纖維素酶高產(chǎn)細(xì)菌的篩選、鑒定及酶學(xué)特性分析

摘要：從武夷山森林腐爛枯葉及附近土壤中篩選分離得到1株產(chǎn)纖維素酶活力較高的菌株CS-7。通過形態(tài)特征觀察和16S rDNA序列分析，將其鑒定為蠟狀芽胞桿菌（Bacillus cereus）。對(duì)菌株CS-7所產(chǎn)纖維素酶的相關(guān)酶學(xué)特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，該菌株所產(chǎn)纖維素酶CMC酶活為7.91 U/mL，F(xiàn)PA酶活為2.40 U/mL；酶的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH分別為60 ℃和6；在40～50 ℃溫度范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性較好；在pH 5.0～7.0范圍內(nèi)pH穩(wěn)定性較好。研究結(jié)果表明，CS-7菌株是能產(chǎn)生耐高溫中性纖維素酶的菌株，具有進(jìn)一步研究開發(fā)利用的潛力。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；篩選；CMC酶活；濾紙酶活；酶學(xué)特性

中圖分類號(hào)：Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）17-4572-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.17.053

Abstract： A cellulase producing strain CS-7 was isolated from soil samples collected from forest decayed leaf and soil around Wuyishan. Based on morphological and physiological characterization， CS-7 was characterized as Bacillus cereus. The enzymatic properties of cellulase from CS-7 were studied. The results showed that the CMCase activity of enzyme produced by CS-7 was 7.91 U/mL. The FPase activity was 2.40 U/mL. The optimal conditions for the enzymatic reaction were 60 ℃ and 6.0. The enzyme preparations of CS-7 strain were stable at 40～50 ℃ and pH 5.0～7.0. These results indicated that microbial strain CS-7 could produce heat-resistant neutral cellulase which has great potential for further exploration and utilization.

Key words： cellulase； screening； CMCase； FPase； enzymatic property

纖維素是葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵連接而成的線性多糖，由綠色植物光合作用產(chǎn)生，是自然界中分布最廣、儲(chǔ)量最多的碳水化合物，是植物細(xì)胞壁的主要成分[1]。纖維素是自然界中含量最豐富的可再生資源[2-4]，但其中絕大部分并未得到有效利用[5，6]。利用纖維素類生物質(zhì)材料生產(chǎn)能源及化工原料，可有效緩解當(dāng)前世界面臨的環(huán)境污染與能源危機(jī)問題[7-9]。

纖維素酶（cellulase）是指能降解纖維素β-1，4 -葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱[10]。纖維素酶系統(tǒng)包含3種主要酶組分：內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶（EC3.2.1.4，也稱Cx酶、CMC酶）、外切葡聚糖酶（EC3.2.1.91，也稱C1酶，微晶纖維素酶）和β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）[6， 11]。纖維素的降解由內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶協(xié)同作用完成[12]。近年來發(fā)現(xiàn)纖維素酶在能源轉(zhuǎn)化、食品加工、醫(yī)藥生產(chǎn)、飼料加工、紡織、洗滌劑以及造紙工業(yè)等眾多領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值[13-15]。

微生物是纖維素酶的主要來源，自然界中存在許多能產(chǎn)生纖維素酶的真菌和細(xì)菌。目前研究較多的是霉菌，如綠色木霉、里氏木酶和康氏木霉，這類菌繁殖周期長，且多產(chǎn)酸性纖維素酶[16]。細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶一般為中性或者堿性酶，但大多數(shù)細(xì)菌所產(chǎn)纖維素酶對(duì)天然纖維素的水解能力較弱；此外，細(xì)菌所產(chǎn)生的酶多為胞內(nèi)酶或吸附于細(xì)胞壁上，不利于提取純化， 難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，因此對(duì)其不夠重視[16-18]。近年來，中性纖維素酶和堿性纖維素酶在紡織、造紙、洗滌以及廢水處理等行業(yè)得到成功應(yīng)用， 細(xì)菌纖維素酶已顯示出良好的應(yīng)用前景和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。為此，該研究從武夷山森林的腐爛枯枝落葉及其附近土壤中分離篩選能利用纖維素的細(xì)菌，通過固體平板初篩，搖瓶液體培養(yǎng)復(fù)篩，分別測(cè)定菌株的CMC酶活和濾紙（FPA）酶活，得到1株高產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌，通過形態(tài)學(xué)觀察對(duì)菌種進(jìn)行初步鑒定，并利用細(xì)菌的16S rDNA序列測(cè)定來確定其種屬，同時(shí)對(duì)該菌株所產(chǎn)纖維素酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 纖維素降解菌分離樣品采自武夷山大安源森林腐敗的枯枝落葉及其附近土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）富集培養(yǎng)基（g/L）：K2HPO4 2.0、（NH4）2SO4 1.4、MgSO4·7H2O 0.3、CaCl2 0.3、FeSO4·7H2O 0.005、MnSO4 0.001 6、ZnSO4 0.001 7、CoCl2 0.002、濾紙條20、去離子水定容至1 L，pH 5.5。

2）分離培養(yǎng)基（g/L）：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）15.0、NH4NO3 1.0、酵母膏1.0、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO4 1.0、瓊脂20、去離子水定容至1 L，pH自然。

3）液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/L）：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）15.0、NH4NO3 1.0、MgSO4·7H2O 0.5、KH2PO4 1.0、去離子水定容至1 L，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 樣品富集 將采集的樣品置于無菌錐形瓶中，加入10倍無菌水，充分?jǐn)嚢瑁?層滅菌紗布過濾，靜置30 min，取1 mL上清液接入盛有50 mL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，再將其中的濾紙轉(zhuǎn)入無菌的50 mL新鮮富集培養(yǎng)基中，連續(xù)富集培養(yǎng)2次。

1.2.2 菌株分離初篩 移取富集培養(yǎng)液0.1 mL涂布于CMC-Na平板培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，挑取菌落于CMC-Na平板上劃線分離，反復(fù)培養(yǎng)并劃線分離直到出現(xiàn)單菌落。挑取單菌落分別點(diǎn)種在CMC-Na平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h，用0.02% 剛果紅染色30 min，再用1 mol/L NaCl脫色30 min，根據(jù)水解圈直徑（H）與菌落直徑（C）比值（H/C）的大小選擇產(chǎn)酶量高的菌株。

1.2.3 菌株產(chǎn)酶復(fù)篩 將篩選到的菌株制成菌濃度為106～107 cfu/mL的菌懸液，按照1%的接種量，接種到裝有50 mL液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基的錐形瓶中， 30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，測(cè)定發(fā)酵液的酶活。

1.2.4 菌種鑒定

1）形態(tài)學(xué)鑒定。在菌株生長平板上觀察菌落形態(tài)特征；經(jīng)革蘭氏染色[19]后，通過顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。

2）16S rDNA序列測(cè)定。將產(chǎn)酶菌株送至北京信諾金達(dá)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上用Blast程序進(jìn)行同源性檢索，選取同源性較高的序列，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 酶活力測(cè)定 羧甲基纖維素（CMC）酶活力和濾紙（FPA）酶活力測(cè)定參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行。酶活力按照國際單位規(guī)定定義為：每分鐘催化纖維素水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活力單位[6，21]。

1.2.6 纖維素酶酶學(xué)特性研究

1）溫度對(duì)纖維素酶酶活的影響。以乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.8）溶解底物和稀釋酶液，設(shè)置恒溫水浴鍋的溫度為40、45、50、55、60、65、70 ℃，其他條件同“1.2.5”的方法，測(cè)定不同溫度下CMC酶活。

2）pH對(duì)纖維素酶酶活的影響。設(shè)置酶促反應(yīng)pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，其他條件同“1.2.5”的方法，測(cè)定在不同反應(yīng) pH 下CMC酶活。

3）纖維素酶的熱穩(wěn)定性。在進(jìn)行酶促反應(yīng)之前，先將粗酶液置于40、50、60、70 ℃的水浴鍋中分別水浴30、60、90、120、150 min，然后進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定酶活力，評(píng)價(jià)纖維素酶的熱穩(wěn)定性。

4）纖維素酶的pH穩(wěn)定性。在進(jìn)行酶促反應(yīng)之前，先將粗酶液分別于pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0下，50 ℃保溫1.0 h，然后進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定酶活力，評(píng)價(jià)纖維素酶的pH穩(wěn)定性。

5）底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響。以不同濃度的CMC-Na溶液為底物，使其終濃度分別為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mg/mL。以DNS法測(cè)定酶促反應(yīng)所產(chǎn)生還原糖的量，計(jì)算酶促反應(yīng)酶解CMC-Na的米氏常數(shù)Km和最大酶解速率Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離初篩

經(jīng)富集培養(yǎng)，CMC-Na平板分離得到15株可以纖維素為惟一碳源生長的菌株，將其點(diǎn)種于分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間，待長出菌落后用剛果紅染色，獲得14株能產(chǎn)生透明圈的菌株，其水解圈直徑與菌落直徑的比值（H/C）最大達(dá)到3.67。將初篩獲得的H/C大于2.40的7株菌株進(jìn)行液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定CMC酶活力與FPA酶活力，得到1株產(chǎn)纖維素酶活力最高的菌株CS-7，其液態(tài)CMC酶活為7.91 U/mL，F(xiàn)PA酶活為2.40 U/mL。

2.2 產(chǎn)酶菌株的鑒定

2.2.1 產(chǎn)酶菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 30 ℃培養(yǎng)72 h后，觀察菌株CS-7在平板上生長的菌落形態(tài)，如圖1所示。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上CS-7的菌落呈灰白色，不透明，表面濕潤，較粗糙，呈融蠟狀，菌落較大，在培養(yǎng)基上不產(chǎn)生色素。革蘭氏染色結(jié)果顯示菌株CS-7為革蘭氏陽性菌，菌體呈短桿狀，如圖2所示。

2.2.2 CS-7分子生物學(xué)鑒定 將菌株CS-7送至北京信諾金達(dá)生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA鑒定，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast分析，與GenBank核酸序列庫中的序列進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果表明CS-7菌株與芽胞桿菌屬中的Bacillus cereus的基因序列有較高的同源性，同源性高達(dá)99%，選取與該菌株同源性較高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，目標(biāo)序列CS-7所在類群中同Bacillus cereus isolate PGO6親緣關(guān)系最近，同源性較高，結(jié)合菌株的形態(tài)特征和16S rDNA序列鑒定結(jié)果，將菌株CS-7鑒定為蠟狀芽胞桿菌（Bacillus cereus）。

2.3 CS-7所產(chǎn)纖酶素酶的酶學(xué)特性

2.3.1 纖維素酶反應(yīng)的最適溫度 于40～70 ℃溫度范圍內(nèi)，以5 ℃為間隔，測(cè)定不同溫度下CMC酶活力，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，CS-7所產(chǎn)生的纖維素酶在40～70 ℃范圍均有活性，其最適反應(yīng)溫度為60 ℃，溫度范圍為55～65 ℃時(shí)CMC酶活力較高，在70 ℃下相對(duì)酶活依然保留74%，說明CS-7產(chǎn)生的是耐高溫的纖維素酶。

2.3.2 纖維素酶反應(yīng)的最適pH 設(shè)置酶促反應(yīng)pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，測(cè)定不同pH下CMC酶活力，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，CS-7菌株所分泌的纖維素酶的最適反應(yīng)pH為6.0，說明該菌所產(chǎn)纖維素酶主要為中性纖維素酶，這與現(xiàn)有的細(xì)菌所產(chǎn)纖維素酶主要為中性和堿性纖維素酶的報(bào)道一致。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，該酶在pH 4.0～7.5范圍內(nèi)均有活性，說明該菌株所產(chǎn)纖維素酶pH適應(yīng)范圍較廣，不管是酸性、中性還是堿性pH下都能起作用。

2.3.3 纖維素酶的熱穩(wěn)定性 將酶液在40、50、60、70 ℃的水浴中分別保溫30、60、90、120、150 min，測(cè)定CMC酶活力，結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，CMC酶在試驗(yàn)條件下熱穩(wěn)定性較好。在40～50 ℃下保溫150 min，相對(duì)酶活仍有85%以上；當(dāng)溫度為 60 ℃時(shí)，酶活力迅速下降；在70 ℃保溫150 min，相對(duì)酶活依然保留40%以上，說明該酶具有一定的耐熱性。

2.3.4 纖維素酶的pH穩(wěn)定性 將纖維素酶液置于不同pH的緩沖液中，50 ℃保溫1.0 h，測(cè)定CMC酶活，結(jié)果見圖7。由圖7可以看出，在pH 5.0～7.0的范圍內(nèi)，CMC酶較穩(wěn)定，當(dāng)pH低于5.0或高于7.0時(shí)，酶活迅速下降。

2.3.5 動(dòng)力學(xué)參數(shù) 將CMC-Na溶液終濃度分別調(diào)節(jié)為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mg/mL。以DNS法測(cè)定酶促反應(yīng)所產(chǎn)生還原糖的量來計(jì)算酶促反應(yīng)初速度。以底物濃度的倒數(shù)（1/S）為橫坐標(biāo)，酶促反應(yīng)速度的倒數(shù)（1/V）為縱坐標(biāo)，制作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，如圖8所示。可分別求出CS-7所產(chǎn)生的纖酶素酶對(duì)CMC-Na的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km為4.50 mg/mL，Vmax為131.58 mg/（mL·h）。

3 小結(jié)與討論

纖維素酶的來源非常廣泛，原生動(dòng)物、微生物（細(xì)菌、真菌、放線菌等）在一定條件下都能合成、分泌纖維素酶[1，8]。與真菌相比，細(xì)菌生長更迅速，環(huán)境適應(yīng)能力更強(qiáng)，所分泌的纖維素酶更穩(wěn)定，酶成分較真菌更為豐富，更易發(fā)揮酶之間的協(xié)同效用從而更有利于纖維素的降解[8]。

本研究采用剛果紅平板法[17，23]初篩，液體發(fā)酵測(cè)定CMC和FPA酶活定量復(fù)篩，獲得一株產(chǎn)纖維素酶性能較好的細(xì)菌CS-7，通過形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)方法將其鑒定為蠟狀芽胞桿菌（Bacillus cereus）。該菌株所產(chǎn)纖維素酶CMC酶活最高可達(dá)7.91 U/mL，F(xiàn)PA酶活可達(dá)2.40 U/mL。其CMC酶活是之前葛春輝等[23]報(bào)道的CCH-1菌株的13.61倍，是錢林等[21]報(bào)道的菌株DSH的1.73倍。由此可見菌株CS-7具有較強(qiáng)的產(chǎn)纖維素酶的能力。此外，CS-7菌株所產(chǎn)纖維素酶具有較高的FPA酶活性，說明該菌所產(chǎn)纖維素酶系比較完整，對(duì)纖維具有較好的綜合降解能力[24]，對(duì)菌株CS-7所產(chǎn)纖維素酶的相關(guān)酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明CMCase的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，最適反應(yīng)pH為6；在40～50 ℃時(shí)熱穩(wěn)定性較好，在pH 5～7范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；纖維素酶降解纖維素的米氏常數(shù)Km為4.50 mg/L，酶促反應(yīng)最大酶反應(yīng)速度Vmax為131.58 mg/（mL·h）。

綜上所述，CS-7菌株是一株能高產(chǎn)中性纖維素酶的蠟狀芽胞桿菌，所分泌的胞外纖維素酶具有較強(qiáng)的耐高溫能力和較高的pH穩(wěn)定性，有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景和深入研究的價(jià)值。

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