基因突變位點(diǎn)在鴨中是否存在，以期從遺傳角度控制鴨蛋中魚(yú)腥味的出現(xiàn)，為鴨蛋品質(zhì)的選育及今后無(wú)魚(yú)腥味基因蛋鴨群體的建立提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 DNA池構(gòu)建

櫻桃谷鴨、北京鴨、連城白鴨、白改鴨、野鴨、康貝爾鴨、山麻鴨、紹興鴨、縉云麻鴨及荊江麻鴨的血樣DNA由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院家禽實(shí)驗(yàn)室提供。同一個(gè)品種30個(gè)DNA樣品同濃度等體積混合構(gòu)建品種DNA池。

1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR反應(yīng)

根據(jù)鴨FMO3基因序列信息（NW_004676298、XM_005008854），采用Primer Preimer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物：F6L（5′-TGTCGGTCCCAGATGG-3′）、F7R（5′-CCTTACTTGGTCCATGCA-3′），擴(kuò)增FMO3基因FATGY高度保守區(qū)所在的整個(gè)外顯子區(qū)域（片段大小為458 bp）。利用構(gòu)建的DNA池進(jìn)行PCR反應(yīng)。15 μL反應(yīng)體系中含10×Buffer（含Mg2+）1.5 μL、dNTP（10 mmol/μL）0.3 μL、上/下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL及模板DNA 1.0 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.3 測(cè)序及分析

將PCR產(chǎn)物委托武漢擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化測(cè)序，利用DNA STAR軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨FMO3基因擴(kuò)增結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，獲得了458 bp的片段（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致，條帶清晰且單一，可直接進(jìn)行回收測(cè)序。

2.2 測(cè)序分析

測(cè)序結(jié)果顯示，共檢測(cè)到6個(gè)SNPs（圖2），均為堿基轉(zhuǎn)換，其中4個(gè)SNPs分別引起了MspⅠ、BccⅠ、TaiⅠ和AvaⅡ酶切位點(diǎn)的改變（表1）。這6個(gè)SNPs均為同義突變，未引起氨基酸的改變。在FMO3基因FATGY高度保守區(qū)未檢測(cè)到突變。

3 討論

雞蛋的魚(yú)腥味問(wèn)題一直困擾著蛋雞生產(chǎn)者和研究者。根據(jù)對(duì)人和牛研究結(jié)果，F(xiàn)MO3基因突變能夠引起魚(yú)腥味綜合征，研究者通過(guò)對(duì)雞FMO3基因進(jìn)行測(cè)序，共檢測(cè)出17個(gè)多態(tài)位點(diǎn)；通過(guò)多態(tài)位點(diǎn)和魚(yú)腥味綜合征的連鎖分析發(fā)現(xiàn)，只有位于編碼區(qū)第984個(gè)堿基位置的突變與蛋雞魚(yú)腥味綜合征顯著相關(guān)[6]。該突變導(dǎo)致FMO3蛋白的第329個(gè)氨基酸由蘇氨酸（T）變成絲氨酸（S），因此定義該突變位點(diǎn)為T(mén)329S。研究表明，該位點(diǎn)對(duì)于FMO3基因發(fā)揮正常功能是必不可少的[10]。因遺傳背景及選育程度等因素影響，T329S突變位點(diǎn)在各雞種中的分布不同。該位點(diǎn)已被德國(guó)羅曼公司作為遺傳標(biāo)記應(yīng)用于對(duì)魚(yú)腥味綜合征性狀的選擇，即通過(guò)基因檢測(cè)將該突變基因從育種群體中剔除。在鵪鶉FMO3基因第7外顯子FATGY高度保守區(qū)檢測(cè)到可能影響FMO3酶活性的T329I錯(cuò)義突變[9]。本研究在鴨FMO3第7外顯子上共檢測(cè)到6個(gè)SNPs，均為同義突變，并未引起氨基酸的改變，其中5個(gè)與WANG等[11]的檢測(cè)結(jié)果一致。在特別關(guān)注的FATGY高度保守區(qū)未檢測(cè)到堿基突變，即導(dǎo)致禽類的雞蛋和鵪鶉產(chǎn)生魚(yú)腥味的FMO3基因敏感位點(diǎn)在鴨中并沒(méi)有檢測(cè)到，鴨蛋魚(yú)腥味可能與FMO3基因其他區(qū)域有關(guān)或與其他基因有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] DOLPHIN C T，JANMOHAMED A，SMITH R L，et al. Missense mutation in flavin-containing mono-oxygenase 3 gene，F(xiàn)MO3， underlies fish-odour syndrome[J]. Nat Genet，1997，17（4）：491-494.

[2] HERNANDEZ D，ADDOU S，LEE D，et al. Trimethylaminuria and a human FMO3 mutation database[J].Hum Mutat，2003， 22（3）：209-213.

[3] CASHMAN J R，BI Y A，LIN J，et al. Human flavin-containing monooxygenase form 3：cDNA expression of the enzymes containing amino acid substitutions observed in individuals with trimethylaminuria[J].Chem Rex Toxicol，1997，10（8）：837-841.

[4] LUNDEN A，MARKLUND S，GUSTAFSSON V，et al. A nonsense mutation in the FMO3 gene underlies fishy off-flavor in cow's milk[J].Genome Res，2002，12（12）：1885-1888.

[5] LUNDEN A，GUSTAFSSON V，IMHOF M，et al. High trimethylamine concentration in milk from cows on standard diets is expressed as fishy off-flavour[J].J Dairy Res，2002，69（3）：383-390.

[6] HONKATUKIA M，REESE K，PREISINGER R，et al. Fishy taint in chicken eggs is associated with a substitution within a conserved motif of the FMO3 gene[J].Genomics，2005，86（2）：225-232.

[7] 王 晶. FMO3基因型和膽堿對(duì)雞蛋三甲胺含量影響的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[8] WANG J，WU S G，ZHANG H J，et al. Trimethylamine deposition in the egg yolk from laying hens with different FMO3 genotypes[J]. Poult Sci，2013，92（3）：746-752.

[9] MO F，ZHENG J，WANG P，et al. Quail FMO3 gene cloning， tissue expression profiling， polymorphism detection and association analysis with fishy taint in eggs[J]. PLoS One，2013， 8（11）：e81416.

[10] ZHAO Y，CHRISTENSEN S K，F(xiàn)ANKHAUSER C，et al. A role for flavin monooxygenase-like enzymes in auxin biosynthesis[J]. Science，2001，291（5502）：306-309.

[11] WANG P，ZHENG J X，QU L J，et al. Molecular cloning，sequence characterization，SNP detection，and tissue expression analysis of duck FMO3 gene[J]. Mol Cell Biochem，2013， 379（1-2）：141-151.