QuEChERS結(jié)合HPLC—MS/MS法測定鮮煙葉中的2種抑芽劑

摘要：建立鮮煙葉中二甲戊樂靈、仲丁靈2種抑芽劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）檢測方法。以乙腈為提取溶劑，對(duì)鮮煙葉中2種抑芽劑進(jìn)行提取，采用新型復(fù)合吸附劑的QuEChERS凈化方法，用N-丙基乙二胺（PSA）、C18和石墨化碳黑（GCB）3種復(fù)合吸附劑凈化，HPLC-MS/MS測定，以電噴霧正離子模式（ESI+），iFunnel離子聚焦，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下進(jìn)行檢測，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。通過優(yōu)化條件，在10～500 μg/kg范圍內(nèi)，二甲戊樂靈、仲丁靈的檢測線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.995，檢出限（LOD）為1.5～2.4 μg/kg，定量限（LOQ）為5.0～7.9 μg/kg，在3個(gè)添加水平下的回收率范圍88.1%～96.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.2%～9.3%。試驗(yàn)方法可用于鮮煙葉中二甲戊樂靈、仲丁靈抑芽劑的準(zhǔn)確測定。

關(guān)鍵詞： QuEChERS；復(fù)合吸附劑；抑芽劑；鮮煙葉；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）

中圖分類號(hào)：O657.7；TS41+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）11-2888-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.045

煙草抑芽劑主要包括馬來酰肼、二甲戊樂靈、仲丁靈和氟節(jié)胺4種，可以提高煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)，其中二甲戊樂靈、仲丁靈（圖1）在煙葉中的殘留量較低，成為了目前成熟、研究多、應(yīng)用廣泛的2種煙草抑芽劑[1，2]，但有研究表明這2種抑芽劑可以毒害細(xì)胞并損害DNA，引發(fā)直腸癌和肺癌[3-5]。2014年，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定二甲戊樂靈和仲丁靈這2種抑芽劑的每日允許攝入量（ADI）分別為0.03和0.2 mg/kg[6]。抑芽劑關(guān)系到煙草質(zhì)量安全，生產(chǎn)者需要對(duì)抑芽劑使用以及在鮮煙葉中的殘留進(jìn)行監(jiān)測，以防止抑芽劑的濫用[7，8]。因此，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的鮮煙葉中抑芽劑的檢測方法迫在眉睫。

已有關(guān)于不同基質(zhì)中抑芽劑類物質(zhì)分析方法的研究報(bào)道，常見的前處理方法有液液萃?。↙LE）[9]、固相萃取（SPE）[10]、凝膠滲透色譜法（GPC）[11，12]和QuEChERS[13，14]，這幾種方法都存在一些不足之處，如LLE有機(jī)溶劑消耗量大，SPE操作復(fù)雜，GPC方法重現(xiàn)性不好。經(jīng)典的QuEChERS方法雖簡便快速，但采用單一吸附劑難以去除鮮煙葉中對(duì)質(zhì)譜檢測干擾較大的葉綠素、糖類、脂肪酸等雜質(zhì)，也無法適用于鮮煙葉中抑芽劑的殘留分析。關(guān)于鮮煙葉中抑芽劑的檢測方法，國內(nèi)鮮有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究采用新型復(fù)合吸附劑的QuEChERs凈化方法，有效地去除鮮煙葉中雜質(zhì)的干擾，結(jié)合HPLC-MS/MS技術(shù)，能夠快速、簡便、準(zhǔn)確地測定鮮煙葉中二甲戊樂靈、仲丁靈2種抑芽劑的殘留。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent 1290高效液相色譜儀、Agilent 6490三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；超純水系統(tǒng)（美國Millipore Milli-Q Gradient公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；氮吹儀（美國Caliper LifeSciences公司）；SR-2DS型水平振蕩器（日本TATEC公司）。

試劑：甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher Scientific公司）；石墨化碳（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）、C18（天津Agela Technologies公司）；二甲戊樂靈、仲丁靈（德國Dr. Ehrenstorfer公司）；甲酸（色譜純，美國Sigma公司）；無水MgSO4、NaCl（分析純，上海國藥集團(tuán)）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取二甲戊樂靈和仲丁靈標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.000 1 g），用甲醇分別溶解并配制成100.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；混合2種標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用前取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取 取適量鮮煙葉，去除主脈，剪碎后放入均漿機(jī)中充分絞碎。準(zhǔn)確稱取絞碎的樣品2.0 g，置于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈，在水平振蕩器上振蕩提取10 min，然后加入1.0 g無水MgSO4和0.5 g NaCl，立即渦旋1 min，防止無水MgSO4結(jié)塊，最后以5 000 r/min離心8 min。

1.2.2 凈化 吸取2.0 mL離心后的上清液，將上清液轉(zhuǎn)移至裝有30 mg C18、50 mg PSA和10 mg GCB吸附劑的5.0 mL離心管中，渦旋2 min，5 000 r/min離心3 min。吸取1.0 mL的上清液，用氮?dú)獯抵两?，殘留物用甲醇∶水?∶1，V/V）定容至1.0 mL后過0.22 μm濾膜，供HPLC-MS/MS分析。

1.3 測試條件

高效液相色譜條件Agilent Eclipse XDB-C18 column（150 mm×4.6 mm，5 μm），在線過濾器（Agilent 公司）；流動(dòng)相A為甲醇，B為0.1%（V/V）甲酸水溶液；等度洗脫甲醇∶0.1%甲酸水（90∶10，V/V）；流速0.4 mL/min；運(yùn)行時(shí)間13.0 min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；毛細(xì)管電壓3 500 V；霧化氣壓力1.4×10-5 Pa（20 psi）；干燥氣溫度250 ℃；干燥氣流量15 L/min；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣流量11 L/min；采集方式多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），其他參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 QuEChERS方法的條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑 二甲戊樂靈、仲丁靈具有疏水性，難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑乙腈、甲醇、乙酸乙酯等。使用甲醇、乙酸乙酯提取時(shí)，萃取雜質(zhì)較多，且吸附劑凈化效果不理想；乙腈對(duì)2種分析物的提取效率較高，吸附劑凈化效果理想，并且對(duì)鮮煙葉中的色素、蠟質(zhì)、脂肪等非極性成分提取的較少，通過鹽析更容易去除乙腈中的水分，所以本試驗(yàn)選用乙腈作為提取溶劑[15]。

2.1.2 吸附劑的種類和用量 鮮煙葉中的葉綠素含量高，用PSA和C18凈化時(shí)，葉綠素雜質(zhì)幾乎無法去除，有研究表明GCB是凈化葉綠素的理想吸附劑，但對(duì)二甲戊樂靈和仲丁靈這種含有芳香環(huán)及對(duì)稱性結(jié)構(gòu)的物質(zhì)有較強(qiáng)的吸附作用[16]。試驗(yàn)考察了GCB的用量對(duì)目標(biāo)物質(zhì)回收率的影響，隨著GCB用量從5 mg增大到30 mg，提取溶劑雖更加澄清無色，但2種抑芽劑的回收率顯著降低（圖2）。當(dāng)GCB用量為10 mg時(shí)，2種抑芽劑的回收率均在95%以上，滿足檢測要求。故選取10 mg GCB作為凈化葉綠素的吸附劑。

PSA去除脂肪酸、有機(jī)酸和多糖的效果較好，但去除色素、甾醇的能力一般；C18可以去除部分色素、甾醇和脂肪，但對(duì)非極性物質(zhì)有較強(qiáng)的吸附[15]；煙葉中含有葉綠素、脂肪和多糖等雜質(zhì)較多，為了在靈敏度、回收率和凈化效果之間找到最佳的平衡點(diǎn)，試驗(yàn)對(duì)C18-PSA-GCB復(fù)合吸附劑的用量比對(duì)凈化效果的影響進(jìn)行了考察，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，采用以質(zhì)量比3∶5∶1的C18-PSA-GCB 3種吸附劑，可獲得最佳的凈化效果，2種抑芽劑的平均回收率達(dá)到93%以上。因此，選擇C18-PSA-GCB（3∶5∶1，質(zhì)量比）為凈化吸附劑。

綜合以上因素，鮮煙葉用乙腈提取后，采用C18-PSA-GCB（3∶5∶1，質(zhì)量比）吸附劑凈化，不但回收率滿足要求，而且減少了鮮煙葉中復(fù)雜基質(zhì)對(duì)質(zhì)譜離子源的污染。

2.1.3 色譜條件的優(yōu)化 分別選用超純水、乙腈和甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)甲醇-水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰和分離度達(dá)到最佳效果，進(jìn)一步對(duì)比了甲醇-水溶液和甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液體系為流動(dòng)相，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，以甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)的峰面積增加40%以上，這是因?yàn)樵谡x子模式下加酸有助于目標(biāo)物質(zhì)離子化。同時(shí)對(duì)Waters ACQUITY UPLC C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）和Agilent Eclipse XDB-C18 column（150 mm×4.6 mm，5 μm）2種色譜柱的分離效果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)XDB-C18對(duì)2種化合物的分離較好。

2.1.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 目標(biāo)物質(zhì)屬于苯胺類化合物，易于質(zhì)子化，采用ESI+模式進(jìn)行掃描。分別配制100 μg/L的2種單標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用直接進(jìn)樣的方式注入離子源中，在m/z為100～1 000掃描范圍內(nèi)以正離子模式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物的[M+H]+峰較強(qiáng)；然后以此[M+H]+為母離子，進(jìn)行子離子掃描，找到各物質(zhì)的2個(gè)特征碎片離子（圖5）。

2.1.5 線性關(guān)系、檢出限和定量限 在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下進(jìn)行了方法學(xué)的考察。配制二甲戊樂靈和仲丁靈2種抑芽劑的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別為5、10、50、100、200、500 μg/kg，以提取離子色譜圖的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度（x）為橫坐標(biāo)建立線性回歸方程，在陰性樣品中添加目標(biāo)化合物，按照給定的方法測定，以3倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的添加水平作為檢出限（LOD），10倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的添加作為定量限（LOQ），計(jì)算結(jié)果見表2?？梢娫摲椒ㄇ袑?shí)可行。

2.1.6 回收率和精密度 用空白基質(zhì)加標(biāo)法進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)，選取陰性鮮煙葉為空白樣品，分別添加相當(dāng)于20、50和100 μg/kg水平的二甲戊樂靈和仲丁靈混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)含量水平做6個(gè)平行樣品，連續(xù)測定3 d，結(jié)果見表3?？梢娫摲椒?zhǔn)確度和精確度均較好。

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了儀器參數(shù)和樣品前處理?xiàng)l件，采用改進(jìn)的QuEChERS-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了鮮煙葉中二甲戊樂靈、仲丁靈2種抑芽劑的分析方法。該方法簡單、快速、靈敏度高、準(zhǔn)確度好、溶劑消耗量少，能有效去除葉綠素等雜質(zhì)干擾問題，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)化合物準(zhǔn)確的定性和定量分析需求，可廣泛用于鮮煙葉中二甲戊樂靈、仲丁靈2種抑芽劑的測定。該研究為抑芽劑的合理施用、大田的實(shí)時(shí)監(jiān)控、鮮煙葉原料的殘留控制提供了技術(shù)方法，對(duì)采取措施降低抑芽劑的危害具有現(xiàn)實(shí)意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] HAN F， JI X， LIU P， et al. Effects of different suckercides on economic characteristics and intrinsic quality of tobacco[J]. Journal of Food， Agriculture Environment， 2012， 10（1）： 691-695.

[2] 陳德鑫，王鳳龍，楊清林，等.煙草抑芽劑的研究進(jìn)展與應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，30（5）：792-796.

[3] PATEL S， BAJPAYEE M， PANDEY A K， et al. In vitro induction of cytotoxicity and DNA strand breaks in CHO cells exposed to cypermethrin， pendimethalin and dichlorvos[J].Toxicology in vitro，2007，21（8）：1409-1418.

[4] HOU L， LEE W J， RUSIECKI J， et al. Pendimethalin exposure and cancer risk among pesticide applicators：A report from the US-based agricultural health study[J]. Annals of Epidemiology，2004，14：608-643.

[5] ANDREOTTI G，F(xiàn)REEMAN L E B，HOU L，et al. Agricultural pesticide use and pancreatic cancer risk in the agricultural health study cohort[J]. International Journal of Cancer，2009， 124（10）：2495-2500.

[6] GB/T 2763—2014，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量[S].

[7] 姜林燦.對(duì)煙葉原料保障上水平的探討[J].中國煙草科學(xué)，2011， 32（6）：90-93.

[8] 潘義宏，周麗娟，王 娟，等.煙葉安全性影響因素及其關(guān)鍵農(nóng)業(yè)控制技術(shù)研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（5）：5-11.

[9] TAHBOUB Y R， ZAATER M F， AL-TALLA Z A. Determination of the limits of identification and quantitation of selected organochlorine and organophosphorous pesticide residues in surface water by full-scan gas chromatography/mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A，2005，1098（1）：150-155.

[10] WONG J W，ZHANG K， TECH K， et al. Multiresidue pesticide analysis of ginseng powders using acetonitrile or acetone-based extraction， solid-phase extraction cleanup， and gas chromatography mass spectrometry/selective ion monitoring （GC-MS/SIM） or tandem mass spectrometry（GC-MS/MS）[J].Journal of agricultural and food chemistry，2010，58（10）： 5884-5896.

[11] 廖雅樺，蔣臘梅，穆小麗，等.凝膠滲透色譜-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定煙草中3種抑芽劑殘留[J].分析試驗(yàn)室，2010（1）：72-75.

[12] LIU H，DING C，ZHANG S，et al. Simultaneous residue measurement of pendimethalin，isopropalin，and butralin in tobacco using high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection and electrospray ionization/mass spectrometric identification[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004， 52（23）：6912-6915.

[13] 朱文靜，高川川，樓小華，等.LC-MS/MS快速測定煙草中57種農(nóng)藥殘留[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2013（2）：12-16.

[14] CHEN X，BIAN Z，HOU H，et al. Development and validation of a method for the determination of 159 pesticide residues in tobacco by gas chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61（24）：5746-5757.

[15] 張耀海，焦必寧，周志欽.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合QuEChERS方法快速檢測軟包裝飲料中8種光引發(fā)劑[J].分析化學(xué)，2012（10）：1536-1542.

[16] 宋淑玲，李重九，馬曉東，等.蔬菜中殘留農(nóng)藥的石墨化碳黑凈化和氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法[J].分析化學(xué)，2008，36（11）：1526-1530.