超聲波—微波協(xié)同提取何首烏多糖的工藝研究

摘要：研究了超聲波-微波協(xié)同提取何首烏[Fallopia multiflora（Thunb.） Harald.]多糖的最佳工藝條件，以何首烏多糖提取率為綜合指標，考察料液比、提取次數(shù)、超聲時間、微波時間4個因素對提取效果的影響，在此基礎上，利用中心組合試驗設計對提取工藝進行優(yōu)化，最佳工藝條件為料液比1∶21（g∶mL），超聲時間15 min，微波時間3 min，提取1次，在此條件下多糖實際提取率可達19.74%。

關鍵詞：何首烏[Fallopia multiflora（Thunb.） Harald.]；多糖；微波；超聲波；提取

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2867-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.039

何首烏[Fallopia multiflora （Thunb.） Harald.]既是中國名貴中藥材，又是食療保健佳品[1]。按其炮制方法不同分為生首烏和制首烏。生首烏味苦、澀，性平，具有解毒、消癰、潤腸通便的功效；制首烏苦、甘、澀，性溫，具有補肝腎、益精血、烏須發(fā)等功效[2]。多糖廣泛存在于植物、微生物和海藻中。近年來，對制何首烏多糖的生物活性的評價研究表明，制何首烏多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、降血脂及抗老年癡呆癥等功效[3-5]，開展對何首烏多糖提取工藝的研究對中國何首烏資源的綜合利用、產(chǎn)品的商業(yè)化生產(chǎn)等具有重要意義。

超聲波-微波協(xié)同提取法充分利用超聲波振動的空化作用以及微波的高能作用，使何首烏樣品各點受到的作用一致，降低目標物多糖與樣品基體的結(jié)合力，加速多糖從固相進入溶劑的過程[6-8]。本試驗根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，采用響應面分析法對制何首烏多糖的超聲波-微波協(xié)同提取工藝進行優(yōu)化，為制何首烏資源的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

何首烏，購于聊城市藥店；葡萄糖（AR），濃硫酸（AR），苯酚（AR），無水乙醇（AR）。

QE-200型高速中藥粉碎機，武義縣屹立工具有限公司；賽多利斯萬分之一電子天平，北京聯(lián)合科儀科技有限公司；KQ3200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；常壓微波合成/萃取儀，新儀微波化學科技有限公司；SB-2000型水浴鍋，上海愛朗儀器有限公司；UV-1800型紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 何首烏多糖提取工藝流程 何首烏→粉碎過篩（20目）→80%乙醇溶液預處理（料液比1∶6，g∶mL，70 ℃恒溫水浴，攪拌1 h）→抽濾→通風干燥→何首烏粉末→加入一定量的去離子水→超聲波處理→微波處理→抽濾→濾液定容→測定吸光度。

1.2.2 標準曲線的繪制 精密稱取105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖25.1 mg，置于250 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.100 4 mg/mL的葡萄糖標準溶液。準確吸取上述葡萄糖標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL分別置于10 mL容量瓶中，加入去離子水補至1.0 mL，各加5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，然后迅速加入濃硫酸5.0 mL，充分搖勻后，室溫下放置20 min。以去離子水為空白，在490 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，以葡萄糖標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到葡萄糖濃度（C，mg/mL）與吸光度（A）的線性回歸方程C=0.098 5A-0.012 7（R2=0.999 1），其中A與濃度C之間在0～0.08 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

1.2.3 何首烏多糖提取率的測定 何首烏多糖提取率采用以下公式計算：

何首烏多糖提取率=CV/M×100%

式中，C為提取液中多糖濃度；V為提取液的最終體積；M為何首烏樣品的質(zhì)量。

1.2.4 單因素試驗 分別考察料液比、提取次數(shù)、超聲時間和微波時間對何首烏多糖提取率的影響。①稱取3.0 g何首烏粉末，固定超聲時間15 min，微波時間3 min，按不同料液比1∶10、1∶15、1∶18、1∶20、1∶25（g∶mL，下同）加入去離子水，提取1次，測定提取液中多糖含量；②稱取3.0 g何首烏粉末，固定料液比1∶10，微波時間3 min，超聲時間分別為5、10、15、20、25 min，提取1次，測定提取液中多糖含量；③稱取3.0 g何首烏粉末，固定料液比1∶10，超聲時間15 min，微波時間分別為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 min，提取1次，測定提取液中多糖含量；④稱取3.0 g何首烏粉末，固定料液比1∶10，超聲時間15 min，微波時間3 min，分別重復提取1、2、3、4、5次，測定提取液中多糖含量。

1.2.5 響應面優(yōu)化試驗設計 在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，選擇料液比、超聲時間、微波時間、提取次數(shù)4個因素，采用四因素三水平響應面分析法優(yōu)化提取工藝[9-11]，試驗因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對何首烏多糖提取率的影響 由圖2可知，隨著料液比的增大，何首烏多糖提取率也逐漸升高，在料液比達到1∶20時，多糖提取率最高。一般來說，增大溶劑的量有助于目標成分的提取，固液接觸面積增加，提取率提高；但是料液比過大會造成溶劑和能源的浪費，且后續(xù)濃縮和純化壓力增大。從節(jié)能和提高工作效率的角度考慮，溶劑用量不宜過大。因此，料液比取1∶20為宜。

2.1.2 超聲時間對何首烏多糖提取率的影響 由圖3可知，超聲時間對何首烏多糖提取率的影響較為明顯，在5～15 min范圍內(nèi)，隨著時間的延長提取率明顯升高，當超聲時間達到15 min時，提取率最大，超過15 min后提取率開始急劇下降。這是因為超聲波產(chǎn)生的強烈空化效應以及高速攪拌作用可以加快植物的溶脹和破碎，使得有效成分溶解率增加，提取率也相應增大。但超聲時間過長，會使體系溫度增加，一部分多糖被破壞。因此，選擇超聲時間15 min為宜。

2.1.3 微波時間對何首烏多糖提取率的影響 由圖4可知，隨著微波時間的增加，何首烏多糖提取率不斷升高，當微波時間為3.0 min時，多糖提取率最高；而微波時間達到3.0 min后，提取率隨微波時間的增加而降低，這可能是由于長時間高溫破壞了多糖的結(jié)構，使得提取率降低。在實際提取過程中要考慮時間效率和成本因素，所以微波時間取3.0 min為宜。

2.1.4 提取次數(shù)對何首烏多糖提取率的影響 由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，何首烏多糖提取率也隨之增加。提取2次的多糖提取率明顯增大，何首烏多糖已基本提取完全；當提取次數(shù)達到3次以后，提取率變化不明顯，因此，選擇提取2次為宜。

2.2 何首烏多糖提取工藝優(yōu)化

2.2.1 響應面試驗結(jié)果 為進一步優(yōu)化何首烏多糖的提取條件，根據(jù)響應面分析因子和水平，以料液比（A）、超聲時間（B）、微波時間（C）、提取次數(shù)（D）為自變量，以制何首烏多糖提取率為響應值，采用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面分析試驗，試驗方案與結(jié)果見表2。

2.2.2 數(shù)學模型的建立及顯著性檢驗 采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件進行多元回歸分析，得到何首烏多糖提取率與提取工藝各因素變量的二次回歸方程：Y=-106.237 00+2.532 73A+3.172 80B+47.482 67C+0.804 00D-0.015 200AB+0.014 000AC-0.020 500AD-0.046 000BC+0.041 500BD+1.405 00CD-0.053 327A2-0.092 127B2-8.432 67C2-0.765 67D2。

回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性由P值來判斷，P值越小，則相應變量的顯著程度越高，回歸分析結(jié)果見表3，回歸模型可信度分析結(jié)果見表4。

由表3可知，模型中的一次項B、二次項CD的影響達到顯著水平（P<0.05），一次項A、D，二次項A2、B2、C2、D2的影響均達到極顯著水平（P<0.01），進一步說明各因素對響應面的影響不僅僅是簡單的線性關系。各因素對何首烏多糖提取率的影響大小順序依次為A、D、B、C，即料液比、微波時間、提取次數(shù)、超聲時間。

由表4可知，該回歸模型相關系數(shù)R2=0.929 1，說明響應值何首烏多糖提取率有92.91%來源于所選變量，即料液比、超聲時間、微波時間、提取次數(shù)。由方程顯著性檢驗可知，該方程的模型擬合程度良好；失擬性分析表明，該回歸方程無失擬性因素存在，且校正擬合度與預測擬合度在合理的水平內(nèi)具有一致性，因此回歸模型與實測值能較好地擬合；該試驗的變異系數(shù)為3.79%，說明該模型的可靠性良好；信噪比為11.621，遠大于4，說明該模型的精密度良好。綜上所述，該回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

結(jié)合回歸數(shù)學模型分析，對上述二次回歸方程求解，得到最佳提取條件為料液比1∶21.27，超聲時間15.48 min，微波時間3.08 min，提取次數(shù)1.45次，在此條件下何首烏多糖提取率為19.82%?？紤]到實際工藝條件的可操作性，將參數(shù)調(diào)整為料液比1∶21，超聲時間15 min，微波時間3 min，提取次數(shù)1次。

2.2.3 響應面交互作用分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件處理數(shù)據(jù)，所得等高線與三維響應曲面見圖6～圖11。由等高線圖的形狀和疏密可以直觀地看到各因素交互作用對響應值的影響。

2.3 最佳工藝條件下的驗證試驗

為了驗證模型的有效性，進行重復驗證試驗，所得何首烏多糖平均提取率為19.74%，與理論預測值19.82%相差不大，表明預測值與實際值之間具有較好的擬合性，回歸數(shù)學模型可以很好地預測不同條件下的提取率，具有一定的實用價值。

3 小結(jié)

本試驗以何首烏為原料，采用超聲波-微波協(xié)同提取技術對多糖提取工藝進行分析，采用中心組合試驗和響應面分析法進行工藝優(yōu)化，并建立了超聲波-微波協(xié)同提取何首烏多糖提取率與料液比、超聲時間、微波時間和提取次數(shù)關系的數(shù)學模型，由此模型獲得了適宜的工藝參數(shù)：料液比1∶21，超聲時間為15 min，微波時間為3 min，提取次數(shù)1次。在此條件下多糖提取率可達19.74%，與理論值19.82%相差不大，說明該回歸方程模型具有較好的實際應用價值。

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