不結(jié)球白菜BcGAPDH的生物信息學分析

摘要：采用生物信息學方法對克隆測序的不結(jié)球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）BcGAPDH （3-磷酸甘油醛脫氫酶）蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、跨膜區(qū)、親水性、亞細胞定位、所含模體及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行了預測。理化性質(zhì)分析表明，該酶含有328個氨基酸，相對分子量為35 161.2，pI值為9.03。TMpred跨膜分析表明，該酶沒有跨膜螺旋區(qū)，這與ProtScale預測的該酶為親水性蛋白質(zhì)相吻合。用Target P server程序預測該酶定位于線粒體上，結(jié)構(gòu)域分析表明該酶含有多種磷酸化位點，二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和隨機卷曲為主。借助SWISS-MODEL軟件對該酶進行了三維同源建模。

關(guān)鍵詞：不結(jié)球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）；BcGAPDH；生物信息學

中圖分類號：S634.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2917-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.053

三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一直被作為糖酵解過程的重要角色來研究，在糖酵解和糖異生過程中是關(guān)鍵酶，參與糖酵解過程中第一個ATP的形成[1]，使3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)變?yōu)?，3-二磷酸甘油醛。該酶在生物體中高效表達，且通常作為一種模式蛋白質(zhì)用于蛋白質(zhì)和酶的分析，也可以用作研究基因表達量的內(nèi)在對照。

作為一個含量豐富的胞內(nèi)蛋白質(zhì)，GAPDH成為一個實用模型，用于研究酶作用機制以及氨基酸序列與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，被認定為“看家基因”的GAPDH又提供了一個基因分析的模型，用于研究細胞組成和遺傳信息的表達。經(jīng)過一系列的研究，特別是近10年的快速進展，已經(jīng)表明GAPDH不是一個純粹簡單的糖酵解蛋白質(zhì)，它還具有以下生理功能[2-8]：①膜融合，抑制GAPDH活性后能明顯抑制有絲分裂后期的核膜組裝，而再加入有活性的GAPDH后，核膜組裝修復；②囊泡運輸，參與囊泡轉(zhuǎn)運，且與其糖酵解功能無關(guān)；③蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶的分子伴侶，為轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1的特異分子伴侶；④DNA修復，GAPDH的37 KDa亞基與胎盤提取的尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）具有同樣的DNA修復活性；⑤其他功能，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，調(diào)節(jié)RNA的核輸出，介導微管的相互作用，轉(zhuǎn)鐵蛋白質(zhì)的活性等。

目前，許多植物的GAPDH基因均已被克隆，但是關(guān)于其酶蛋白分子的結(jié)構(gòu)和功能的進一步研究鮮見報道。本試驗采用生物信息學方法對已克隆測序的不結(jié)球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）BcGAPDH（3-磷酸甘油醛脫氫酶）蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、跨膜區(qū)、親水性、亞細胞定位、所含模體及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行了預測，為進一步研究該蛋白質(zhì)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

以南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院白菜課題組克隆測序的不結(jié)球白菜3-磷酸甘油醛脫氫酶（BcGAPDH）基因相關(guān)數(shù)據(jù)為研究對象，其DDBJ登錄號為AB331373。

1.2 方法

利用ProtParam分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)[9]；利用TMpred、PHDhtm和ANTHEPROT軟件分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域[10]；利用ProtScale分析蛋白質(zhì)的親水性[9]；采用SignalP v3.0進行信號肽分析[10]；分別利用Target P server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）、Subloc V server（http：//www.bioinfo.tsinghua. ed.cn/SubLoc/eu-predict.htm）和WOLFPSORT server（http：//psort.nibb.ac.jp）預測蛋白質(zhì)的亞細胞定位情況；利用在線軟件ScanProsite（http：//www.expasy.org/cgi-bin/prosite/ScanView）分析蛋白質(zhì)所含模體；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測和三維建模分別使用在線軟件SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）和SWISS-MODEL完成[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

對不結(jié)球白菜BcGAPDH氨基酸序列的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果表明，該酶含有328個氨基酸，總相對分子量為35 161.2，理論等電點pI值為9.03，負電荷氨基酸（Asp+Glu） 37個，正電荷氨基酸（Arg+Lys）36個，分子式C1558H2507N433O473S9，原子總數(shù)

4 980，摩爾消光系數(shù)1.043（胱氨酸全按半胱氨酸計），該酶蛋白不穩(wěn)定性參數(shù)為20.46，屬于穩(wěn)定蛋白，其脂肪系數(shù)為99.54，平均親水性（GRAVY）為0.006，預測該蛋白質(zhì)為水溶性蛋白質(zhì)。

2.2 不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域及疏水性的預測和分析

用TMpred在線軟件對不結(jié)球白菜BcGAPDH氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預測，結(jié)果（圖1）表明，不結(jié)球白菜BcGAPDH整條肽鏈都位于細胞膜外，說明其不存在跨膜區(qū)。此外，利用在線軟件PHDhtm和ANTHEPROT對該酶跨膜螺旋進行預測，結(jié)果與TMpred所預測的結(jié)果一致，即均沒有跨膜螺旋。因此，此被預測的跨膜螺旋區(qū)可信度較高。

蛋白質(zhì)的疏水性分析是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)預測中一個必要過程，通過分析可以得到蛋白質(zhì)的親疏水區(qū)域，一方面為二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果提供參考，另一方面為結(jié)構(gòu)域以及功能域的劃分提供依據(jù)。因此，對不結(jié)球白菜BcGAPDH氨基酸序列進行疏水性分析，結(jié)果（圖2）表明，多肽鏈第304位的氨基酸具有最低分值-4.500，親水性最強；第212位的氨基酸具有最高分值4.200，疏水性最強。整體來看，親水性氨基酸均勻分布在整個肽鏈中，且多于疏水性氨基酸。因此，整個多肽鏈表現(xiàn)為親水性，沒有明顯的疏水區(qū)域，可認為不結(jié)球白菜BcGAPDH是親水性蛋白質(zhì)。結(jié)合跨膜結(jié)構(gòu)域的預測結(jié)果，可以推斷不結(jié)球白菜BcGAPDH不存在明顯的疏水區(qū)域，與其不存在跨膜結(jié)構(gòu)域的特征相吻合。

2.3 不結(jié)球白菜BcGAPDH信號肽及亞細胞定位的預測和分析

信號肽分析有助于蛋白質(zhì)功能域的區(qū)分及蛋白質(zhì)細胞定位。SignalP v3.0軟件是神經(jīng)網(wǎng)絡、隱馬爾科夫模式工具[12]，將不結(jié)球白菜BcGAPDH的ORF通過該軟件分析（圖3），獲得ORF的Cmax值為0.083、Ymax值為0.083、Smean值為0.561、Smean值為0.182，前3個值的位點分別在第25、25、1位。根據(jù)軟件的默認選擇，將Cmax值>0.5和Smean值>0.5的ORF確定為具有信號肽。根據(jù)分析結(jié)果，此信號肽計算結(jié)論為NO，表示沒有信號肽存在。

對基因產(chǎn)物在亞細胞位置的了解對判定這些基因產(chǎn)物的功能起著重要作用。用Target P server程序進行不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)的亞細胞定位，結(jié)果表明，基本確認BcGAPDH蛋白質(zhì)在線粒體中發(fā)揮生物學作用，氨基酸序列長度為328個，定位于葉綠體、線粒體和其他細胞部分的得分分別為0.031、0.745、0.572，作為信號肽的可能性為0.018，軟件的最終定位預測在線粒體，可信度為5。用 Subloc V server和WOLFPSORT server程序進行驗證分析，結(jié)果一致。

2.4 不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)的模體分析

將不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)的氨基酸序列利用在線軟件ScanProsite進行分析，發(fā)現(xiàn)其含有多種模體位點（圖4），其中包括1個氨基化合物位點（M1），1個依賴于cAMP或cGMP的蛋白質(zhì)激酶磷酸化位點（M2），6個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（M3），3個N-糖基化位點（M4），6個N-肉豆蔻?；稽c（M5），4個蛋白質(zhì)激酶C磷酸化位點（M6）。

2.5 不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預測分析

利用SOPMA在線工具預測不結(jié)球白菜 BcGAPDH蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示，BcGAPDH含有比較豐富的二級結(jié)構(gòu)，由112個氨基酸殘基組成α螺旋結(jié)構(gòu)，占全部氨基酸殘基的34.15%；82個氨基酸殘基組成延伸鏈，占全部氨基酸殘基的25.00%；由21個氨基酸殘基組成β轉(zhuǎn)角，占全部氨基酸殘基的6.40%；由113個氨基酸殘基組成隨機卷曲，占全部氨基酸的34.45%。可以看出，隨機卷曲和α-螺旋是BcGAPDH多肽鏈中的主要結(jié)構(gòu)元件，延伸鏈散布于整個蛋白質(zhì)中。

2.6 不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預測

將不結(jié)球白菜BcGAPDH氨基酸序列上傳到SWISS-MODEL的建模服務器中進行三維建模[13，14]，然后在ViewerLite 4.2軟件中進行序列編輯，獲得BcGAPDH的三級結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果如圖6所示。

3 討論

GAPDH生物學的多功能性基于不同的研究結(jié)果，這些新的發(fā)現(xiàn)可以分為2組：第1組包括鑒定GAPDH新活性的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAPDH有別于傳統(tǒng)的脫氫酶活性的新功能；第2組包括鑒定GAPDH與細胞內(nèi)大分子的特異性結(jié)合，為GAPDH新功能提供了重要證據(jù)。

早期的研究證明GAPDH是一個膜結(jié)合蛋白[15]，發(fā)現(xiàn)細胞中60%～70%的GAPDH能與膜結(jié)合，但不結(jié)球白菜BcGAPDH不具有該活性，因為通過本試驗分析該酶無跨膜區(qū)，是親水性蛋白質(zhì)。另外，研究表明，GAPDH還具有磷酸轉(zhuǎn)移酶/激酶的活性，不僅能自身磷酸化，而且還能磷酸化其他蛋白質(zhì)。本試驗對不結(jié)球白菜BcGAPDH蛋白質(zhì)的模體分析發(fā)現(xiàn)，該酶包括蛋白質(zhì)激酶磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和蛋白質(zhì)激酶C磷酸化位點，表明BcGAPDH在不結(jié)球白菜體內(nèi)具有磷酸化活性，BcGAPDH在其細胞病毒生理學上可能扮演著重要角色。

GAPDH廣泛存在于眾多生物體中，并且具有高度種屬保守序列，它作為一個多功能蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系仍有待研究。目前，GAPDH在機體的生理和病理狀態(tài)下的作用越來越引起有關(guān)學者的關(guān)注。但迄今為止，GAPDH在細胞中的功能還沒有完全搞清楚，因此，本試驗對不結(jié)球白菜BcGAPDH結(jié)構(gòu)和功能的分析將有助于研究者進一步了解GAPDH反應的機制及所需條件。

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