利用可視化膜芯片檢測9種轉(zhuǎn)基因玉米

摘要：建立了一種可同時檢測9種轉(zhuǎn)基因玉米（Zea mays L.）的可視化膜芯片檢測方法。該方法利用紫外交聯(lián)技術(shù)，將9種轉(zhuǎn)基因玉米特異性探針及內(nèi)源性玉米醇溶蛋白基因（Zein）探針和雜交質(zhì)控探針固定于尼龍膜表面制成檢測芯片。通過多重PCR同時擴增多重靶標片段，生物素化產(chǎn)物與檢測芯片雜交。陽性結(jié)果由鏈酶親和素-堿性磷酸酶及顯色底物NBT/BCIP的顯色反應(yīng)在芯片表面形成裸眼可見的點。應(yīng)用商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米（Bt176、Bt11、MON810、GA21、T25、TC1507、DAS-59122、NK603、MIR604）、轉(zhuǎn)基因棉花（MON1445、MON15985）、轉(zhuǎn)基因大豆及非轉(zhuǎn)基因材料檢驗了芯片的性能，結(jié)果表明，制備的檢測芯片具有良好的特異性和重復(fù)性，檢測限為0.5%。芯片鑒定結(jié)果與PCR產(chǎn)物測序結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：玉米（Zea mays L.）；可視化檢測；膜芯片；轉(zhuǎn)基因作物

中圖分類號：S513 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2926-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.055

轉(zhuǎn)基因作物進入食品領(lǐng)域后，有關(guān)轉(zhuǎn)基因食品安全性的問題備受關(guān)注。為保護消費者的知情權(quán)，中國、日本、韓國及一些歐盟成員國均頒布了食品標簽相關(guān)法律法規(guī)，要求對食品中成分進行明確標識（包括是否包含轉(zhuǎn)基因成分），這就需要建立簡便、快速、準確的方法來滿足日常檢測的需求。目前，現(xiàn)有技術(shù)主要是基于PCR[1，2]或多重PCR結(jié)合電泳檢測的方法[3]、實時熒光定量PCR[4]及基于免疫學(xué)的ELISA[5]。由于DNA容易在各種生物樣本中獲得高度的穩(wěn)定性，基于PCR的方法更有優(yōu)勢。然而，傳統(tǒng)PCR方法只能針對單一基因進行檢測。多重PCR雖可同時擴增多重靶標，但很難在后續(xù)電泳檢測中區(qū)分大小相近的片段。同時，基于PCR的方法還存在檢測通量低的局限?；蛐酒哂懈咄俊⑽⑿突?、自動化的技術(shù)優(yōu)勢。近些年，有研究報道了應(yīng)用基因芯片結(jié)合多重PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因事件[6，7]，但現(xiàn)有基因芯片技術(shù)主要以熒光為檢測手段，分析儀器昂貴，并對操作人員具有較高的技術(shù)要求。本研究擬建立一種基于膜芯片的可視化基因芯片檢測方法，該方法將堿性磷酸酶與底物之間的酶學(xué)顯色反應(yīng)引入檢測體系，使陽性結(jié)果在芯片表面形成裸眼可見的點，檢測結(jié)果可裸眼觀察，同時也可配套灰度掃描儀進行定量分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)基因材料主要為種子和玉米粉，包括轉(zhuǎn)基因玉米（Bt176、Bt11、MON810、GA21、T25、TC1507、DAS-59122、NK603、MIR604）、轉(zhuǎn)基因棉花（MON1445、MON15985）、轉(zhuǎn)基因大豆（GTS40-3-2）及非轉(zhuǎn)基因材料。

1.2 試劑及儀器

植物基因組DNA提取試劑盒（DNeasy Plant Mini Kit）、多重PCR試劑盒（Multiplex PCR kit）均為Qiagen公司產(chǎn)品；核酸雜交試劑（DR. Chip DIY KitTM）為臺灣晶宇生物科技公司產(chǎn)品；點樣儀（晶芯SmartArrayer TM-16型）為北京博奧生物芯片有限公司產(chǎn)品；雜交尼龍膜為美國Pall公司產(chǎn)品；PCR儀（Bio-rad）、紫外交聯(lián)儀（Scientz03-Ⅱ型）為寧波新芝科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物及探針設(shè)計

采用軟件Prime premier 5.0設(shè)計引物，共10對。為使PCR適用于加工過的材料，引物按以下原則選取：①擴增產(chǎn)物長度在100～300 bp；②解鏈溫度在55～60 ℃；③適合多重PCR。引物5′端以生物素修飾。探針共12組（包含雜交陽性及陰性質(zhì)控探針），探針設(shè)計應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)在線設(shè)計工具（http：array.iis.sinica.edu.tw/ups/）獲得，同時，以玉米醇溶蛋白基因（Zein）作為內(nèi)源參照基因設(shè)計探針，以EV71病毒基因特異性探針作為雜交陽性質(zhì)控（生物素化EV71病毒基因PCR產(chǎn)物由DR. Chip DIY KitTM試劑盒提供），poly（T）30作為雜交陰性質(zhì)控，所有探針5′端以poly（T）15修飾。引物及探針序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物及探針序列見表1。

1.4 膜芯片制備

應(yīng)用芯片點樣儀將合成探針按預(yù)設(shè)模式點樣于尼龍膜上（圖1），陰性、陽性雜交質(zhì)控探針濃度為10 μmol/L，其他探針濃度為20 μmol/L。探針點好后自然風(fēng)干，于紫外交聯(lián)儀中交聯(lián)，波長254 nm， 3 min。紫外交聯(lián)后用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）-0.05%Tween 20漂洗3次，再用去離子水漂洗3次，風(fēng)干密封，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 基因組DNA提取

所有測試樣本基因組DNA用植物基因組DNA提取試劑盒（DNeasy Plant Mini Kit）提取，操作步驟參見試劑盒說明。應(yīng)用紫外分光光度計測定DNA的純度和濃度。

1.6 多重PCR擴增

將樣本DNA濃度稀釋至50～100 ng/μL，于0.2 mL PCR反應(yīng)管中依次加入PCR緩沖液、dNTP、DNA模板、引物、Hotstar Taq酶，補充去離子水至30 μL，各組分濃度參照試劑盒說明書。多重PCR條件如下：94 ℃變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.7 芯片雜交及結(jié)果判定

PCR產(chǎn)物于PCR儀中95 ℃變性5 min后立即置于冰上，3 min后取5 μL與100 μL雜交緩沖液（雜交緩沖液含有雜交陽性質(zhì)控探針互補片段）混勻，加樣于芯片點樣區(qū)，用蓋玻片封閉，于45 ℃雜交40 min。雜交完成后，用清洗液（DR. Chip DIY KitTM試劑盒提供）清洗2次，再滴加100 μL 1∶1 000稀釋的Streptavidin-AP孵育15 min，用清洗液清洗2次，加入50倍稀釋的底物NBT/BCIP，避光室溫反應(yīng)5 min后棄掉顯色液，用去離子水洗2次，吹干，裸眼觀察雜交結(jié)果。

2 結(jié)果及分析

2.1 芯片檢測的特異性

芯片檢測特異性與探針特異性密切相關(guān)，本研究應(yīng)用在線探針設(shè)計程序UPS設(shè)計了相關(guān)轉(zhuǎn)基因玉米的探針[8-10]。為了驗證芯片檢測的特異性，應(yīng)用制備的膜芯片檢測商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因材料（玉米、棉花、大豆）及非轉(zhuǎn)基因材料。為提高檢測效率，首先對作物種類進行初篩。選擇玉米醇溶蛋白基因作為玉米的內(nèi)源參照基因，同時為驗證雜交過程的正常進行，以EV71相關(guān)序列設(shè)計了雜交陽性質(zhì)控（其互補序列整合在試劑盒提供的雜交緩沖液中）。圖2為芯片檢測的鑒定結(jié)果，對應(yīng)探針位點、內(nèi)源參照基因位點和陽性質(zhì)控位點均有明顯的信號響應(yīng)。轉(zhuǎn)基因大豆、棉花及非轉(zhuǎn)基因材料除雜交陽性對照點外，無任何信號反應(yīng)。同時，對芯片鑒定的樣本也進行了PCR產(chǎn)物測序比對分析，與芯片鑒定結(jié)果一致。結(jié)果表明，芯片具有良好的檢測特異性。為了進一步檢驗芯片多重靶標分析的能力，將不同轉(zhuǎn)基因株系基因組DNA混合進行多重PCR，然后進行芯片檢測，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可見，制備的檢測芯片可以進行多靶標的同時檢測。芯片上不同點之間信號強度存在一定差異，這是由于在多重PCR過程中不同引物對之間相互影響，導(dǎo)致不同的擴增效率，但并不影響對多重靶標的同時鑒定。

2.2 芯片檢測的靈敏度

為了確定芯片檢測的靈敏度，以Bt176為材料，將轉(zhuǎn)基因玉米Bt176與非轉(zhuǎn)基因玉米按不同比例混合（轉(zhuǎn)基因玉米占總混合材料0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%），以此混合樣品提取DNA后進行PCR擴增，應(yīng)用檢測芯片進行檢測。結(jié)果表明（圖4），隨著轉(zhuǎn)基因成分含量逐漸減少，雜交信號逐漸減弱，0.5%的轉(zhuǎn)基因Bt176就可以被檢測出來。

2.3 芯片檢測的重復(fù)性

為了測試芯片檢測的重復(fù)性，利用同批次及不同批次制備的芯片對同一個轉(zhuǎn)基因株系樣本Bt176進行檢測，批內(nèi)及批間制備的芯片均成功鑒定，結(jié)果表明檢測芯片具有良好的重復(fù)性。

3 小結(jié)

本研究建立的可視化膜芯片技術(shù)可同時檢測9種轉(zhuǎn)基因玉米，減少了對昂貴儀器的依賴及對操作人員的技術(shù)要求，具有快速、準確、廉價及簡便易行的特點，在轉(zhuǎn)基因作物檢測領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。

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