蓖麻油體固醇蛋白質的鑒定與生物信息學分析

摘要：以擬南芥蛋白質作“種子”在蓖麻（Riciuns communis L.）的蛋白質數(shù)據(jù)庫中搜索，結合關鍵字搜索方法，獲得10個蓖麻油體固醇蛋白質，通過生物信息方法對這些蛋白質進行分析。結果表明，10個蓖麻油體固醇蛋白質外顯子的數(shù)目和內(nèi)含子的位點較保守；氨基酸殘基數(shù)、分子量和等電點相差不大；疏水性/親水性和跨膜結構分析表明，成員間在N-末端第25個氨基酸位點有一個跨膜結構；主要由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲組成；三維結構符合SDR超家族特點；NADPH結合區(qū)域、活性位點較保守，膜錨定區(qū)域和固醇結合區(qū)域差異較大。

關鍵詞：蓖麻（Riciuns communis L.）；油體固醇蛋白質；生物信息學

中圖分類號：S565.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2930-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.056

蓖麻（Riciuns communis L.）是大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻屬（Ricicuns）一年或多年生雙子葉植物，廣泛生長在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，是世界十大重要油料作物之一[1]。植物種子中有一種儲存營養(yǎng)物質的細胞器——油體[2-4]，其內(nèi)部主要成分為三酰甘油，外部則為磷脂單分子層及嵌入其內(nèi)的油體結合蛋白質組成的半單位膜[5]。油體結合蛋白質主要有三種——油脂蛋白質、油體鈣蛋白質和油體固醇蛋白質。油脂蛋白質由N-和C-末端兩個親水區(qū)域及中間疏水錨定區(qū)域組成。N-和C-末端暴露在油體表面，能夠提供空間位阻和負電斥力來維持油體的穩(wěn)定[5]。Chen等[6]在油體中發(fā)現(xiàn)了3種微量蛋白質分別稱為Sop1、Sop2、Sop3。Sop1稱為油體鈣蛋白質。油體鈣蛋白質由N-端親水鈣結合區(qū)域、C-端親水性磷酸化區(qū)域和中間疏水錨定區(qū)域組成，可能在油體成熟、脂肪動員和提高油體穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用[5]。Sop2、Sop3被稱為油體固醇蛋白質-A和油體固醇蛋白質-B[7]。油體固醇蛋白質是一種羥基固醇脫氫酶，屬于SDR家族[8，9]。N-端的疏水區(qū)域由兩個親性α螺旋夾著一個疏水錨定結構組成，在此疏水區(qū)域中部有Pro knob結構[10]，其余部位分為NADPH、固醇結合區(qū)域和兩者之間的活性位點S-（12X）-Y-（3X）-K[10]。Sop3和Sop2蛋白質的固醇結合區(qū)域不同[7]。近來發(fā)現(xiàn)油體蛋白質也存在于根尖和芽等胚后組織中，推測在植物體內(nèi)還存在未被發(fā)現(xiàn)的信號轉導通路[8]。本試驗以擬南芥蛋白質作“種子”在蓖麻的蛋白質數(shù)據(jù)庫中搜索，結合關鍵字搜索方法對蓖麻油體固醇蛋白質進行生物信息學分析，以期為該蛋白質的鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 蓖麻基因組數(shù)據(jù)庫搜索

以“Steroid dehydrogenase”為關鍵字在蓖麻基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net/search.php）中搜索，下載基因、cDNA和蛋白質序列；以6條擬南芥油體固醇蛋白質[11]作為“種子”，分別在蓖麻數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net/search.php）中進行Blastp搜索，E設為1×10-30，獲得同源的油體固醇蛋白質的基因、cDNA和蛋白質序列，去除重復后，再利用NCBI保守結構域分析工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi？）對所獲得的蛋白質家族進行鑒定，檢測是否有SDR（短鏈脫氫/還原酶超家族）的保守結構域。

1.2 蓖麻油體固醇蛋白質生物信息學分析

蓖麻油體固醇蛋白質的理化性質采用Protparam軟件進行預測；內(nèi)含子、外顯子組成采用Spidey軟件進行分析；疏水性/親水性采用ProtScal軟件進行分析；蛋白質二級結構分析采用GOR4軟件進行分析；蛋白跨膜結構域采用TMHMM 2.0 Server軟件；信號肽結構采用SignalP4.1 Server軟件進行預測；蛋白質三維結構分析與同源建模采用CPHmodels軟件和RasMol-Raindy軟件；進化樹的構建采用軟件ClustalW2軟件和MEGA 4.1軟件，所有軟件使用的都是其默認值，部分分析軟件的網(wǎng)址見表1。

2 結果與分析

2.1 蛋白質的一級結構分析

2.1.1 氨基酸序列的理化性質分析 通過綜合分析，最終獲得11條完整的蓖麻油體固醇蛋白質基因，見表2。利用在線分析軟件Protparam對10種油體固醇蛋白質進行分析，得到其對應的氨基酸序列的理化性質，結果見表2。大部分蛋白質成員外顯子數(shù)為3或6，氨基酸殘基數(shù)為317～352，分子量為35.286 0～39.918 9 kDa，等電點PI為5.35～9.57。不穩(wěn)定系數(shù)表明，有8種成員在植物內(nèi)可能階段性出現(xiàn)。親水性大部分都為正值，大部分成員都為親水蛋白質。信號肽預測表明，這11個蛋白質不存在信號肽。由于Slo11蛋白質基因不完整，所以后續(xù)分析中只選擇其他10個蓖麻油體固醇蛋白質。

2.1.2 疏水性/親水性的預測和分析 采用ProtScale軟件對10個蓖麻油體固醇蛋白質進行分析，結果（圖1）表明，以Slo1、Slo9為例，1～40區(qū)域有強烈的疏水性，可能為跨膜區(qū)域與油體內(nèi)部疏水的三酰甘油相接合處，其他區(qū)域無明顯規(guī)律。

2.1.3 跨膜結構的預測和分析 利用在線軟件TMHMM 2.0 Server對10個蓖麻油體固醇蛋白質進行跨膜結構預測，圖2結果表明，除了Slo5蛋白質在氨基酸25、200位點各有一個跨膜區(qū)，其他9個蛋白質（如Slo9）均只在25位點處有一個跨膜結構。

2.2 蛋白質二級結構的預測和分析

采用GOR4軟件分析蓖麻油體固醇蛋白質，結果如圖3所示，65～80、125～130、190～210、240～260范圍內(nèi)主要為α螺旋，45～55、170～180、220～230、285～290范圍內(nèi)主要為β折疊，其他部位沒有明顯的規(guī)律，從二級結構的相似性推測他們可能有相似的空間結構。

2.3 蛋白質三維結構分析與同源建模

利用CPHmodels軟件對10個蓖麻油體固醇蛋白質進行同源建模，并用RasMol-Raindy軟件將結果進行處理，結果見圖4。10個蛋白質成員主體都為α螺旋夾著6～7個β片層的結構，符合SDR超家族的特點，推測結構包含了NADPH和固醇的結合區(qū)域以及活性位點，全部成員中在C-端都預測到了一個卷曲組成的長鏈，可能與油脂固醇蛋白質的功能有關。

2.4 系統(tǒng)進化樹的構建

采用了ClustX 1.83軟件對篩選到的10個蛋白質進行比對，采用MEGA 4.1中的Neighbor-Joining算法，自檢舉1 000次，構建了10個成員的系統(tǒng)進化樹，結果如圖5所示。這10個成員可以分為2大類群，類群Ⅰ由6個成員組成，分別為Slo1、Slo2、Slo3、Slo4、Slo5、Slo6，類群Ⅱ由4個成員組成，分別為Slo7、Slo8、Slo9、Slo10。

2.5 相似性比對分析及保守區(qū)的獲得

利用在線程序ClustalW2進行序列比對，找到10個蓖麻油體固醇蛋白質成員的保守區(qū)域。如圖6所示，活性位點和內(nèi)含子位置已在圖中標出。預測1～40位為跨膜結構，40～190位為NADPH結合區(qū)域，190～210位為活性位點區(qū)域，210位以后為固醇結合區(qū)域。NADPH結合區(qū)域保守性較好。固醇結構區(qū)域保守性不高，預測這些蛋白質成員和不同的固醇結合從而發(fā)揮多種生物學功能。位于NADPH和固醇結合區(qū)域之間的序列包含了活性位點S-（12X）-Y-（3X）-K，其中Y和K兩個位點高度保守，而S位點不是很保守。其中在Slo1、Slo2、Slo3、Slo7、Slo10中S被A取代，在Slo8中S被Q取代，在Sol9中S被L取代。內(nèi)含子位點顯示了Slo1、Slo2、Slo3、Slo4、Slo5、Slo6剪接位點保守，Slo8、Slo9、Slo10剪切位點保守，而Slo7內(nèi)含子位點最復雜，與其他9個成員不同。

3 小結

本試驗通過系統(tǒng)地分析蓖麻基因組數(shù)據(jù)，共鑒定11個蓖麻油體固醇基因，其中10個具有完整的ORF，1個序列缺失。對10個蓖麻油體固醇蛋白質的理化性質、疏水性/親水性、跨膜結構、二級結構、三維結構、進化關系和相似性進行了分析，發(fā)現(xiàn)蓖麻油體固醇蛋白質外顯子的數(shù)目和內(nèi)含子的位點較保守；氨基酸殘基數(shù)、分子量和等電點相差不大；疏水性/親水性和跨膜結構分析表明，成員間在N-末端第25個氨基酸位點有一個跨膜結構；主要由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲組成；三維結構符合SDR超家族特點；NADPH結合區(qū)域、活性位點較保守，膜錨定區(qū)域和固醇結合區(qū)域差異較大。

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