表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選與優(yōu)化及其產(chǎn)物性質(zhì)的分析

摘要：從被石油污染的土壤中用藍(lán)色凝膠培養(yǎng)基分離篩選出1株產(chǎn)糖脂類生物表面活性劑的菌株B2。經(jīng)生理生化試驗(yàn)與16S rDNA序列分析將該菌株鑒定為沙雷氏菌屬（Serratia sp.）。經(jīng)紅外光譜與薄層層析分析，結(jié)果表明該菌株產(chǎn)生的表面活性劑是一種鼠李糖脂。以發(fā)酵液的表面張力為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵條件，即以20 g/L豆油為碳源、5 g/L尿素為氮源、溫度34 ℃、pH 7.0、發(fā)酵時(shí)間96 h。在此最佳條件下測(cè)得表面活性劑的產(chǎn)量為3.746 1 g/L。該菌株所產(chǎn)表面活性劑水溶液在其濃度為臨界膠束濃度時(shí)的表面張力為180 mN/m。

關(guān)鍵詞：生物表面活性劑；表面張力；產(chǎn)率；最佳發(fā)酵條件

中圖分類號(hào)：Q935 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）15-3980-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.045

Abstract： A biosurfactant-producing bacteria， strain B2，was isolated by blue agar plate from the contaminated soil in Jilin oilfield. Through the analyses of physiological， and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence， the strain B2 preliminarily identified as Serratia sp. The analysis recults of infrared spectral and thin-layer chromatography analysis indicated that the biosurfactant produced by strain was a kind of rhamnolipid. The surface tension of fermentation solution as the index， the optimum fermentation conditions were obtained by orthogonal test. The optimum fermentation conditions were 20 g/L soybean oil as carbon source，5 g/L urea as nitrogen source，temperature of 34 ℃， pH of 7.0 and fermentation time of 96 h. Under the optimal fermentation conditions， the yield of biosurfactant produced by the strain could reach 3.746 1 g/L. The critical micelle concentration of biosurfactant solution was 180 mN/m.

Key words： biosurfactant； surface tension； yield； optimal fermentation conditions

生物表面活性劑由微生物發(fā)酵產(chǎn)生，是一種生物大分子物質(zhì)且具有表面活性[1]。微生物發(fā)酵得到的生物表面活性劑結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類較多，包括磷脂、脂肽、糖脂、脂蛋白等[2]。此類物質(zhì)在農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)、化妝品、醫(yī)藥、生物環(huán)境修復(fù)、石油工業(yè)和水處理等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[2，3]。尤其在微生物采油和石油烴污水處理領(lǐng)域應(yīng)用較多。在石油的開發(fā)、使用以及運(yùn)輸過程中，難免造成石油泄漏，石油浸入土壤污染生活用水，這無(wú)疑是對(duì)自然環(huán)境與人類生存的巨大挑戰(zhàn)。自然界中存在大量可以降解石油烴的微生物，但是由于石油烴的疏水性阻礙了其在水中的分散程度，使微生物無(wú)法與石油烴有效接觸，導(dǎo)致無(wú)法對(duì)其進(jìn)行快速而充分地降解。油的乳化可提高油滴的分散程度，使微生物與油滴更容易接觸，從而促進(jìn)微生物對(duì)石油烴的降解[4]。一般情況下，化學(xué)合成的表面活性劑不容易自然降解，容易形成新的污染，但是，生物表面活性劑不但乳化效果明顯而且易于自然降解。

生物表面活性劑雖然具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是其較高的生產(chǎn)成本和較低的產(chǎn)率是其致命的弱點(diǎn)。所以降低生產(chǎn)成本、選育可高效產(chǎn)表面活性劑的菌株以及發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化是目前研究的重點(diǎn)[5]。本試驗(yàn)篩選出一株高效表面活性劑產(chǎn)生菌并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為表面活性劑的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采自吉林油田（松原市）中多處被石油污染的土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 10.0 g、KCl 1.1 g、NaCl 1.1 g、MgSO4 0.5 g、KH2PO4 3.4 g、K2HPO4 4.4 g、酵母膏0.5 g、菜油20 g、微量元素溶液5.0 mL，pH 7.0，去離子水1 L，高壓蒸汽滅菌[5]。

微量元素溶液：ZnSO4 0.29 g、CaCl2 0.24 g、CuSO4 0.25 g、MgSO4 0.17 g、去離子水1 L[6]。

藍(lán)色凝膠培養(yǎng)基：牛肉膏1.0 g、蛋白陳5.0 g、酵母膏0.2 g、葡萄糖20.0 g、十六烷基三甲基溴化胺0.2 g、亞甲基藍(lán)0.005 g、瓊脂18.0 g、去離子水1 L，高壓蒸汽滅菌[7]。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂18.0 g，pH 7.0～7.5，去離子水1 L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：與富集培養(yǎng)基相同。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 富集培養(yǎng) 在6個(gè)土樣中分別取5 g土樣溶于95 mL去離子水中，在200 r/min、室溫條件下，搖床振蕩2 h，然后靜置1 h。無(wú)菌條件下取上清液10 mL接種到90 mL的富集培養(yǎng)基中，并于200 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)3 d。再取此菌液5 mL接入新的富集培養(yǎng)基中，重復(fù)3次，繼代培養(yǎng)，獲得以表面活性劑產(chǎn)生菌為優(yōu)勢(shì)種的菌液。

1.2.2 菌株篩選與純化 藍(lán)色凝膠平板篩選法：在藍(lán)色凝膠平板上將富集液進(jìn)行稀釋涂布，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察并挑選出菌落周圍藍(lán)圈較大且生長(zhǎng)比較旺盛的菌株[7]。挑取產(chǎn)生藍(lán)圈且生長(zhǎng)旺盛的單菌落，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上采用平板劃線法，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d得到單菌落。再重復(fù)劃線培養(yǎng)2次，最終可以得到純化的菌株。將得到的菌株用牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基在30 ℃條件下培養(yǎng)3 d后，于4 ℃冰箱中保藏。

1.2.3 菌株鑒定 將最終得到的菌株通過形態(tài)學(xué)分析與生理生化試驗(yàn)鑒定，再經(jīng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基連續(xù)多次平板繼代后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行16S rDNA序列分析。

1.2.4 生物表面活性劑的提取 將培養(yǎng)3～4 d后的發(fā)酵液于4 ℃條件下6 000 r/min離心40 min，除去菌體保留上清液；上清液用濃鹽酸調(diào)至pH 2.0，4 ℃靜置過夜后可出現(xiàn)絮狀沉淀；4 ℃ 10 000 r/min離心30 min，保留沉淀，用pH 2.0的鹽酸全部洗下，再用1 mol/L的NaOH溶液將pH調(diào)至7.0，冷凍干燥后，即可得到疏松狀黃褐色的粗產(chǎn)品；將粗產(chǎn)品用CH2Cl2進(jìn)行萃取，減壓蒸餾后溶于0.01 mol/L的NaOH溶液，過濾；將上清液用濃鹽酸調(diào)pH至2.0，再次出現(xiàn)沉淀時(shí)，于10 000 r/min、4 ℃條件下離心30 min，保留沉淀且再次冷凍干燥，即可得到純化的生物表面活性劑[8]。

1.2.5 生物表面活性劑的分析鑒定 將提取的生物表面活性劑進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析、薄層層析（TLC）分析。將提取的表面活性劑用去離子水分別配制成濃度為20、40、60、500 mg/L。在常溫下分別測(cè)定其水溶液的表面張力，得出其臨界膠束濃度。

1.2.6 單因素試驗(yàn)

1）不同碳源對(duì)發(fā)酵液表面張力的影響。將發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源分別換成淀粉、葡萄糖、豆油、石蠟油和正丁醇，每種碳源濃度分別設(shè)置為5、10、15、20、25、30 g/L，配制30種發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后在200 r/min、30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d，分別測(cè)定每種發(fā)酵液的表面張力。

2）不同氮源對(duì)發(fā)酵液表面張力的影響。將碳源試驗(yàn)中獲得的最佳碳源作為選定碳源，然后將發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源分別換成NaNO3、NH4NO3、NH4Cl、（NH4）2SO4和尿素，每種氮源濃度分別設(shè)置為5、10、15、20、25、30 g/L，配制30種富集培養(yǎng)基，接種后在200 r/min、30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d，分別測(cè)定每種發(fā)酵液的表面張力。

3）初始pH對(duì)發(fā)酵液表面張力的影響。選確定的最佳碳氮源進(jìn)行試驗(yàn)，分別以pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0作為初始pH，接種后在200 r/min、30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d，分別測(cè)定每種發(fā)酵液的表面張力。

4）發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液表面張力的影響。發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)為48、72、96、120、144 h。接種后在200 r/min、30 ℃、pH 7.0條件下?lián)u床培養(yǎng)3 d，分別測(cè)定每種發(fā)酵液的表面張力。

5）發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液表面張力的影響。發(fā)酵溫度分別設(shè)為25、28、31、34、37 ℃。接種后在200 r/min、pH 7.0條件下?lián)u床培養(yǎng)96 h后，分別測(cè)定每種發(fā)酵液的表面張力。

1.2.7 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響較大的4個(gè)因素（豆油濃度、尿素濃度、培養(yǎng)溫度和初始pH），每個(gè)因素取3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)因素和水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離篩選

通過富集培養(yǎng)和篩選，在6個(gè)土樣中得到6株初篩菌株。這6株菌株在相同條件下經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，測(cè)定其發(fā)酵液的表面張力。經(jīng)過復(fù)篩，得到1株生長(zhǎng)最旺盛、發(fā)酵液表面張力為29.7 mN/m的菌株，命名為B2。

2.2 生物表面活性劑產(chǎn)生菌的鑒定

試驗(yàn)表明，菌株B2呈淡黃色，大小適中，直徑1.0～2.0 mm，邊緣整齊，半透明，表面濕潤(rùn)。經(jīng)顯微鏡觀察，菌體短桿狀，無(wú)芽孢。經(jīng)革蘭氏染色試驗(yàn)鑒定為陰性。菌株B2的生理生化特征見表2。根據(jù)生理生化結(jié)果初步鑒定，菌株B2為沙雷氏菌屬（Serratia sp.）。

利用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)約1.4 kb的目的片段，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。通過測(cè)序，菌株B2的16S rDNA序列共1 441 bp，將該測(cè)序結(jié)果與GenBank中現(xiàn)有的菌種16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株B2與多株沙雷氏菌的16S rDNA核酸序列的同源性高達(dá)99%以上，依據(jù)此結(jié)果，再結(jié)合生理生化試驗(yàn)與形態(tài)學(xué)觀察，最終確定菌株B2屬于沙雷氏菌屬（Serratia sp.）。

2.3 生物表面活性劑的傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析

生物表面活性劑的FT-IR分析結(jié)果見圖2。圖2中的多處吸收峰表明該分子中存在大量-CH2、

-OH、C=C不飽和雙鍵、C=O和C-O-C鍵，分子中還存在環(huán)狀內(nèi)酯結(jié)構(gòu)和糖苷鍵；C=O的存在，表明該生物表面活性劑為不飽和脂肪和芳香類化合物，且該分子中有不飽和糖脂類物質(zhì)，其中糖基端為親水基端，環(huán)酯類的碳鏈為疏水基端?？沙醪綌喽ㄔ撋锉砻婊钚詣椴伙柡吞侵愇镔|(zhì)。

2.4 生物表面活性劑的薄層層析（TLC）分析

將生物表面活性劑產(chǎn)物的濃溶液點(diǎn)樣于硅膠平板上，展開30 min后干燥，用苯酚-硫酸顯色，發(fā)現(xiàn)1個(gè)棕色斑點(diǎn)，且Rf值為0.68。而鼠李糖標(biāo)樣的Rf值也是0.68。采用菌株B2的發(fā)酵液進(jìn)行薄層層析，在Rf值為0.68處也發(fā)現(xiàn)棕色斑點(diǎn)。這說明菌株B2產(chǎn)物的主要成分是鼠李糖脂類化合物。

2.5 臨界膠束濃度（CMC）的測(cè)定

由圖3可知，當(dāng)表面活性劑水溶液的濃度低于180 mg/L時(shí)，溶液表面張力隨著濃度的升高而降低；當(dāng)濃度大于等于180 mg/L時(shí)，溶液表面張力基本維持在30 mN/m左右。即該產(chǎn)物最低可將水的表面張力降至30 mN/m，且其臨界膠束濃度約為180 mg/L。常用的化學(xué)合成表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS）的CMC值為2 120 mg/L，十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）的CMC值為1 300 mg/L，該生物表面活性劑的CMC值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于化學(xué)合成表面活性劑。

2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.6.1 不同碳源對(duì)發(fā)酵液表面張力的影響 由圖4可知，5種不同碳源對(duì)發(fā)酵液表面張力的影響不同，隨著碳源濃度的升高，發(fā)酵液表面張力呈不同的變化規(guī)律，其中在培養(yǎng)基中添加豆油，發(fā)酵液表面張力處于最低水平，因此，選擇20 g/L的豆油為最佳碳源。

2.6.2 不同氮源對(duì)發(fā)酵液表面張力的影響 由圖5可知，在不同氮源的選擇中，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度尿素時(shí)，發(fā)酵液表面張力處于較低水平，因此，選擇5 g/L的尿素為最佳氮源。

2.6.3 初始pH對(duì)發(fā)酵液表面張力的影響 由圖6可知，當(dāng)初始pH為7.0時(shí)，發(fā)酵液表面張力最小，因此，選擇最佳pH為7.0。

2.6.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液表面張力的影響 由圖7可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液表面張力先降低后升高，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為96 h，發(fā)酵液表面張力最小，因此，選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為96 h。

2.6.5 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液表面張力的影響 由圖8可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液表面張力先降低后升高，當(dāng)發(fā)酵溫度為34 ℃，發(fā)酵液表面張力最小，因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為34 ℃。

2.6.6 正交試驗(yàn)結(jié)果 正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由極差分析可知，RA>RC>RB>RD，各因素對(duì)發(fā)酵液表面張力的影響主次順序?yàn)锳、C、B、D。即碳源對(duì)表面張力的影響最大，其次是培養(yǎng)溫度和氮源，而初始pH對(duì)表面張力的影響最小。根據(jù)表3可知，菌株B2的最佳發(fā)酵水平為A3B1C3D2，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液的表面張力降到27.6 mN/m，比優(yōu)化前發(fā)酵培養(yǎng)基同等條件下發(fā)酵液的表面張力要小，所以本試驗(yàn)菌株B2的最優(yōu)發(fā)酵條件確定為尿素5 g/L，KCl 1.1 g/L，NaCl 1.1 g/L，KH2PO4 3.4 g/L，K2HPO4 4.4 g/L，MgSO4 0.5 g/L，豆油20 g/L，酵母膏0.5 g/L，微量元素溶液5.0 mL/L，pH 7.0，最佳溫度34 ℃，培養(yǎng)時(shí)間96 h。

3 小結(jié)與討論

在自然界中，有很多能夠產(chǎn)糖脂類生物表面活性劑的微生物，如Arthrobacter sp.、Rhodococcus、Corynebacterium、Torulopsis和Pseudomonas等[9]。本試驗(yàn)從松原市吉林油田被石油污染的土壤中篩選出1株可以高效產(chǎn)糖脂類生物表面活性劑的菌株B2。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)與16S rDNA序列分析將該菌株鑒定為沙雷氏菌屬（Serratia sp.）。經(jīng)優(yōu)化后確定出最佳發(fā)酵條件為尿素5 g/L，NaCl 1.1 g/L，KCl 1.1 g/L，K2HPO4 4.4 g/L，KH2PO4 3.4 g/L，MgSO4 0.5 g/L，酵母膏0.5 g/L，豆油20 g/L，微量元素溶液5.0 mL/L，pH 7.0，溫度34 ℃， 培養(yǎng)96 h。在此最佳條件下測(cè)得發(fā)酵液的表面張力為27.6 mN/m。沈薇等[10]篩選出的菌株LY4，糖脂產(chǎn)量較高，達(dá)到6.8 g/L。劉曉蘭等[11]報(bào)道的產(chǎn)生糖脂的一株菌種，其最高糖脂產(chǎn)量達(dá)到7.073 g/L。而試驗(yàn)中，該菌株B2經(jīng)優(yōu)化后的表面活性劑產(chǎn)量為3.746 1 g/L。與同期相比存在著一定差距，需要進(jìn)一步誘變以及確定更佳的培養(yǎng)條件。

參考文獻(xiàn)：

[1] GEORGIOU G，LIN S C，SHARMA M M. Surface-active compounds from microorganisms[J].Nature Biotechnology，1992，10（1）：60-65.

[2] LEE S C，LEE S J，KIM S H，et al. Characterization of new biosurfactant produced by Klebsiella sp. Y6-1 isolated from waste soybean oil[J].Bioresource Technology，2007，99（7）：2288-2292.

[3] 張?zhí)靹?生物表面活性劑及其應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.218-363.

[4] 田 雷，白云玲，鐘建江.微生物降解有機(jī)污染物的研究進(jìn)展[J]. 工業(yè)微生物，2000，3（2）：46-50.

[5] 吳清平，蔡芷荷，張菊梅，等.表面活性素的結(jié)構(gòu)特性及其生物合成機(jī)理[J].微生物學(xué)通報(bào)，1998，25（6）：351-353.

[6] 寧長(zhǎng)發(fā)，沈 薇，孟廣榮，等.產(chǎn)生物表面活性劑菌種的一種快速篩選模型[J].微生物學(xué)通報(bào)，2004，31（3）：55-58.

[7] 沈 薇，楊樹林，寧長(zhǎng)發(fā)，等.藍(lán)色凝膠平板法篩選生物表面活性劑產(chǎn)生菌[J].南京理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，29（4）：486-490.

[8] COOPER D G，MACDONALD C R，DUFF S J，et al. Enhanced production of surfactin from bacillus subtilis by continuous product removal and metal cation additions[J].Applied and Environmental Microbiology，1981，42（3）：408-412.

[9] 錢曉勇，劉國(guó)慶，宗 凱，等.1株生物表面活性劑產(chǎn)生菌篩選及其條件優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（13）：5848-5850.

[10] 沈 薇，楊樹林，寧長(zhǎng)發(fā)，等.銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）BS-03的誘變育種及產(chǎn)鼠李糖脂類生物表面活性劑的搖瓶工藝初探[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（12）：26-30.

[11] 劉曉蘭，張 鷺，鄭喜群，等.一株產(chǎn)生糖脂菌種的初步鑒定及發(fā)酵條件的考察[J].微生物學(xué)雜志，2002，22（3）：6-9.