水稻可溶性O(shè)sVDAC5蛋白的外源表達(dá)及鑒定

摘要：通過(guò)生物信息學(xué)分析確定水稻（Oryza sativa L.）OsVDAC5的可溶性肽段，將相應(yīng)的編碼區(qū)克隆于pGEX-4T-1原核表達(dá)載體中，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和GST親和層析純化，利用SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)目的蛋白。結(jié)果表明，成功構(gòu)建的pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)體外IPTG誘導(dǎo)，在35 kDa處可檢測(cè)到可溶性目的蛋白，并獲得外源蛋白表達(dá)的最適溫度為15 ℃和最佳誘導(dǎo)時(shí)間為8 h；經(jīng)過(guò)GST親和層析，SDS-PAGE可檢測(cè)到較為單一的蛋白條帶，得到純化的GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；OsVDAC5；可溶性表達(dá)；親和層析

中圖分類(lèi)號(hào)：S511；Q816 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）11-2921-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.054

電壓依賴(lài)性陰離子通道蛋白（Voltage-dependent anion channels，VDAC）是線(xiàn)粒體外膜上具有高度保守性的孔狀蛋白，由一種小的多基因家族編碼，廣泛存在于真核生物中[1]，并在能量代謝、細(xì)胞凋亡、物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著決定性作用[2-4]。VDACs最早從草履蟲(chóng)（Paramecium aurelia）線(xiàn)粒體外膜上分離得到[5]。哺乳動(dòng)物中主要有3種VDAC亞型[6]，真菌中主要有2種亞型[6]，而在植物中，煙草中至少有3種VDAC亞型，大豆、蒺藜苜蓿、百脈根和擬南芥中至少有5種不同的亞型[7-10]，水稻中存在8個(gè)VDAC基因[11]。與哺乳動(dòng)物和真菌相比，植物中有更多的VDAC異型體，表明植物VDAC具有多種不同的功能，但它們都有著相同的離子選擇性和電壓依賴(lài)性特性，并且具有相似的電生理學(xué)特征，說(shuō)明VDAC在結(jié)構(gòu)和功能上具有一定的保守性[12]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)植物VDAC在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育階段以及在生物和非生物脅迫響應(yīng)方面都發(fā)揮著重要作用[10，13，14]。擬南芥中AtVDAC3能同葉綠體蛋白AtTrx m2相互作用，參與ROS信號(hào)通路，以應(yīng)答鹽脅迫[15]；AtVDAC1能同CBL1相互作用，在種子萌發(fā)與植物發(fā)育過(guò)程中負(fù)調(diào)控植物對(duì)外界溫度的應(yīng)答[13]。超表達(dá)OsVDAC3顯著提高了水稻的抗鹽性和抗旱性[16]。前期研究表明，OsVDAC5基因在YTA水稻生殖生長(zhǎng)期達(dá)到最高表達(dá)水平[17]，表明OsVDAC5基因可能在水稻YTA的生殖發(fā)育期發(fā)揮重要功能。

在體外以大腸桿菌為宿主菌高效表達(dá)外源基因時(shí)，表達(dá)蛋白常常在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成包涵體。以包涵體形式存在的蛋白質(zhì)分子無(wú)定形，呈非水溶性，無(wú)生物活性，為后續(xù)研究帶來(lái)諸多不便[18]。VDAC蛋白為線(xiàn)粒體外膜蛋白，在原核表達(dá)時(shí)由于無(wú)法形成正確的次級(jí)鍵，大多以包涵體形式存在。雖然可以通過(guò)包涵體蛋白變性、復(fù)性等方法獲得可溶性蛋白，但蛋白質(zhì)的復(fù)性效率低，得到的可溶性蛋白常常會(huì)在結(jié)構(gòu)上發(fā)生改變，不利于后期進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)的功能[19]。研究表明，全長(zhǎng)的OsVDAC5基因在體外表達(dá)時(shí)以包涵體形式存在[20]，因此，本研究擬通過(guò)生物信息學(xué)分析，將OsVDAC5基因截短為可溶性肽段，構(gòu)建pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）基因片段的原核表達(dá)載體進(jìn)行體外表達(dá)，以獲得可溶性目的蛋白，為OsVDAC5互作蛋白的研究及其在水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 原核表達(dá)載體pGEX-4T-1、大腸桿菌菌株DH5α、BL21（DE3）以及pET-32a-OsVDAC5質(zhì)粒均由中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 限制性?xún)?nèi)切酶Quick CutTM BamH Ⅰ、Quick CutTM Xho Ⅰ，T4-DNA連接酶，Ex Taq酶，DL15 000和DL2 000 DNA Marker，GST Fusion Protein Purification Kit均購(gòu)自Takara公司。DNA凝膠回收和清潔試劑盒均購(gòu)自Axygen公司。Page RulerTM Prestained Protein Ladder購(gòu)自Thermo公司。GST Tag Mouse Monoclonal Antibody及二抗羊抗鼠購(gòu)自Abbkine公司。超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。引物合成及測(cè)序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 C1000 Touch Thermal Cycler 型PCR儀和凝膠成像分析儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD公司；Model 1 000分子雜交箱，購(gòu)自美國(guó)Robbins Scientific Corporation；752N型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自上海精科公司；Centrifuge 5415D、5417R和5810R離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Eppendoff公司；CR22G型高速離心機(jī)，購(gòu)自日本Hitachi公司；Soniprep 150型超聲破碎儀，購(gòu)自日本SANYO公司；半干式碳板轉(zhuǎn)移電泳槽、DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和膠片觀察燈，購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 OsVDAC5跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用生物信息學(xué)分析方法和不同在線(xiàn)生物學(xué)軟件（PRED-TMBB：http：//bioinformatics.biol.uoa.gr/PRED-TMBB/；BOCTOPUS： http：//boctopus.cbr.su.se/）對(duì)OsVDAC5蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜情況進(jìn)行初步預(yù)測(cè)和分析。

1.2.2 pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)OsVDAC5基因序列，以BamHⅠ和XhoⅠ作為酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，以pET-32a-OsVDAC5質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增目的片段。引物為Fw（5′CGCGGATCCATGAGCAAAGGCCCAGC3′）、Rv（5′CC GCTCGAGAGATTCACTATCAATCTTGACATCA3′）。采用20 μL體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，各反應(yīng)物濃度：15.3 μL ddH2O，2 μL 10×Ex Taq Buffer，1 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.3 μL Fw（10 mmol/L），0.3 μL Rv（10 mmol/L），1 μL稀釋100倍的pET-32a-OsVDAC5質(zhì)粒，0.1 μL Ex Taq酶。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，重復(fù)34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后使用AxyPrep DNA清潔試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行清潔回收，詳細(xì)操作參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，并進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ同時(shí)雙酶切目的片段和pGEX-4T-1空載體，37 ℃酶切3～4 h，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。用T4連接酶連接雙酶切后的目的基因和pGEX-4T-1載體，16 ℃連接過(guò)夜并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂LB（含Amp+）平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單克隆，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定，將對(duì)應(yīng)陽(yáng)性克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.3 GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

1）融合蛋白的誘導(dǎo)。將pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）重組質(zhì)粒和pGEX-4T-1空載體轉(zhuǎn)化BL21（DE3）表達(dá)菌株，涂LB（含Amp+）平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。分別挑取單克隆于3 mL含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，第二天按1∶100的比例（V/V）接種于5 mL含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.6左右，加入1 mol/L IPTG至終濃度為0.7 mmol/L，分別于10、15、25、37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，分別在誘導(dǎo)4、6、8 h時(shí)取樣5 mL，檢測(cè)誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)可溶性蛋白表達(dá)的影響。同時(shí)，誘導(dǎo)不加IPTG的pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）和加IPTG的pGEX-4T1空載體的BL21菌株作為陰性對(duì)照。

2）融合蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，向菌體中加入1 mL預(yù)冷的1×PBS（pH 7.4）緩沖液，緩慢用槍頭吹打菌體使菌體重懸，冰水混合物中進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎，每管破碎10 s，間隔10 s，共破碎2～3 min，收集空載體混合液。其余蛋白混合液于4 ℃，12 000 r/min離心15 min，分別收集蛋白上清液。向蛋白沉淀中加入1 mL蛋白沉淀變性液（10 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，pH 8.0）室溫放置1 h，期間混勻2～3次，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，即為沉淀液。取出各樣品200 μL，加入適量的5×SDS PAGE Loading buffer混合均勻，100 ℃煮沸10 min，80 V恒壓進(jìn)行12% SDS-PAGE檢測(cè)?？捡R斯亮藍(lán)染色液染色3 h后換脫色液，進(jìn)行脫色觀察。

3）融合蛋白的Western Blot檢測(cè)。對(duì)15、25、37 ℃條件下誘導(dǎo)8 h的蛋白上清液和沉淀液點(diǎn)樣進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。半干式轉(zhuǎn)膜儀80 mA恒流轉(zhuǎn)膜2.5 h后，加入40 mL蛋白封閉液室溫封閉1 h，按1∶5 000的比例（V/V）向封閉液中加入GST抗體， 4 ℃振蕩過(guò)夜，第二天按1∶10 000的比例（V/V）向封閉液中加入二抗羊抗鼠，孵育箱內(nèi)25 ℃振蕩孵育1.5 h后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.2.4 GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白的純化 采用金斯瑞GST Fusion Protein Purification Kit對(duì)蛋白進(jìn)行親和層析。向?qū)游鲋屑尤? mL Glutathione Resin懸浮液，用10 mL預(yù)冷的1×PBS（pH 7.4）緩沖液平衡層析柱，將3 mL破碎后蛋白上清液加入層析柱，4 ℃緩慢振蕩孵育過(guò)夜。第二天收集流出液，加入32 mL預(yù)冷1×PBS（pH 7.4）緩沖液洗脫未和谷胱甘肽結(jié)合的蛋白，每次加入4 mL，孵育3 min，收集最后一次洗脫液。最后加入7 mL 10 mmol/L還原型GSH洗脫柱子上的蛋白，每次加入1 mL，孵育5 min，收集洗脫液。取出各樣品100 μL，加入適量的5×SDS PAGE Loading buffer混合均勻，100 ℃煮沸10 min，80 V恒壓進(jìn)行12%SDS-PAGE檢測(cè)。考馬斯亮藍(lán)染色液染色3 h后換脫色液，進(jìn)行脫色觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsVDAC5跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

前期構(gòu)建了全長(zhǎng)OsVDAC5基因原核表達(dá)載體，但是表達(dá)的蛋白以包涵體的形式存在，因此本研究利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了OsVDAC5的跨膜方式，將PRED-TMBB和BOCTOPUS這兩個(gè)專(zhuān)門(mén)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中β折疊結(jié)構(gòu)的生物學(xué)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比（圖1）。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，OsVDAC5在線(xiàn)粒體外膜上可能分別以十二次跨膜（PRED-TMBB）或十八次跨膜（BOCTOPUS）的結(jié)構(gòu)存在，而且OsVDAC5蛋白的N端和C端有可能均位于線(xiàn)粒體雙層膜之間的膜間隙內(nèi)。因此，僅保留OsVDAC5蛋白75個(gè)氨基酸殘基，構(gòu)建只含N端75個(gè)氨基酸的pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達(dá)載體。

2.2 pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增鑒定pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）重組質(zhì)粒，檢測(cè)到目的基因的大小為250 bp。利用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，檢測(cè)到大小為5 000、250 bp的兩個(gè)條帶，與預(yù)期的條帶大小相同。將構(gòu)建好的載體測(cè)序，測(cè)序結(jié)果100%匹配，表明pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖2）。

2.3 SDS-PAGE檢測(cè)GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將陽(yáng)性重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌株，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后，用12%SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色，可觀察到在10、15、25、37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)條件下，4、6、8 h時(shí)在35 kDa的上清液和沉淀中均有蛋白表達(dá)，其大小與預(yù)測(cè)的GST-OsVDAC5（1-75aa）的蛋白產(chǎn)物大小相同，且不同溫度在8 h時(shí)蛋白的表達(dá)量較4、6 h高，15 ℃時(shí)上清液中的表達(dá)量較沉淀高。結(jié)果表明，OsVDAC5（1-75aa）基因在pGEX-4T-1系統(tǒng)中得到了高效表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物為部分可溶性蛋白（圖3）。

2.4 Western blot檢測(cè)GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

用GST單抗對(duì)10、15、25、37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)條件下誘導(dǎo)8 h的蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，IPTG誘導(dǎo)后的pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白在35 kDa左右處的上清液和沉淀中均出現(xiàn)單一的信號(hào)條帶，而未加IPTG誘導(dǎo)的pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）和空載體蛋白樣品在35 kDa左右處未見(jiàn)表達(dá)（圖4）。此結(jié)果進(jìn)一步表明pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）載體構(gòu)建成功，且GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白可在上清液中高效表達(dá)。

2.5 GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白的純化

GST融合蛋白與固定的谷胱甘肽（GSH）通過(guò)硫鍵共價(jià)親和，利用谷胱甘肽與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）之間酶和底物的特異性作用力，使得帶GST標(biāo)簽的GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白能夠與凝膠上的谷胱甘肽結(jié)合，從而將該蛋白與其他蛋白分離開(kāi)。由于GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白在上清液中高效表達(dá)，因此通過(guò)10 mmol/L還原型GSH洗脫后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，在35 kDa處可觀察到較為單一的蛋白條帶，得到純化的可溶性GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白（圖5）。

3 小結(jié)與討論

在植物中VDACs高度保守，但對(duì)不同VDAC的特定功能知之甚少。OsVDAC5互作蛋白的研究對(duì)揭示OsVDAC5蛋白的功能有重要意義。同時(shí)，進(jìn)行體外Pull-down試驗(yàn)時(shí)通常需要可溶性的VDAC蛋白。因此，獲得外源表達(dá)的可溶性蛋白至關(guān)重要。

試驗(yàn)室前期構(gòu)建了帶有His標(biāo)簽的pET-32a-OsVDAC5和pET-302a-OsVDAC5原核表達(dá)載體以及帶有GST標(biāo)簽的pGEX-4T-1-OsVDAC5原核表達(dá)載體，但是體外表達(dá)的OsVDAC5融合蛋白幾乎都以包涵體的形式存在，暫時(shí)無(wú)法純化出可溶性的目的蛋白[20]，即全長(zhǎng)的OsVDAC5基因在體外可能較難表達(dá)可溶性蛋白。因此，通過(guò)生物信息學(xué)的方法分析OsVDAC5的二級(jí)結(jié)構(gòu)及跨膜區(qū)域，將OsVDAC5基因截短為只含N端的75個(gè)氨基酸進(jìn)行體外表達(dá)。通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件，結(jié)果獲得了純度較為理想的可溶性GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白，也為OsVDAC5互作蛋白的研究和其在水稻中相關(guān)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

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