山葡萄查爾酮異構酶（VamCHI）基因的克隆與分析

摘要：采用RT-PCR和RACE技術相結合的方法，從山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）果皮中克隆到查爾酮異構酶（CHI）基因的cDNA全長序列。該基因全長955 bp，包含705 bp的完整開放閱讀框，編碼234個氨基酸。分子量為25.04 kDa，等電點（PI）為5.21。該基因屬于查爾酮超級基因家族，二級結構預測表明，隨機卷曲是VamCHI蛋白質最大量的結構元件，不具有信號肽，屬于穩(wěn)定的親水蛋白質。氨基酸序列與歐亞種葡萄（NP_001268033）、美洲種葡萄（ACS36662）和顯齒蛇葡萄（AGO02170）的同源性較高，相似性分別為98%、98%和91%。

關鍵詞：山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）；cDNA克?。徊闋柾悩嬅?/p>

中圖分類號：S663.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2934-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.057

花色苷（Anthocyanin）是黃酮類化合物中的一類，除了賦予植物器官各種顏色外，在授粉、種子傳播、抵抗紫外線損傷、抵抗病原物侵染等方面具有重要作用[1-3]。花色苷的合成是植物體內黃酮類物質合成途徑的分支之一，合成過程主要分為兩個階段：苯丙氨酸先轉化為4-香豆酰CoA，后合成木質素、香豆素和1，2-二苯乙烯等，該階段稱為苯丙烷類代謝途徑；第二個階段為類黃酮途徑，由4-香豆酰CoA轉化為各種黃酮類化合物，如橙酮、黃酮、黃酮醇、異黃酮、原花色素、花色苷等[4，5]。

查爾酮異構酶（Chalcone isomerase，CHI）是第一個被認識的黃酮類化合物合成相關酶，也是類黃酮生物合成途徑的關鍵酶之一[6]，它參與花色苷合成途徑的第二步反應，催化柚皮苷查爾酮異構化，形成有生物活性的二羥基黃烷酮，雖然這一過程可以自發(fā)發(fā)生，但在CHI的催化作用下其反應速度是原來的107倍[7]。CHI催化分子內的環(huán)化反應，在CHI作用下，底物的2′位羥基失氫與β位斷裂的碳碳雙鍵形成-O-鍵，從而分別形成分子內環(huán)化的（2S）-黃烷酮或（2S）-5-脫氧黃烷酮，其環(huán)化反應都需要底物具有2′位羥基基團[8]。CHI催化活性具有立體異構性，且具有pH依賴性，當pH為7.5時，催化活性為90%，而pH為6.0時催化活性只有50%[9]。

山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）又名野葡萄，最初發(fā)現(xiàn)于中國東北和俄羅斯遠東地區(qū)，在中國主要分布在吉林省的長白山、黑龍江省完達山、小興安嶺、遼寧省北部等地[10]。山葡萄是中國重要的野生果樹資源，具有極強的抗寒性，是東北地區(qū)釀造葡萄酒的主要原料[11]。山葡萄是葡萄屬中果皮顏色最深的品種，花色苷含量約500～1 000 mg/kg，是提取天然色素的極好原料。目前，分子生物技術已廣泛應用于葡萄遺傳育種的各個領域，加速了葡萄遺傳學圖譜、基因的克隆表達、新基因的分離和鑒定等研究的發(fā)展[12]。本試驗為探討CHI在山葡萄次生代謝中的調節(jié)和代謝途徑轉換作用，采用PCR技術和RACE技術從山葡萄果皮中克隆了CHI基因的全長序列，為逐步揭示CHI在山葡萄中的次生代謝途徑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 試材山葡萄雙豐，采自國家山葡萄種質資源圃。采摘無病蟲害、飽滿的成熟期果粒，立即置于液氮中冷凍，-80 ℃冰箱中保存，取其果皮作為供試材料。

1.1.2 菌株、酶及生化試劑 Tris-HCL、CTAB、EDTA、無水LiCl、β-巰基乙醇、DEPC水、AMP、IPTG、X-gal為AITiresco分裝試劑；大腸桿菌（E.coli） DH5a、pMD19-T載體、Taq酶、Marker DL2000購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自OMEGA公司；反轉錄酶SuPerscriptll購自Invitrogen公司；SMARTTM RACE試劑盒購自Clonteeh公司；其他試劑為國產分析純。引物由英俊生物技術有限公司合成，DNA測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 登錄NCBI網站，根據(jù)GenBank中已登陸的CHS基因核苷酸序列和氨基酸序列，通過多序列比對確定其共有的保守區(qū)，利用Primer 6.0軟件設計一對特異引物，上游引物C1（5′-TTAGCGGATTCGGTTGACTT-3′），下游引物C2（5′-CTGGTAGGGACCCATCTTTG-3′），利用引物來擴增中間片段、5′端片段和3′端片段。

1.2.2 山葡萄果皮總RNA的提取及cDNA的合成 采用改良的CTAB法[13]提取山葡萄果皮中的總RNA。用紫外分光光度計測定其OD230 nm、OD260 nm、OD280 nm的吸光度及總RNA濃度，用1%的TAE檢測RNA的完整性。

按照Invitrogen公司的SuperScriptⅡ反轉錄酶試劑盒說明書，以Oligo（dT）20為引物，總RNA為模板進行逆轉錄反應合成cDNA第一條鏈。

1.2.3 PCR擴增目的基因 以山葡萄cDNA第一鏈為模板，用引物C1和C2進行PCR擴增，50 μL反應體系包括：2.0 μL cDNA，5.0 μL 10×Ex Taq Buffer （Mg2+ free），Ex Taq酶（5 U/μL） 0.4 μL，C1和C2引物各1.0 μL，ddH2O 36.6 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的片段。

1.2.4 5′RACE和3′RACE擴增產物 參照SMARTTM RACE試劑盒說明，以逆轉錄合成的3′-RACE-Ready-cDNA為模板，C1和UPM為引物進行3'RACE擴增獲得3′端片段，以5′-RACE-Ready-cDNA為模板，C2和UPM為引物進行5′RACE擴增以獲得5'端片段。

PCR反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共36個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測確定條帶。

1.2.5 目的片段的回收和連接 按照膠回收試劑盒說明書對PCR產物的DNA片段進行回收、連接并轉化。將回收的DNA片段與pMD-18載體連接，16 ℃連接3 h。反應體系：pMD-18載體 0.5 μL DNA片段4.5 μL、SolutionⅠ5 μL。

1.2.6 轉化 將DH5α感受態(tài)細胞解凍后，取50 μL加入10 μL連接產物，冰浴30 min；取出后熱激90 s，然后置于冰上2～3 min；加入預熱的LB液體培養(yǎng)基300 μL，37 ℃ 190 r/min培養(yǎng)1 h.；取適量菌液，涂布于含有AMP、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑白色單克隆置于37 ℃搖床中，200 r/min培養(yǎng)12 h。隨后進行菌液PCR檢測，將成功克隆的菌樣送去測序。

1.2.7 VamCHI基因序列及推測蛋白質的生物信息學分析 VamCHI基因序列及推測蛋白質的生物信息學分析所需軟件及網址見表1。

2 結果與分析

2.1 山葡萄VamCHI基因cDNA全長的克隆及序列分析

以山葡萄果皮總RNA反轉錄的cDNA為模板，用特異引物C1和C2擴增出一條295 bp的預期片段。經Blastn分析發(fā)現(xiàn)，該序列與其他物種CHI基因高度同源，其中與歐亞種葡萄（NP_001268033）同源性達到98%，初步確認其為山葡萄CHI基因的核心序列。根據(jù)所設計的特異引物C1和C2，經RACE擴增、產物克隆和測序后，分別得到長度為678 bp的3'末端和572 bp的5'末端（圖1）。將RT-PCR和RACE擴增片段進行序列拼接得到CHI基因cDNA全長序列，最終獲得1條長為955 bp的cDNA全長序列，經Blastn比對發(fā)現(xiàn)，該cDNA序列與其他物種的CHI基因同源。

應用DNAstar軟件分析發(fā)現(xiàn)，該cDNA包含1個705 bp的完整開放閱讀框，3'-非翻譯區(qū)52 bp，5'-非翻譯區(qū)198 bp，推測其編碼234個氨基酸。GenBank登錄號為KT314072，將其命名為VamCHI。

2.2 VamCHI基因編碼蛋白質理化性質分析

利用ProtParam軟件在線預測分析了VamCHI基因編碼蛋白質的理化性質，發(fā)現(xiàn)該蛋白質由234個氨基酸組成，分子量為25.04 kDa，等電點為5.21。在組成VamCHI蛋白質的20種氨基酸里面纈氨酸（Val）含量最高，達到10.7%；組氨酸（His）、蛋氨酸（Met）、色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）含量最少，均為0.9%。正電荷殘基（Arg+Lys）數(shù)為25個，負電荷殘基（Asp+Glu）數(shù)為30個，不穩(wěn)定指數(shù)為39.94，脂肪指數(shù)89.96，表明VamCHI基因編碼的蛋白質屬于穩(wěn)定蛋白質。

2.3 VamCHI蛋白質保守區(qū)預測

利用NCBI的BlastP軟件，在蛋白質保守區(qū)數(shù)據(jù)庫對山葡萄VamCHI基因進行蛋白質保守區(qū)預測，結果顯示，VamCHI蛋白質具有Chalcone超家族的保守結構域，是一種查爾酮異構酶，屬于CHI家族蛋白質（圖2）。

2.4 VamCHI蛋白質的親水性分析

利用ProtScale軟件分析了山葡萄VamCHI基因氨基酸序列的親水性/疏水性（圖3）。依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強，分值越高疏水性越強的規(guī)律，可明顯看出疏水性最大值在第50位點，值為1.433。最小值在第110位點，值為-1.956，總平均親水性指數(shù)為0.041，整體表現(xiàn)為親水性。

2.5 VamCHI蛋白質的跨膜結構域分析

根據(jù)TMHMM和TMpred Server軟件分析，超過500分的才被認為顯著，通過分析得出，VamCHI蛋白質無跨膜螺旋，故推測VamCHI不含有跨膜結構域。

2.6 VamCHI蛋白質的信號肽預測及二級結構分析

利用SignalP3.0 Server軟件對山葡萄VamCHI基因蛋白質進行信號肽預測，結果表明，VamCHI基因編碼的蛋白質不具有信號肽。

利用網上資源HNN在線預測了VamCHI蛋白質的二級結構（圖4）。結果顯示，該蛋白質的二級結構由44.87%的無規(guī)卷曲、39.74%的α-螺旋和15.38%的β-折疊組成。

2.7 VamCHI蛋白質的細胞定位分析

根據(jù)TargetP 1.1軟件分析，VamCHI蛋白質在葉粒體中的可能性為0.387，在分泌信號途徑中的可能性為0.218，在其他部位的可能性為0.455，可靠性級別為5。經Mitoprot軟件分析可知，其在線粒體外的可能性為0.026 4。運用SubLoc v1.0軟件分析細胞定位可知，其定位在細胞質中，可靠性指數(shù)RI=4，預測精確度（Expected Accurcy）=91%。綜合以上預測推斷，該蛋白質發(fā)揮作用的主要場所可能在細胞質中。

2.8 山葡萄VamCHI編碼蛋白質的同源性及進化分析

登陸NCBI后，利用BlastP在線工具，將克隆得到的VamCHI基因氨基酸序列進行同源性搜索比較。分析發(fā)現(xiàn)，克隆得到的VamCHI基因氨基酸序列與歐亞種葡萄（NP_001268033）、美洲種葡萄（ACS36662）和顯齒蛇葡萄（AGO02170）等的CHI類基因同源性較高，相似性分別為98%、98%和91%。利用GeneDoc軟件，對包括VamCHI在內的10個物種的CHI基因編碼的氨基酸序列進行多重比對分析，結果如圖5所示。

為進一步分析VamCHI與其他植物CHI之間的進化關系，在多重比對的基礎上，利用MEGA 6.0軟件，對該基因及其他植物CHI基因的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析。結果（圖6）表明，山葡萄VamCHI基因與歐亞種葡萄、顯齒蛇葡萄同源性最高，與山竹子、風毛菊和大豆等親緣關系較遠。

3 討論

查爾酮異構酶是類黃酮合成途徑中早期階段的關鍵酶之一，是植物花色素生物合成和豆科異黃酮植物植保素合成所必需的酶。根據(jù)作用底物的不同可以把植物中的CHI分為兩類：TypeⅠ型CHI只能催化6′-羥基查爾酮轉化為5′-羥基黃烷酮；Type Ⅱ型CHI既能催化6′-羥基查爾酮生成5′-羥基黃烷酮，還能將6′-脫氧查爾酮異構化為5′-脫氧黃烷酮[14]。TypeⅠ型CHI存在于絕大部分植物中，TypeⅡ型CHI則主要存在于豆科植物中，目前僅在刺甘草與百脈根等豆科植物中發(fā)現(xiàn)有以上兩種類型CHI的存在[14，15]，據(jù)此推測VamCHI基因編碼的蛋白質屬于Ⅰ型，催化底物為6′-羥基查爾酮。系統(tǒng)進化分析顯示，VamCHI基因與豆科植物大豆的親緣關系較遠，這從某種程度上或許可以說明山葡萄CHI基因屬于TypeⅠ型。本試驗采用生物信息學方法對山葡萄CHI基因的亞細胞定位進行了預測，預測結果表明，CHI定位于細胞質，這與周軍等[16]的歐亞葡萄CHI基因的定位一致。

4 小結

VamCHI基因全長955 bp，屬于查爾酮超級基因家族，其蛋白質最大量的結構元件是隨機卷曲，不含有跨膜結構域，該基因編碼的蛋白質不具有信號肽，整體表現(xiàn)為親水性，是穩(wěn)定的親水蛋白質。氨基酸序列與歐亞種葡萄（NP_001268033）、美洲種葡萄（ACS36662）和顯齒蛇葡萄（AGO02170）等的CHI類基因同源性較高，相似性分別為98%、98%和91%。

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