地黃類RghBNG基因的克隆與生物信息學(xué)分析

摘要：RghBNG基因是一種地黃（Rehmannia glutinosa）響應(yīng)非生物脅迫和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的基因。類RghBNG基因是一個(gè)與RghBNG基因核酸序列同源的地黃基因?？寺×说攸S類RghBNG基因，預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能。用RNA提取試劑盒提取地黃總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)已知地黃的RghBNG基因堿基序列設(shè)計(jì)上、下游引物，以cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)生包括RghBNG基因和類RghBNG基因在內(nèi)的5個(gè)cDNA片段，其中類RghBNG基因全長(zhǎng)1 974 bp，包含一個(gè)486 bp的ORF，編碼161個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為9.45，分子量為18.6 kDa， 二級(jí)結(jié)構(gòu)中延伸鏈占34.78%，無(wú)規(guī)則卷曲占33.54%，α-螺旋占21.74%，β-螺旋占9.94%，有兩個(gè)可能的跨膜區(qū)，參與翻譯和脂肪酸代謝。

關(guān)鍵詞：地黃（Rehmannia glutinosa）；RghBNG基因；類RghBNG基因；RT-PCR；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：Q81 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）15-4014-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.054

Abstract： RghBNG gene is a novel abiotic stress and plant growth regulator-responsive gene from Rehmannia glutinosa，while RghBNGLgene is RghBNG-like gene homologous to RghBNG gene at the nucleotide level. RghBNG-like gene was successfully cloned from Rehmannia glutinosa，and predicted byabioinformatics softwares. The total RNA was extracted from Rehmannia glutinosa leaves with RNA extraction kit，and then used as reverse transcriptional template to clone RghBNG-like gene with the same primer pair as that for RghBNG gene. RghBNG-like gene was 1 974 bp long，including a 486 bp ORF，encoding for 161 amino acid residues. The protein isoelectric point and molecular weight are 9.45 and 18.6 kDa. Its secondary structure consists of 34.78% extended strand，33.54% random coil，21.74% alpha helix and 9.94% β-turn. It has two transmembrane helical segments and takes part in translation and fatty acid metabolism.

Key words： Rehmannia glutinosa； RghBNG gene； RghBNG-like gene； RT-PCR； bioinformatics analysis

地黃（Rehmannia glutinosa）是“四大懷藥”之一，為玄參科地黃屬多年生草本植物[1]，廣泛分布于河南、河北、山東、山西、湖南以及韓國(guó)、日本等地[2]。由于特有的土壤、氣候條件以及市場(chǎng)影響逐漸形成了以河南武陟、博愛(ài)、孟縣、溫縣為中心的黃河流域種植區(qū)，其中“懷地黃”（也稱“懷參”）最為著名[3]。按照其炮制方法的不同，可將其分為鮮地黃、干地黃與熟地黃，富含梓醇、糖類、生物堿、維生素、多種氨基酸以及鐵、磷等成分，可用于治療頭暈、糖尿病、貧血、便秘、泌尿系統(tǒng)等，還具有防癌、抗癌、增強(qiáng)免疫力、增強(qiáng)造血能力等功能[2，4]。同時(shí)地黃也有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]，在藥劑中，地黃的使用量占了很大的比重（如六味地黃丸、知柏地黃丸和杞菊地黃丸等）。在保健方面也已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了一些含有地黃成分的產(chǎn)品（如地黃精、地黃茶和地黃醋等）。

目前，有關(guān)地黃基因的克隆、功能分析與表達(dá)模式的研究已有報(bào)道，如采用RT-PCR方法克隆地黃的肌動(dòng)蛋白基因片段[6]；采用SSH方法從地黃的塊根中克隆RgPR-10基因[7]；采用同源克隆的方法從地黃中分離得到4個(gè)不同的cDNA全長(zhǎng)序列和5個(gè)cDNA序列片段，涉及脫落酸、赤霉素、水蘇糖、蔗糖合成和代謝的關(guān)鍵酶，并對(duì)這些基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析[8]；用生物信息學(xué)技術(shù)、Solexa測(cè)序技術(shù)以及熒光定量PCR分析技術(shù)，成功地在正茬和重茬地黃中鑒定了89個(gè)miRNAs[9，10]。張永華[11]對(duì)地黃RgVP、RghKAT和RgKAT基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，表明地黃RghBNG基因（GenBank登錄號(hào)JX290370），全長(zhǎng)548 bp，包含了282 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼93個(gè)氨基酸，與B12D蛋白質(zhì)同源。張喻[12]克隆了RghBNG的同源基因和啟動(dòng)子序列，研究了RghBNG的亞細(xì)胞定位，分析了在非生物因素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑下RghBNG基因的表達(dá)。類RghBNG基因是一個(gè)與RghBNG基因的核酸序列同源的地黃基因。本試驗(yàn)對(duì)地黃類RghBNG基因進(jìn)行克隆與生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能，為地黃遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 地黃 品種溫85-5，由溫縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

1.1.2 試劑和儀器 大腸桿菌DH5α菌株、LA Taq DNA聚合酶、克隆載體pMD19-T Vector、RNA提取主要試劑、DNA凝膠回收試劑盒、DNA Marke、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、NaCl、NaOH、氨芐青霉素、CaCl2、瓊脂糖甘油、SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒。滅菌鍋、天平、移液槍、水浴鍋、離心機(jī)、超微量分光光度計(jì)、PCR儀、電泳儀、電泳槽、凝膠成像分析系統(tǒng)、制冰機(jī)、蛋白電泳設(shè)備、超低溫冰箱、超凈工作臺(tái)、HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱、LRH-250A型生化培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成以及目的基因PCR 根據(jù)已經(jīng)報(bào)到的地黃RgBNG基因的堿基序列[11]，使用Primer 5.0軟件合成引物：上游引物F（5′-CGCGGATCCATAATGGCTTCATCCACC-3′），下游引物R （5′-CCGCTCGAGCAGTAAAGCATTCATCTC-3′），用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段，DNA凝膠回收試劑盒對(duì)其進(jìn)行回收和純化，測(cè)序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.2 基因序列的生物信息學(xué)分析 基于克隆cDNA序列，利用NCBI的ORF Finder軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析基因的開(kāi)放閱讀框，并進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯；利用ExPASy軟件中的ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸的組成、等電點(diǎn)、分子量、負(fù)電荷殘基、正電荷殘基等；利用SOPMA軟件（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl？page=NPSA/npsa sopma. html）進(jìn)行該基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析；利用http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/進(jìn)行該基因信號(hào)肽的預(yù)測(cè)；利用Profun 2.2 Server軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun）進(jìn)行該基因蛋白質(zhì)功能的預(yù)測(cè)；利用TMpred工具（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）預(yù)測(cè)跨膜區(qū)和跨膜方向。

2 結(jié)果與分析

2.1 類RgBNG基因的RT-PCR擴(kuò)增

利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增地黃類RgBNG基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果擴(kuò)增出5條條帶（圖1）。

2.2 地黃類RghBNGL基因的克隆和測(cè)序

從圖1中回收和純化1、2條帶，與pMD19-T載體在4 ℃下連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)。將檢測(cè)為陽(yáng)性菌落的懸液送去生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，結(jié)果表明條帶1為大小為1 974 bp，命名為類RghBNGL基因，而條帶2大小為548 bp，為RghBNG基因。

2.3 地黃類RghBNGL基因的生物信息學(xué)分析

2.3.1 地黃類RghBNGL基因的ORF分析 利用ORF Finder軟件對(duì)地黃類RghBNGL基因1 974 bp的堿基序列進(jìn)行分析，找到1個(gè)486 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼161個(gè)氨基酸（圖2）。

2.3.2 地黃類RghBNGL基因編碼氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用ExPASy中ProtScale分析該基因編碼蛋白的氨基酸的組成、等電點(diǎn)、分子量、負(fù)電荷殘基等，并對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如表1所示。

利用SOPMA軟件進(jìn)行該基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析（圖3、表2），結(jié)果顯示延伸鏈所占的比例最高為34.78%，其次是無(wú)規(guī)則卷曲，所占比例為33.54%，還有α-螺旋所占比例為21.74%，最低的是β-螺旋，所占比例為9.94%。

2.3.3 地黃RghBNGL蛋白質(zhì)疏水性/親水性分析 地黃RghBNGL蛋白質(zhì)疏水性/親水性的分析結(jié)構(gòu)如圖4所示。第71位具有最高分值，為3.512，疏水性最強(qiáng)；第129位具有最低分值，為-3.056，親水性最強(qiáng)。GRAVY值為0.242，所以推測(cè)地黃RghBNGL蛋白質(zhì)是一種疏水蛋白質(zhì)。

2.3.4 地黃RghBNGL蛋白質(zhì)的功能預(yù)測(cè) 地黃類RghBNGL蛋白的功能預(yù)測(cè)結(jié)果（表3）表明，該蛋白質(zhì)的最主要功能指向脂肪酸新陳代謝，也可能參與了翻譯等過(guò)程。

2.3.5 地黃類RghBNGL蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析 利用TMpred工具預(yù)測(cè)地黃類RghBNGL蛋白質(zhì)可能的跨膜螺旋區(qū)和跨膜方向，結(jié)果如圖5所示，有兩個(gè)可能的跨膜區(qū)，第一個(gè)模型是從外到內(nèi)的，氨基酸的起始位置分別為39、58、87，終止的位置分別為56、76、105，長(zhǎng)度分別為18、19、19，分值分別為1 549、 2 107、999（圖5）。

3 小結(jié)與討論

分離與克隆功能基因是研究基因的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)調(diào)控以及分子機(jī)理的基礎(chǔ)，也是生命科學(xué)研究的重點(diǎn)之一。RT-PCR是分離與克隆功能基因的有效方法，具有快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。研究者采用RT-PCR技術(shù)已經(jīng)成功克隆了多種植物的多個(gè)基因[10，13，14]，比如侯嶸等[15]克隆了麻瘋樹(shù)鯊烯合酶基因SQS；徐大偉等[16]克隆了棉花八氫番茄紅素脫氫酶GhPDS1基因；任磊等[17]克隆了牡丹開(kāi)花相關(guān)基因PsAP1；Padilla等[18]克隆了橄欖的6-脂氧合酶基因。本研究根據(jù)克隆的地黃類RghBNG基因序列設(shè)計(jì)引物，利用地黃RNA作模板，采用RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果出現(xiàn)5條條帶，對(duì)其中最大條帶的類RghBNG基因生物信息學(xué)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其包含1個(gè)編碼161個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框，為疏水性非分泌型堿性蛋白質(zhì)，參與脂肪酸新陳代謝和蛋白質(zhì)合成，為進(jìn)一步研究其蛋白質(zhì)基因結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控以及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 周延清，張永華，陳艷梅，等.懷地黃未知液泡質(zhì)子泵焦磷酸水解酶基因的克隆與生物信息學(xué)分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（3）：107-111，114.

[2] KIM Y S，RYUK J A，KO B S. Discrimination of Korean Rehmannia glutinosa from Chinese Rehmannia glutinosa using sequence-characterized amplified region marker[J]. Korean Soc Appl Biol Chem，2012，55：1-6.

[3] ZHOU Y Q，GU F P，ZHOU C N，et al. Genetic diversity of Rehmannia glutinosa cultivars based on sequence-related amplified polymorphism markers[J]. Scient Horticult，2010，125：789-794.

[4] PENG S，GUO Y H，QI J J，et al. Isolation and expression analysis of tuberous root development related genes in Rehmannia glutinosa[J].Mol Biol Rep，2010，37（2）：1069-1079.

[5] YANG Y H，CHEN X J，CHEN J Y，et al. Differential miRNA expression in Rehmannia glutinosa plants subjected to continuous cropping[J].BMC Plant Biol，2011，11：1-11.

[6] 孫 鵬，郭玉海，祁建軍，等.地黃肌動(dòng)蛋白基因片段的克隆與序列分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（20）：8470-8471.

[7] 周延清，姚煥靈，段紅英，等.懷地黃基因片段及其中轉(zhuǎn)座酶基因的克隆與序列分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（1）：106-109.

[8] 侯維海.地黃ABA、GA和部分寡糖合成代謝關(guān)鍵酶基因克隆與表達(dá)分析[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[9] 臧亞超，孫 鵬，楊太新，等.地黃擴(kuò)展蛋白基因RgExpA1的克隆與表達(dá)分析[J].生物技術(shù)通報(bào)，2012，15（7）：420-425.

[10] 張 嵐，李慶章.新基因功能研究的整體策略[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38（5）：109-113.

[11] 張永華.地黃基因RgVP、RghKAT、RglKAT與RghBNG的克隆和表達(dá)[D].河南新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué)，2013.

[12] 張 喻.地黃RghBNG基因的結(jié)構(gòu)分析和功能驗(yàn)證[D].河南新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué)，2014.

[13] 樊惠華，王麗娟，姚新靈.植物基因識(shí)別及克隆策略研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2011，22（4）：589-592.

[14] 李少鋒，蘇曉華，張冰玉.林木基因克隆研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào)，2011，46（1）：79-107.

[15] 侯 嶸，龔諾希，劉法濤，等.麻瘋樹(shù)鯊烯合酶基因SQS的克隆及生物信息學(xué)分析[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2011，19（5）：391-399.

[16] 徐大偉，張雨良，檀根甲.棉花八氫番茄紅素脫氫酶GhPDS1基因的克隆與表達(dá)譜分析[J].棉花學(xué)報(bào)，2011，23（3）：200-204.

[17] 任 磊，王 雁，周 琳，等.牡丹開(kāi)花相關(guān)基因PsAP1的克隆與表達(dá)[J].西北植物學(xué)報(bào)，2011，31（9）：1719-1725.

[18] PADILLA M N，LUISA HERN？魣NDEZ M，SANZ C，et al. Molecular cloning，functional characterization and transcriptional regulation of a 9-lipoxygenase gene from olive[J].Phytochemistry，2012，74：58-68.