杜鵑花根部共生真菌的分離與鑒定

摘要：對(duì)杜鵑花（Rhododendron simsii Planch.）根部土壤微生物進(jìn)行了篩選，依據(jù)形態(tài)特征和rDNA ITS序列信息，對(duì)比臨近根部土壤中的真菌，共分離出5種真菌。結(jié)果表明，枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）、頭孢霉（Cephalosporium sp.）、擬盾殼霉（Paraconiothyrium hawaiiense）均為與杜鵑花共生的真菌類型。該研究為后續(xù)杜鵑花和根際微生物共生機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 杜鵑花（Rhododendron simsii Planch.）；共生真菌；形態(tài)學(xué)鑒定；ITS序列

中圖分類號(hào)：S685.21；Q949.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）17-4577-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.17.054

Abstract： Based on morphological characteristics and ITS sequence information， five kinds of fungi have been isolated from roots of Rhododendron simsii Planch， which was identified to be Cladosporium cladosporioides， Cephalosporium sp. and Paraconiothyrium hawaiiense. This research laid a foundation for the further study of symbiosis growth responses of host plant Rhododendron and its fungal partner.

Key words： Rhododendron simsii Planch.； symbiotic fungia； morphological identification； ITS sequence

杜鵑花（Rhododendron simsii Planch.）是杜鵑花科（Ericaeae）杜鵑花屬（Rhododendron L.）植物，被譽(yù)為“花中西施”和“木本花卉之王”。杜鵑花科約305屬3 350種，主要分布于南北半球的溫帶及北半球亞寒帶，少數(shù)屬分布在北極和熱帶高山， 中國有570余種杜鵑花品種，特有種達(dá)400多種[1]。杜鵑花兼有生態(tài)保護(hù)、美學(xué)觀賞、藥用治療、科學(xué)研究等多重功效，其水土保持功能在山地生態(tài)系統(tǒng)維持中的作用舉足輕重[2]。

杜鵑花科植物能與共生真菌形成歐石楠類菌根（Ericoid mycorrhizal，ERM），ERM可提高杜鵑花幼苗的移植成活率，增加杜鵑花對(duì)有毒金屬物質(zhì)的耐受性，并能促進(jìn)杜鵑植株的生長及養(yǎng)分的吸收[3，4]。于芳等[5]從野生云錦杜鵑根系中分離得到4種真菌，對(duì)云錦杜鵑幼苗的苗高、葉片數(shù)、主根數(shù)、根長、葉綠素、干重及總生物量均有顯著的促進(jìn)效應(yīng)。在土壤營養(yǎng)貧瘠的石楠灌叢生態(tài)系統(tǒng)中，ERM菌根會(huì)促進(jìn)杜鵑對(duì)頑氮和磷的吸收[6，7]。本研究分離鑒定杜鵑（Rhododendron simsii Planch.）的根部共生真菌，以期為杜鵑花屬植物與微生物互作研究和杜鵑幼苗的培育提供理論依據(jù)，同時(shí)為菌根真菌在杜鵑培育過程中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取黃岡大別山博物館前一株生長旺盛的杜鵑花根部土壤，裝入滅菌袋中封存，并編號(hào)為“根際土壤”；同時(shí)采集同株杜鵑花1 m外同樣深度的土壤作為“對(duì)照土壤”。

1.2 方法

1.2.1 根際真菌的培養(yǎng)和分離 取1 g根際土壤和對(duì)照土壤，分別溶于10 mL無菌水中，稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5 g/mL系列梯度，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?.1 mL真菌懸液，接種于涂布50 μg/mL氨芐青霉素的PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)，每隔24 h觀察菌落的生長情況。

分離“根際土壤”平皿中有而“對(duì)照土壤”平皿中沒有的菌，分別接種在新的PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)，每隔12 h觀察真菌的生長情況。待真菌菌斑的面積占據(jù)平皿的一半時(shí)停止培養(yǎng)。

1.2.2 菌落的形態(tài)學(xué)鑒定 依據(jù)平皿內(nèi)菌落的顏色、質(zhì)地、有無分泌物、菌落尺寸等指標(biāo)觀察每種真菌的形態(tài)特征。利用棉蘭染色法并結(jié)合光學(xué)顯微鏡對(duì)單菌落的菌絲結(jié)構(gòu)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，依據(jù)菌絲結(jié)構(gòu)確定分離真菌的菌落種屬。

1.2.3 菌落的分子生物學(xué)鑒定 挑取新鮮菌絲接種于PDB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5～7 d。4 000 r/min離心回收真菌菌絲體，用無菌水沖洗5次以除凈菌絲表面黏附的培養(yǎng)基及其他雜質(zhì)，用濾紙吸干多余水分。將菌絲在預(yù)冷的研缽液氮研磨至粉末，用2×CATB緩沖液（20 g/L CATB，10 g/L PVP-360，100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，0.7 mol/L NaCl，0.1% β-巰基乙醇）提取真菌基因組DNA，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

采用rDNA ITSII的上下游通用引物（ITS86 F：5′-GTGAATCATCGAATCTTTGAAC-3′；ITS4R：5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)真菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段TA克隆后送金斯瑞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行Blast序列比對(duì)，進(jìn)一步鑒定所分離真菌的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

本次研究共分離出5株真菌，菌落特征見表1。由表1可知，wzh1和wzh2菌株為黑色，wzh3為灰白色，而wzh4和wzh5分別為淡黃色和白色。5株真菌中，僅wzh4具有絨氈結(jié)構(gòu)，其余4株菌均具有絨毛結(jié)構(gòu)。wzh1、wzh2、wzh3的菌落均為圓形隆起，而wzh4和wzh5的菌落則是不規(guī)則突起。wzh1、wzh2、wzh4無液體分泌物，而wzh3和wzh5則分別具有淡紅色和乳白色的液體分泌物。

從平皿內(nèi)挑取菌絲體，經(jīng)棉蘭染色后置于光學(xué)顯微鏡下（100×）觀察，5株真菌菌絲體的形態(tài)特征見圖1。綜合菌落的外形分析和菌絲體的形態(tài)特征，參照菌落的形態(tài)學(xué)描述，初步確定所分離的5株杜鵑花根際微生物屬子囊菌屬。

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

利用改進(jìn)的CTAB法提取真菌基因組DNA，檢測(cè)結(jié)果帶型完整，亮度高，適合下游ITS擴(kuò)增（圖2）。利用通用引物ITS和ITS4對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度58 ℃，該引物組合所擴(kuò)增的DNA片段包括ITS1和ITSII區(qū)，以及兩個(gè)區(qū)域之間的5.8S rDNA區(qū)域。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，wzh1、wzh2、wzh3、wzh4擴(kuò)增的DNA片段約700 bp，而wzh5擴(kuò)增出的DNA片段約1 000 bp（圖3）。

圖4為5株真菌的ITS序列信息，去除載體序列后在NCBI數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行Blast比對(duì)。結(jié)果表明，wzh1、wzh2均與枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）的ITS序列KJ596320.1相似度達(dá)98%，而wzh3與枝孢霉的HQ631003序列相似度為99%，因此這3株菌株可能均為枝孢霉菌。以wzh3為基準(zhǔn)，wzh1序列僅有12個(gè)位點(diǎn)堿基突變，而wzh2僅有7個(gè)堿基位點(diǎn)突變（圖5）。wzh4菌落的ITSI-5.8S-ITSII序列與序列HQ630973.1相似度達(dá)99%，即wzh4菌為頭孢菌（Cephalosporium sp.）。wzh5的序列與擬盾殼霉菌（Paraconiothyrium hawaiiense）的KF881749.1序列相似度達(dá)99%。

3 小結(jié)

杜鵑花菌根真菌能夠促進(jìn)杜鵑花科植物營養(yǎng)吸收，這是由于：①真菌與杜鵑根部接觸擴(kuò)大了杜鵑根部與土壤接觸的面積；②推測(cè)根內(nèi)真菌有類似固氮菌的作用，能把不能利用的硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為容易吸收的其他氮源形式；③真菌能產(chǎn)生許多水解和氧化的酶類物質(zhì)，如蛋白酶、纖維素酶、半纖維素降解酶、杜鵑花幾丁質(zhì)酶和磷酸酶等，這些酶類可以幫助真菌分解植物細(xì)胞壁以吸收植物殘?bào)w細(xì)胞中的營養(yǎng)物質(zhì)，最終使寄主更好地吸收土壤中的有機(jī)氮源和磷源等營養(yǎng)物質(zhì)[8，9]。因此，杜鵑花根際共生真菌的分離鑒定，并利用菌根真菌促進(jìn)杜鵑花的培育至關(guān)重要。

菌根真菌的形態(tài)特征復(fù)雜，生理指標(biāo)和形態(tài)特征易隨發(fā)育階段及生境狀況的變化而改變，且不穩(wěn)定，常造成形態(tài)描述的誤差，因此形態(tài)學(xué)鑒定存在很大的局限性。孢壁層次作為分類鑒定的主要依據(jù)已被人們廣泛接受，但孢壁的特征及層次很容易受到孢子發(fā)育階段、浮載劑類型及貯藏時(shí)間等的影響，從而增加了對(duì)菌根真菌種類進(jìn)行鑒定的難度。此外，形態(tài)學(xué)鑒定容易忽略一些不產(chǎn)孢子的種類，從而低估菌根真菌的物種多樣性。對(duì)ITS區(qū)進(jìn)行序列分析不僅豐富了真核生物核糖體基因ITS的序列信息，為病原菌的分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育等研究提供了十分重要的依據(jù)，而且為建立病原菌的分子監(jiān)測(cè)與疫病的快速診斷技術(shù)奠定了基礎(chǔ)[10-13]。

本研究結(jié)果表明，分離鑒定的5株真菌中，wzh1、wzh2、wzh3均為枝孢霉，wzh4和wzh5分別為頭孢霉和擬盾殼霉，對(duì)杜鵑花植株生長及養(yǎng)分吸收的促進(jìn)作用有待進(jìn)一步研究。

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