產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細(xì)菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

摘要：采用膠體幾丁質(zhì)平板產(chǎn)生透明圈法，從竹林附近的土壤中分離得到一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的優(yōu)良菌株，以膠體幾丁質(zhì)為反應(yīng)底物，對其所產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶粗酶性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，該酶最適pH 7.5，在pH 6.5～9.5的緩沖液中放置12 h后，殘余酶活仍在60%以上，在pH 7.0～8.5的緩沖液中殘余酶活仍在80%以上，說明該酶在中性和堿性條件下具有較好的穩(wěn)定性；該酶在30 ℃時酶活最高，在低于60 ℃的處理條件下殘余酶活仍在80%以上，且80 ℃處理后仍有37%的殘余酶活，說明該酶的熱穩(wěn)定性較好；配制蟹殼培養(yǎng)基發(fā)酵該菌，發(fā)現(xiàn)該菌能直接降解蟹殼產(chǎn)生殼寡糖，且每克蟹殼降解后可產(chǎn)生5.3 mg還原糖。通過16S rDNA基因序列比對，鑒定該菌為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

關(guān)鍵詞：幾丁質(zhì)酶；酶學(xué)性質(zhì)；菌種鑒定；蟹殼降解

中圖分類號：Q939.97 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）15-3887-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.020

Abstract： A bacterium producing high chitinase was isolated from soil around bamboo forest by method of colloidal chitin plate. The characteristics of the crude chitinase that produced by this strain was studied by using colloidal chitin as the substrate. The results showed that the optimum pH of the enzyme was 7.5. The crude enzyme still had 60% of the highest activity after overnight incubation at pH 6.5～9.5， especially it still had 80% of the highest activity in the buffer of pH 7.0～8.5，which indicated that the enzyme was very stable under neutral or alkaline conditions. The crude chitinase displayed the maximum activity at 30 ℃. After incubation below 60 ℃ for 30 min，it remained more than 80% of the highest activity. And after incubation at 80 ℃ for 30 min，it still had 37% of the highest activity which indicated the chitinase also had better thermal stability. After cultivation at crab shell medium，the bacteria could directly degradate crab shell to chitosan oligosaccharide，producing 5.3 mg reducing sugar per gram of crab shells. The strain was identified as Bacillus sp. by measuring its 16S rDNA sequence.

Key words： chitinase； enzymatic properties； strain identification； crab shells degradation

幾丁質(zhì)是一種廣泛分布于自然界中的生物多聚物，在所有天然聚合物中儲量占第二位，僅次于纖維素[1]。幾丁質(zhì)酶（Chitinase，EC3.4.1.14）可催化水解幾丁質(zhì)的β-1，4-糖苷鍵生成幾丁聚糖和幾丁寡糖[2]。幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物幾丁寡糖、殼低聚糖和N-乙酰氨基葡萄糖可以廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品、化妝品、紡織、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，具有普遍的生物學(xué)活性及可觀的經(jīng)濟(jì)效益[3-7]。

海產(chǎn)品加工產(chǎn)生的蝦殼、蟹殼等下腳料是富含幾丁質(zhì)的廢棄物，這些未經(jīng)處理的下腳料，不僅造成資源浪費(fèi)，而且污染環(huán)境。采用幾丁質(zhì)酶水解處理，不僅可以有效處理廢棄物保護(hù)環(huán)境，而且還可以變廢為寶，生產(chǎn)高附加值的殼寡糖等系列產(chǎn)品。

自從Benecke首次報道分離到幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌以來，發(fā)現(xiàn)在微生物中很多細(xì)菌、放線菌、真菌、酵母及某些病毒都能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶[8，9]。本試驗(yàn)從土壤中篩選出一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株，經(jīng)16S rDNA測序，對該菌進(jìn)行鑒定，并對其酶活和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測定，為酶法降解幾丁質(zhì)制備幾丁寡糖以及該酶在其他領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論和實(shí)踐的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 采自武漢設(shè)計工程學(xué)院校園竹林處、污水處理池附近和湯遜湖邊表層5～10 cm土壤以及埋有蝦殼30 d土壤，分離出產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基（1 L，pH 7.0）：蛋白胨 1 g、酵母膏1 g、NaCl 0.5 g；初篩平板固體分離培養(yǎng)基（1 L，pH 7.0）：蛋白胨1 g、酵母膏1 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂15 g、3%膠體幾丁質(zhì)80 mL；發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L，pH 7.0）：蛋白棟0.5 g、酵母膏0.5 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、3%膠體幾丁質(zhì)80 mL；蟹殼發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L，pH 7.0）：蛋白胨0.5 g、酵母粉0.5 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蟹殼20 g。

1.1.3 膠體幾丁質(zhì)的制備 片狀幾丁質(zhì)5.0 g、濃磷酸40 mL置于50 mL小燒杯中，用保鮮膜將杯口封好，28 ℃放置24 h。24 h后取出，5 000 r/min離心10 min，取上清液，加NaOH和去離子水調(diào)pH至7.0， 5 000 r/min離心10 min，取沉淀即為膠體幾丁質(zhì)。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)酶菌種篩選 將待測樣品（土樣）加無菌生理鹽水并用玻璃珠打散，靜置2 min后取上清液加入富集培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)24 h。將富集后的菌液稀釋成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8系列稀釋菌液，分別均勻涂布在初篩平板固體分離培養(yǎng)基中，放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，然后用0.1%剛果紅染色20～30 min，再用1 mol/L NaCl脫色10～15 min，挑選能產(chǎn)生透明圈的單菌落。

1.2.2 酶活的測定 取出初篩得到的菌株，接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于37 ℃的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)48 h后，測定發(fā)酵液的酶活。1 mL酶液在37 ℃、pH 7.0的條件下每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于l μmol N-乙酰氨基葡萄糖還原糖所需的酶量定義為單位酶活。幾丁質(zhì)酶酶活的測定方法[10]如下：①取5 mL搖瓶培養(yǎng)液經(jīng)5 000 r/min離心10 min；②取0.5 mL上清液，加入1 mL Mcllvaine緩沖液、0.5 mL 3%膠體幾丁質(zhì)，于37 ℃水浴30 min，然后沸水浴10 min，取1 mL 4 000 r/min離心5 min，加0.5 mL DNS試劑終止反應(yīng)；③沸水浴5 min立刻冷卻，加入4 mL去離子水后測OD540 nm；④以N-乙酰葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，光密度OD為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用空白管作零點(diǎn)。

1.2.3 酶學(xué)性質(zhì)的測定

1）pH對酶活性的影響。以0.2 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L檸檬酸配制pH 3.0～8.0梯度緩沖液，以0.2 mol/L NaOH和0.2 mol/L Gly配制pH 8.5～10.0梯度緩沖液，按照上述標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活，根據(jù)不同pH緩沖液的吸光值，測定酶的最適反應(yīng)pH。

2）溫度對酶活性的影響。以最適pH緩沖液配制溶度為3%膠體幾丁質(zhì)底物，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定在不同溫度下的酶活。確定酶反應(yīng)的最適溫度。

3）酶的pH穩(wěn)定性。各取1 mL酶液于pH 3.0～10.0的緩沖液中4 ℃放置12 h。以最適pH緩沖液配制3%膠體幾丁質(zhì)底物測定活性，以未用緩沖液處理的酶液的酶活為100%，計算相對酶活。

4）酶的熱穩(wěn)定性。在確定酶的最適pH的前提下，以氫氧化鈉、甘氨酸為底物緩沖溶液調(diào)節(jié)pH為最適pH，各取1 mL的原酶液放入30～80 ℃的水浴鍋中保溫30 min，然后再加入最適pH配制的3%膠體幾丁質(zhì)的底物，在最適溫度下測定酶活，以未處理的酶液的酶活為100%，計算相對酶活。

1.2.4 菌株降解蟹殼能力的測定 取蟹殼發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL分裝至250 mL的錐形瓶中，按1%接種量接種后置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)，以未接種的培養(yǎng)基作為空白對照，測定培養(yǎng)15 d后發(fā)酵上清液的還原糖。

1.2.5 產(chǎn)酶菌株的初步鑒定 采用菌體直接擴(kuò)增16S rDNA的方法[11]。PCR擴(kuò)增引物選用16S rDNA細(xì)菌通用引物27f/1492r（上游引物5′-AGAGTTTG ACCTGGCTCAG-3′；下游引物5′-TACCTTGTTACG ACTT-3′）。反應(yīng)體系：25 mmol/L MgCl2 5 μL，10×Buffer 2.5 μL，25 mmol/L dNTP 2 μL，上下游引物各1 μL（濃度2 μmol/L），模板DNA 1 μL，Taq酶 （5 U/μL）0.25 μL，ddH2O 12.25 μL，總體系為25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用試劑盒（Axyprep DNA Gel Extraction K it Axygen Biosciences）純化后送至深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果同GenBank數(shù)據(jù)庫的基因序列進(jìn)行比對，以確定該菌類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選

將富集培養(yǎng)的細(xì)菌經(jīng)過梯度稀釋后接種到篩選培養(yǎng)基上，篩選出7株可以產(chǎn)透明圈的菌株分別命名為1、2、3、4、5、6、7。測定7株菌的菌落直徑以及透明圈直徑和菌落直徑比，結(jié)果如表1所示，1號菌的透明圈與菌落直徑比較大。在幾丁質(zhì)平板上，菌落周圍形成的透明圈除與菌株產(chǎn)酶水平相關(guān)外，還與菌株分泌的幾丁質(zhì)內(nèi)切酶與外切酶比例相關(guān)，所以不能僅以菌落周圍透明圈大小判斷菌株的產(chǎn)酶能力，篩選時必須綜合考慮透明圈大小、明亮程度、菌落大小以及菌落下培養(yǎng)基的液化程度[12]。因此，對所選取的7株含有透明圈的菌株進(jìn)行復(fù)篩，從中選出目的菌株。

2.2 酶活測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 測定不同濃度的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，NAG的含量和吸光度呈線性關(guān)系，回歸方程為y=1.936 9x-0.040 0，R2=0.993 8，式中，x為葡萄糖含量（μg/mL），y為OD540。

2.2.2 發(fā)酵液粗酶活 對挑選的7株含有透明圈的菌株放入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取上清液，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測定吸光值，通過計算得到的酶活如圖2所示。由表1、圖2可以看出，4號菌株的透明圈與菌落直徑比較2、5、6號菌株透明圈與菌落直徑比大，而其酶活卻較之小，由此可知，透明圈與菌落直徑比與酶活力的高低并非呈正相關(guān)。通過酶活的測定得到1號菌株的吸光值最大，表明在相同時間內(nèi)，該菌株產(chǎn)生的酶活最大。因此選用1號菌株作為目的菌株。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)測定

2.3.1 pH對酶活性質(zhì)的影響 將1號菌株放在不同pH梯度下，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法，測定不同溫度下的吸光度。所測結(jié)果如圖3所示，隨著pH升高，酶活力不斷升高，在pH 7.5以后開始下降。在pH 7.5～8.0時酶的活性較高，在pH 7.5時最高，所以該酶最適pH為7.5。該酶在pH<5時幾乎沒有活性，在pH>7.5活性開始下降，pH為10時仍有較高的活性，說明該菌耐堿性能力較強(qiáng)，在中性和堿性條件下更容易產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。

2.3.2 溫度對酶活的影響 將pH固定在最適pH 7.5，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法，測定不同溫度下的吸光度，繪制不同溫度下的酶活曲線。結(jié)果如圖4所示，該酶在20～60 ℃時活性非常高，但在30 ℃時最高，所以該酶最適溫度為30 ℃。該酶60 ℃活力下降很快，在70 ℃以后活力極小。該幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為30 ℃，略高于蜂房芽孢桿菌產(chǎn)生的酶，低于黃桿菌產(chǎn)生的酶，據(jù)報道蜂房芽孢桿菌的酶活最適溫度為28 ℃[3]，黃桿菌的最適酶活溫度為50 ℃[2]。

2.3.3 酶的pH穩(wěn)定性 酶液在不同pH緩沖液中4 ℃保存12 h后，測得殘余酶活，繪制相對酶活曲線（圖5）。由圖5可知，pH 6.5～9.5的緩沖液中放置12 h后，殘余酶活仍在60%以上，尤其是在pH 7.0～8.5的緩沖液中殘余酶活仍在80%以上，說明該酶在中性和堿性條件下非常穩(wěn)定。

2.3.4 酶的熱穩(wěn)定性 在最適pH條件下，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法，測定不同溫度下保存30 min后的酶活，繪制不同溫度下的相對酶活曲線（圖6）。由圖6可知，該酶在低于60 ℃的處理條件下殘余酶活仍在80%以上，且80 ℃處理后仍有37%的殘余酶活，說明該酶的熱穩(wěn)定性較好。

2.4 產(chǎn)酶菌株的初步鑒定

將16S rDNA的測序結(jié)果通過Blast軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)該序列與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）同源性最高，達(dá)到100%，初步確定該菌為芽孢桿菌屬菌株。

2.5 菌株降解蟹殼的能力

取1 mL發(fā)酵液上清液與DNS反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出，每瓶發(fā)酵液總還原糖為5.3 mg，即該菌降解1 g蟹殼產(chǎn)生5.3 mg還原糖。表明該菌株可以直接降解蟹殼，但降解效果不是很好。

3 小結(jié)與討論

通過平板透明圈法初篩、復(fù)篩，從土壤中獲得一株透明圈最大的1號菌株，根據(jù)菌株和菌落的形態(tài)以及革蘭氏染色，初步鑒定該菌株為紫色短桿菌，經(jīng)過16S rDNA的測序，初步確定該菌為芽孢桿菌屬菌株。

本試驗(yàn)中所研究的細(xì)菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最適pH為7.5，略高于蜂房芽孢桿菌和黃桿菌，蜂房芽孢桿菌產(chǎn)的酶的最適pH為6.8[9]，黃桿菌產(chǎn)的酶的最適pH為7.0[2]。該幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為30 ℃，略高于蜂房芽孢桿菌的酶活最適溫度28 ℃[9]，而低于黃桿菌的最適酶活溫度50 ℃[2]。

酶是一種活性蛋白，因此酶的穩(wěn)定性在研究酶的過程中起重要作用，而溫度和pH是影響酶穩(wěn)定性的兩個主要因素。本研究中，幾丁質(zhì)酶在pH 6.5～9.5的緩沖液中放置12 h后，殘余酶活仍在60%以上，尤其是在pH 7.0～8.5的緩沖液中殘余酶活仍在80%以上，說明該酶在中性和堿性條件下非常穩(wěn)定；同時該酶在低于60 ℃的處理條件下殘余酶活仍在80%以上，且80 ℃處理后仍有37%的殘余酶活，說明該酶的熱穩(wěn)定性較好。眾所周知，蟹殼中幾丁質(zhì)的含量很高，但是目前未見有利用菌直接降解蟹殼的報道。本研究首次將篩選的菌直接用于降解蟹殼，結(jié)果表明，該菌具有降解蟹殼的能力，但是效果不是很好。原因可能是蟹殼沒有經(jīng)過任何處理，結(jié)構(gòu)緊密不適合直接降解，或者培養(yǎng)條件不合適，沒有達(dá)到最佳降解條件，還有待于進(jìn)一步的研究。

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