冬春兩季天津水域微藻的分離和鑒定

摘要：于2014年11月和2015年3月從天津轄區(qū)分別采集了淡水水樣和海水水樣，分別利用BG11和f/2培養(yǎng)基，采用平板分離法對(duì)水樣中的微藻進(jìn)行了分離。將分離得到的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后提取基因組DNA，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增18S rDNA，將PCR 產(chǎn)物測(cè)序后與NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)確定品種。試驗(yàn)分離得到菌株179株，其中有143株經(jīng)序列比對(duì)，確定分屬于綠藻門6個(gè)不同的屬，建立了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，同時(shí)初步建立了天津水域冬、春兩季微藻種質(zhì)資源庫(kù)。

關(guān)鍵詞：微藻；分離；鑒定；天津水域；冬、春兩季

中圖分類號(hào)：Q949.21 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）17-4506-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.17.038

Abstract： Water samples were collected from both freshwater and seawater in Tianjin in Novermber 2014 and March 2015. Microalgae strains in the water samples were isolated by BG11 or f/2 media. Genomic DNA of each strain was extracted after cultivation and 18S rDNA was amplified by PCR and sequenced. By blasting the sequencing results in the NCBI GenBank database，the genus of those microalgae were identified. A total of 179 strains were isolated，wherein 143 fell into six genera of Chlorophyta. A phylogenetic tree was built based on the sequencing results. Moreover，a preliminary collection of native microalgae in Tianjin was established.

Key words： microalgae； isolation； identification； Tianjin waters； winter and spring

微藻廣泛存在于地球上的湖泊、河流、沼澤等淡水環(huán)境中，種類繁多、個(gè)體微小，具有很強(qiáng)的光合效率和生長(zhǎng)速率[1]。微藻細(xì)胞富含蛋白質(zhì)、藻多糖、β-胡蘿卜素等營(yíng)養(yǎng)成分和化工原料，還含有鐵、銅、鋅等多種無(wú)機(jī)元素，其本身在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化妝品、環(huán)境監(jiān)測(cè)、污水處理、生物技術(shù)等領(lǐng)域具有非常重要的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[2-6]；而且一些特殊種類的微藻可生產(chǎn)包括生物柴油、生物乙醇在內(nèi)的多種形式的可再生燃料，可以通過(guò)厭氧發(fā)酵得到甲烷，或者通過(guò)光生物反應(yīng)產(chǎn)生生物氫，是值得研究和開(kāi)發(fā)的重要新能源——生物燃料的原材料之一[7-17]。

天津市東臨渤海，海岸線長(zhǎng)153 km，流經(jīng)天津市的一級(jí)河道有19條，總長(zhǎng)1 095.1 km，二級(jí)河道79條，總長(zhǎng)4 578 km，水資源極其豐富。遼闊的水域成為微藻生長(zhǎng)的理想空間。此外，天津市是東亞季風(fēng)盛行的地區(qū)，屬暖溫帶半濕潤(rùn)季風(fēng)性氣候，年平均氣溫14 ℃，夏半年受太平洋副熱帶暖高壓影響，氣溫平均在20 ℃以上，相對(duì)有利于微藻的生長(zhǎng)。但是冬、春兩季氣溫較低，目前關(guān)于天津冬、春季微藻種類的研究少有報(bào)道。為此，本研究將采樣時(shí)間定為冬、春季，以期對(duì)天津水域微藻種群有更全面的了解。

在經(jīng)歷了實(shí)驗(yàn)室分離純化步驟之后，微藻外部形態(tài)結(jié)構(gòu)遭到不同程度的破壞；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)條件與生長(zhǎng)環(huán)境不完全與自然環(huán)境相同，部分微藻形態(tài)學(xué)特征已發(fā)生改變，所以僅依靠微藻形態(tài)學(xué)特征來(lái)進(jìn)行分類鑒定已不能滿足要求。本研究主要采用分子生物學(xué)手段對(duì)微藻進(jìn)行種類鑒定，通過(guò)與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）建立的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中已有同源序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，確定所采集到微藻的分類地位及其與其他藻種的進(jìn)化關(guān)系。

1 材料與方法

試驗(yàn)所用樣品采集自天津水域，采樣地點(diǎn)分別位于新港船閘橋（北緯39°1′1″，東經(jīng)117°41′48″）、天津港（北緯38°59′24″，東經(jīng)117°42′50″）、北塘海鮮市場(chǎng)（北緯39°6′3″，東經(jīng)117°43′28″）、天津大學(xué)（北緯39°6′28″，東經(jīng)117°9′54″）。

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)試劑 植物基因組提取試劑盒（Generay，中國(guó)上海），普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TIANGEN，中國(guó)北京），即用型Taq酶PCR試劑盒（Generay，中國(guó)上海），Pst I內(nèi)切酶（Generay，中國(guó)上海），Taq I內(nèi)切酶（捷瑞，中國(guó)上海）、瓊脂糖（Biowest），1×TAE電泳緩沖液，GeneFinder核酸染料，上樣緩沖液，MarkerV，高保真DNA聚合酶（Pyrobest DNA polymerase），BG11培養(yǎng)基，f/2培養(yǎng)基等。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 光學(xué)顯微鏡（Nikon eclipse Ni，日本），高壓滅菌鍋（Hirayama HVE-50，日本），超凈工作臺(tái)（AirTech JW-CJ-2FD，中國(guó)蘇州），高速冷凍離心機(jī)（Hettich UNIVERSAL 320R，德國(guó)），高速離心機(jī)（Eppendorf5418R，德國(guó)），PCR儀（Biometra Standard Gradient 96，德國(guó)），電泳儀（六一儀器DYY-6C，中國(guó)北京），凝膠成像分析儀（WD-9413B），光照培養(yǎng)箱（SPX-GBH，中國(guó)上海），可調(diào)微量移液器（Eppendorf），電熱恒溫水浴鍋。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 在每個(gè)采樣點(diǎn)表層取1瓶水樣，裝于已滅菌的500 mL藍(lán)蓋試劑瓶中，于2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。淡水樣品采樣日期為2014年11月，海水樣品采樣日期為2015年3月。

1.2.2 分離 所采集到的樣品微藻濃度較低，需要在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。取10 mL水樣加入已滅菌的裝有100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，根據(jù)樣品來(lái)源，海水和淡水分別選擇BG11和f/2培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度（25±2） ℃，白色日光燈光照度約為2 000 lx，光暗周期為12 h∶12 h。當(dāng)微藻細(xì)胞達(dá)到適當(dāng)濃度，取50 mL離心分離，12 000 r/min離心5 min，濃縮至約5 mL。在超凈臺(tái)上將每個(gè)樣品培養(yǎng)液的濃縮液涂布于對(duì)應(yīng)的含1%瓊脂的BG11固體培養(yǎng)基或f/2固體培養(yǎng)基上，每個(gè)樣品各涂布3個(gè)平板，每個(gè)平板涂布量均為100 μL。將平板用Parafilm？誖封口后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[18-20]。培養(yǎng)條件同上。

培養(yǎng)約2周后，平板中長(zhǎng)出菌落，在超凈臺(tái)上采用四分劃線法分離，劃線后用Parafilm？誖膜封口，置于光照培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同上。

1.2.3 擴(kuò)大培養(yǎng) 培養(yǎng)約2周后， 平板中長(zhǎng)出單菌落，在超凈臺(tái)上用已滅菌的牙簽挑取各平板中的單菌落， 每個(gè)采樣點(diǎn)各挑取菌落約40個(gè)，接種于含100 mL已滅菌的對(duì)應(yīng)液體培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，每天搖動(dòng)錐形瓶若干次。

1.2.4 形態(tài)學(xué)觀察 取適宜濃度的純種藻細(xì)胞培養(yǎng)液20 μL，滴在無(wú)菌的載玻片上，從液滴的一側(cè)小心地蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡。將載玻片置于顯微鏡下觀察[21]，若藻細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力較強(qiáng)，可在空氣中放置一段時(shí)間，待水分減少，藻細(xì)胞運(yùn)動(dòng)緩慢或者不再運(yùn)動(dòng)時(shí)再進(jìn)行細(xì)致觀察。通過(guò)顯微鏡所連接的拍照系統(tǒng)進(jìn)行拍照，記錄藻細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)[18-20]。

1.2.5 基因組DNA的提取和18S rDNA分析 待錐形瓶中微藻生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD680 nm≈0.8）時(shí)，取50 mL藻液4 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，剩余藻液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管，12 000 r/min離心3 min，用移液器小心移去上清液后，將濃縮的藻液加入裂解管中，在勻質(zhì)機(jī)上振蕩30 s，5 min后再振蕩30 s后進(jìn)行研磨。研磨結(jié)束后用植物基因組DNA提取試劑盒提取微藻DNA。由于藻細(xì)胞數(shù)量較多，且分類地位不是很明確，試驗(yàn)確定18S rRNA引物序列為519f/1406r（519forward：5′-CAGCAGCCGCGGTAATAC-3′，1406reverse：5′-ACGGGCGGTGTGTRC-3′），所用引物由深圳華大基因科技股份有限公司合成。采用25 μL的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（混合酶13 μL、模板DNA（10～25 ng）1 μL、10 mmol/L正向引物1 μL、10 mmol/L反向引物1 μL、ddH2O 9 μL）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓100 V，電泳時(shí)間20～30 min[18-20]。測(cè)序工作由深圳華大基因科技股份有限公司完成。

1.2.6 序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)建立 將DNA測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有序列進(jìn)行Blast比對(duì)，確定藻種。使用MEGA 5.10軟件，通過(guò)Blast與GenBank中已存的基因進(jìn)行對(duì)比，設(shè)置算法自檢程序Bootstrap設(shè)為1 000次，用最大似然法（Maximal Likelyhood）算法建樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，能夠正常生長(zhǎng)的大部分是個(gè)體較小的藻種，通過(guò)形態(tài)難以準(zhǔn)確判斷它們的所屬類別及其所處的分類地位。在40×10顯微鏡下觀察并拍照，共觀察到8種細(xì)胞形態(tài)（圖1、圖2）。

2.2 藻種系統(tǒng)發(fā)育分析

表1列出了藻種的系統(tǒng)分類及每個(gè)屬的藻種所對(duì)應(yīng)的鏡檢圖。利用MEGA 5.10軟件對(duì)DNA測(cè)序結(jié)果繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖3。試驗(yàn)所測(cè)的DNA序列在GenBank中的序列號(hào)分別是：分離自淡水的藻種KR632631、KR632632、KR632633、KR632634，分離自海水的藻種KR758763、KR758764。

測(cè)序結(jié)果顯示，在所有測(cè)定的藻種中有164個(gè)屬于綠藻門，其中37個(gè)藻種屬于柵藻科，分屬尖帶藻屬（Acutodesmus）、柵列藻屬（Scenedesmus）兩個(gè)屬；最多的種類是小球藻屬（Chlorella），有43個(gè)，同樣屬于綠球藻目小球藻科，另外16個(gè)藻種被確定為月牙藻屬（Selenastrum），22個(gè)藻種被確定為扇帶藻屬（Pectinodesmus）；還有25個(gè)藻種樣品被確定為卵囊藻科（Oocystaeeae）的擬新月藻屬（Closteriopsis）；然而，有12個(gè)藻種（圖1a）只能鑒定到屬于綠藻綱，Blast比對(duì)結(jié)果為綠藻綱（Chlorophyceae），還有24個(gè)藻種（圖1f）未顯示所屬種類。

分離得到的179個(gè)藻種中，小球藻屬最多，有43個(gè)，占總數(shù)的24.0%，柵列藻屬（Scenedesmus）與擬新月藻屬（Closteriopsis）各25個(gè)藻種，各占總數(shù)的14.0%；扇帶藻屬（Pectinodesmus）22個(gè)藻種，占總數(shù)的12.3%；月牙藻屬（Selenastrum）16個(gè)藻種，占總數(shù)的8.9%；尖帶藻屬（Acutodesmus）12個(gè)藻種，占總數(shù)的6.7%。

3 小結(jié)與討論

本研究從天津市采集海水和淡水水樣，分別用BG11和f/2培養(yǎng)基分離微藻，對(duì)微藻進(jìn)行顯微觀察，并用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定，確定其藻種后建立了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分離所得到的179個(gè)藻種中有143個(gè)藻種有準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果，分屬2個(gè)目3個(gè)科6個(gè)屬。本研究初步開(kāi)展了天津本地微藻藻種的分析鑒定工作，為天津本地微藻生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定了一定基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)采用適宜大多數(shù)微藻生長(zhǎng)的BG11和f/2培養(yǎng)基，分離所得到的藻種較少，且均屬于綠藻門綠藻綱，較為單一，其原因可能如下。

1）采用平板分離法。有研究表明，固體培養(yǎng)基中的瓊脂會(huì)抑制除綠藻外其他藻種的生長(zhǎng)。

2）培養(yǎng)基選擇較為單一。篩選出來(lái)的藻種不夠豐富，尚未發(fā)現(xiàn)硅藻和甲藻。如果選取幾種不同的培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，可以增加篩選結(jié)果的豐富度。如邵聰聰?shù)萚22]用廣譜SE培養(yǎng)基及專門篩選單細(xì)胞微藻的Khul培養(yǎng)基篩選出16個(gè)不同屬種的綠藻；李珍寧[23]采用D1培養(yǎng)基篩選出包括小球藻、柵藻和月牙藻在內(nèi)的8種綠藻和2種脆桿硅藻；周應(yīng)科[24]用形態(tài)學(xué)方法分離出36種硅藻和35種綠藻；薛林貴等[25]確定了AB培養(yǎng)基中含有豐富微量元素和維生素B12，藍(lán)藻在其中生長(zhǎng)迅速，能在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高生物量。

3）冬季采樣。冬季湖水中的微藻多樣性和種群密度均有所下降，對(duì)分離結(jié)果有一定影響。許瑾等[26]僅采取BG11培養(yǎng)基對(duì)華南地區(qū)淡水微藻進(jìn)行篩選，分離出包括柵藻屬、盤星藻屬、月牙藻屬、纖維藻屬、小球藻屬、綠球藻屬等在內(nèi)的12種淡水微藻；郝宗娣等[27]分離熱帶淡水產(chǎn)油微藻得到了衣藻屬和空星藻屬共15個(gè)藻種。

4）優(yōu)勢(shì)種抑制了其他物種。從分離結(jié)果來(lái)看，柵藻科占總采樣數(shù)的37.5%，個(gè)體數(shù)量多，生物量較大，分布普遍，占有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，在采樣地成為優(yōu)勢(shì)種，從而抑制了其他物種的生長(zhǎng)發(fā)育。

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