基于SRAP和IRAP標(biāo)記的野生君遷子居群取樣策略分析

摘要：君遷子（Diospyros lotus L.）是中國(guó)栽培柿（D. kaki Thunb.）的主要砧木，其適應(yīng)性和繁殖能力強(qiáng)，表型變異豐富，存在多個(gè)變種和近緣種，在國(guó)內(nèi)廣泛分布。目前，有關(guān)君遷子居群的取樣策略尚不完全清楚。試驗(yàn)以1個(gè)野生君遷子自然居群（40個(gè)單株）和8個(gè)外類群種質(zhì)為試材，利用SRAP和IRAP標(biāo)記技術(shù)分析其居群取樣策略。結(jié)果表明，20對(duì)SRAP引物擴(kuò)增出188條譜帶，多態(tài)性比例為94.68%；9條IRAP引物共擴(kuò)增出102條譜帶，多態(tài)性比率為95.10%。UPGMA聚類分析表明，君遷子居群分別與柿和浙江柿（D. glaucifolia L.）獨(dú)立成組。供試君遷子居群遺傳多樣性信息參數(shù)隨取樣梯度的增加（5～35個(gè)單株）而增加。Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）在取樣梯度為20個(gè)單株時(shí)達(dá)到總體的95%以上，Shannon信息指數(shù)（I）和多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPL）在取樣梯度為25個(gè)單株時(shí)分別達(dá)到總體的95%以上，隨著取樣梯度的進(jìn)一步增加，Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)百分率數(shù)值趨穩(wěn)。綜上所述，基于遺傳多樣性信息參數(shù)（H、I、PPL）的居群取樣單株數(shù)量建議為20～25個(gè)單株。

關(guān)鍵詞：君遷子（Diospyros lotus L.）；分子標(biāo)記；居群取樣策略；砧木

中圖分類號(hào)：S665.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）11-2838-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.031

君遷子（Diospyros lotus L.；2n=2x=30）是柿科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros L.）植物中除栽培柿（D. kaki Thunb.）外的重要果樹，別名黑棗、軟棗、高加索柿等，是柿重要的砧木資源[1，2]。君遷子適應(yīng)性和繁殖能力強(qiáng)，分布范圍廣，表型變異豐富[3]，存在多個(gè)變種和近緣種[4]，與富有（D. kaki cv. Fuyuu）系甜柿品種嫁接的親和性表現(xiàn)復(fù)雜[5，6]。有效保護(hù)和利用柿習(xí)用砧木君遷子及其所蘊(yùn)藏的豐富遺傳資源對(duì)柿產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。野生種質(zhì)資源的調(diào)查和采集受到人力和物力的限制，通常不能對(duì)某個(gè)居群的所有個(gè)體或某個(gè)物種的所有居群都進(jìn)行采集或保護(hù)，只能采集或保護(hù)其中的一部分，然而人們又希望獲得盡可能多的遺傳變異以代表居群或物種的整體遺傳多樣性水平。因此，開展對(duì)野生種質(zhì)資源遺傳多樣性調(diào)查、保護(hù)和利用的研究，首先考慮的問題便是最佳的居群取樣策略。遺傳多樣性的取樣策略是指對(duì)一定地理分布范圍內(nèi)的生物個(gè)體取樣時(shí)，使樣本具有代表性和包含盡可能多的遺傳變異信息的最佳取樣方法[7]；它在很大程度上受到生物自身特性、生長(zhǎng)環(huán)境和取樣目的的影響。試驗(yàn)以一個(gè)野生君遷子居群的40份單株和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柿圃活體保存的7份柿品種及1份浙江柿（D. glaucifolia L.）種質(zhì)為試材，基于SRAP（Sequence-related Amplified Polymorphism）和IRAP（Inter-retrotransposon Amplified Polymorphism）標(biāo)記技術(shù)分析君遷子居群的最佳取樣策略，以期為國(guó)內(nèi)野生君遷子種質(zhì)野外科學(xué)采集、生物多樣性保護(hù)的研究提供工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料共48份，其中40份單株采自位于大別山東部的安徽省六安市金寨縣天堂寨鎮(zhèn)馬石村（北緯31.1885°-31.1889°；東經(jīng)115.7691°-115.7695°；海拔為600～710 m）的一個(gè)君遷子自然居群；采用簡(jiǎn)單隨機(jī)取樣方式進(jìn)行居群內(nèi)單株取樣。富有、松本早生（Matsumoto-wase fuyuu）、上西早生（Uenishi-wase）、次郎（Jirou）、前川次郎（Maekawa-jirou）、陽豐（Youhou）和羅田甜柿（Luotian Tianshi）7份栽培柿（2n=6x=90）品種及1份浙江柿（2n=2x=30）種質(zhì)均采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柿圃（北緯30.4772°，東經(jīng)14.3603°，海拔為30 m）。

1.2 DNA提取

利用CTAB法[8]提取幼嫩葉片基因組DNA；采用Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)和瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.3 SRAP標(biāo)記擴(kuò)增

SRAP擴(kuò)增參考Guo等[9]研究結(jié)果，采用20 μL PCR反應(yīng)體系，含1×Buffer，2.5 mmol/L Mg2+，正向和反向引物各300 nmol/L，200 μmol/L dNTPs，50 ng模板DNA，1 U Taq酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃、1 min，35 ℃、1 min，72 ℃、1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃、1 min， 50 ℃、1 min，72 ℃、2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。共篩選到20對(duì)多態(tài)性較好的引物組合，序列信息見表1；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 IRAP標(biāo)記擴(kuò)增

IRAP擴(kuò)增參考Du等[10]的方法，采用20 μL PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系含1×Buffer，2.0 mmol/L Mg2+，正向和反向引物各400 nmol/L，250 μmol/L dNTPs，50 ng模板DNA，1 U Taq酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃、1 min，50 ℃、1 min， 72 ℃、1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸6 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所用9條引物及序列信息見文獻(xiàn)[10]，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)得到的圖譜清晰、重復(fù)性強(qiáng)的電泳條帶用0/1矩陣統(tǒng)計(jì)；采用NTSYS-pc version 2.10[11]統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算材料間的Dice相似指數(shù)，并利用UPGMA法（Unweighted Pair Group Method Arithmetic Averages）進(jìn)行聚類分析；運(yùn)用Microsoft Office Excel 2010軟件處理試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)并作圖，從君遷子居群總體（40個(gè)單株）中模擬抽取5、10、15、20、25、30、35等7個(gè)不同取樣梯度的樣本，各取樣梯度重復(fù)抽取10次；采用POPGENE1.32[12]分析軟件計(jì)算不同抽樣梯度下的觀測(cè)等位基因數(shù)（Number of allele， Na）、有效等位基因數(shù)（Effective number of allele，Ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（Nei’s gene diversity index，H）、Shannon信息指數(shù)（Shannon’s information index，I）和多態(tài)性位點(diǎn)百分率（Polymorphic loci，PPL）等遺傳多樣性信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP和IRAP標(biāo)記的多態(tài)性分析

分別從已發(fā)表的SRAP和IRAP引物序列信息中篩選出已得到較好擴(kuò)增結(jié)果的20對(duì)和9條引物，其擴(kuò)增譜帶大小均在200～2 000 bp。將SRAP和IRAP標(biāo)記的多態(tài)性信息含量進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。從表2可見，SRAP和IRAP分別擴(kuò)增出188條和102條譜帶，其中多態(tài)性譜帶分別為178條和97條，多態(tài)性比例分別為94.68%和95.10%。IRAP的平均擴(kuò)增譜帶數(shù)（11.33）和平均多態(tài)性譜帶數(shù)（10.78）略高于SRAP（分別是9.40、8.90）；但是，有效多重系數(shù)、多態(tài)性信息含量和標(biāo)記指數(shù)則是SRAP（分別是3.71、0.31、1.15）高于IRAP（分別是2.02、0.27、0.55）；同時(shí)，SRAP和IRAP結(jié)合的標(biāo)記指數(shù)（1.72）均高于SRAP和IRAP各自獨(dú)立的標(biāo)記指數(shù)。

2.2 SRAP和IRAP標(biāo)記的聚類分析

基于SRAP和IRAP分析數(shù)據(jù)，計(jì)算出48份柿屬種質(zhì)的Dice相似系數(shù)，結(jié)合2種分子標(biāo)記獲得的UPGMA聚類結(jié)果見圖1。從圖1可見，40份野生君遷子居群?jiǎn)沃觊g遺傳變異豐富并單獨(dú)聚類成組，與7份柿品種和1份浙江柿種質(zhì)獨(dú)立分開，說明SRAP和IRAP數(shù)據(jù)結(jié)合分析具有較高的可靠性，因此可用于進(jìn)一步的君遷子居群取樣策略分析。

2.3 SRAP和IRAP標(biāo)記的居群取樣策略分析

基于SRAP和IRAP標(biāo)記、利用POPGENE1.32軟件分析野生君遷子居群的遺傳變異情況，結(jié)果見表3。從表3可見，基于SRAP和IRAP標(biāo)記均能檢測(cè)到較高的居群遺傳多樣性，但SRAP的多態(tài)性位點(diǎn)百分率（88.51%）、觀測(cè)等位基因數(shù)（1.89±0.33）、有效等位基因數(shù)（1.57±0.36）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（0.32±0.18）和Shannon信息指數(shù)（0.47±0.24）均高于IRAP（分別是85.26%、1.85±0.36、1.49±0.33、0.29±0.17、0.44±0.23），而采用SRAP和IRAP數(shù)據(jù)結(jié)合分析的居群遺傳多樣性介于SRAP和IRAP上述參數(shù)之間（分別是87.36%、1.87±0.33、1.54±0.35、0.31±0.18、0.46±0.24）。

對(duì)不同單株取樣量前提下大別山野生君遷子居群的SRAP和IRAP遺傳多樣性信息參數(shù)分7個(gè)取樣梯度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表4。從表4可見，當(dāng)取樣量為5株時(shí)，君遷子居群的遺傳多樣性信息參數(shù)最低；當(dāng)取樣量為35株時(shí)，君遷子居群的遺傳多樣性信息參數(shù)最高；隨著單株取樣量的增加，君遷子居群的各項(xiàng)遺傳多樣性信息參數(shù)均呈逐漸增大的趨勢(shì)。

采用Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon信息指數(shù)（I）和多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPL）3項(xiàng)遺傳多樣性信息指標(biāo)分析君遷子居群的取樣策略，結(jié)果見圖2。從圖2可見，H、I和PPL均隨著取樣梯度的增加（從5株到35株）而增加；當(dāng)取樣量為20株時(shí)，H達(dá)到總體（40株）的96.23%（超過95%），I和PPL達(dá)到總體的92.05%和94.08%；當(dāng)取樣量為25株時(shí)，I和PPL分別達(dá)到總體的96.75%和95.32%（均超過95%）；當(dāng)遺傳多樣性信息參數(shù)超過總體95%后，H、I和PPL這3項(xiàng)遺傳多樣性信息參數(shù)的數(shù)值趨穩(wěn)。3項(xiàng)遺傳多樣性信息參數(shù)均隨著取樣量的增加而增加，但不同遺傳多樣性信息參數(shù)隨樣本量增加而增幅不同，這說明隨機(jī)選取20～25個(gè)單株就能代表和反映一個(gè)居群的整體遺傳特性（達(dá)到樣本總體遺傳多樣性信息參數(shù)的95%以上）。

3 討論

君遷子是中國(guó)柿栽培主要的砧木，全國(guó)有17個(gè)?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）具有分布，絕大部分種質(zhì)資源處于野生或半野生狀態(tài)，主要生于海拔500～2 300 m左右的山地、山坡、山谷灌叢中，在北方地區(qū)僅有少量栽培[1，2，4]。在柿的分類上，完全甜柿（Pollination Constant Non-astringent，PCNA）在樹上就能自然脫澀、去皮即可脆食，其無需人工脫澀和良好口感等商品價(jià)值相對(duì)于非完全甜柿（Non-PCNA）更具備市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[13]，已在云南、福建、山西、湖北等省初具產(chǎn)業(yè)規(guī)?！，F(xiàn)在生產(chǎn)上綜合性狀表現(xiàn)良好的完全甜柿品種如富有、太秋（Taishu）等與習(xí)用砧木君遷子嫁接表現(xiàn)出早期不親和或后期不親和，尤其是結(jié)果太多時(shí)樹勢(shì)易速衰[5，14]，且新育成的早秋（Soshu）、甘秋（Kanshu）等品種或多或少具有富有系遺傳背景。而國(guó)內(nèi)君遷子分布范圍廣、變異類型豐富，推測(cè)與富有系嫁接廣親和的君遷子砧必然存在；基于形態(tài)、生理、解剖和分子水平的研究，國(guó)家柿種質(zhì)資源圃（陜西楊凌）尚存20年生的君遷子與富有嫁接親和性及生長(zhǎng)勢(shì)同本砧差異不顯著（西北農(nóng)林科技大學(xué)，數(shù)據(jù)未發(fā)表）的事例。因此，開展君遷子收集、保存和評(píng)價(jià)工作，篩選出與主栽甜柿品種嫁接親和度高、適應(yīng)性強(qiáng)且早實(shí)豐產(chǎn)的配套優(yōu)良砧木將對(duì)國(guó)內(nèi)甜柿產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

金燕等[15]對(duì)野生大豆居群的研究表明，隨機(jī)取樣量應(yīng)保持在35～45株時(shí)方能代表居群整體并反映居群的整體遺傳特性。劉文獻(xiàn)等[16]對(duì)華山新麥草2個(gè)居群的6、10、14、18、22、26、30等7個(gè)單株取樣梯度進(jìn)行研究表明，當(dāng)樣本量為18時(shí)，包含了居群95%以上的變異。課題組利用SRAP和IRAP分子標(biāo)記對(duì)生長(zhǎng)于大別山東部的一個(gè)野生君遷子居群分單株進(jìn)行取樣策略研究，結(jié)果表明在各取樣梯度上的觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon信息指數(shù)（I）和多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPL）均存在隨樣本量的增加而隨之變大的趨勢(shì)。為了更準(zhǔn)確地說明居群取樣量與遺傳多樣性信息參數(shù)之間的關(guān)系，采用H、I和PPL這3種遺傳多樣性信息參數(shù)作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)君遷子居群取樣量為20株時(shí)，基于H的遺傳多樣性信息參數(shù)就包含了居群總體95%以上的遺傳變異；而當(dāng)取樣量為25株時(shí)，基于I和PPL的遺傳多樣性信息參數(shù)方能達(dá)到居群總體95%以上的遺傳變異；隨著取樣量的進(jìn)一步增加各項(xiàng)遺傳多樣性信息參數(shù)（H、I和PPL）的變化基本趨于一致。說明對(duì)君遷子居群進(jìn)行野外考察收集、保護(hù)及多樣性研究過程中，按照野生取樣原則，選取20～25個(gè)單株就能代表和反映一個(gè)君遷子居群的整體遺傳特性。

綜上所述，供試君遷子遺傳多樣性豐富，基于遺傳多樣性信息參數(shù)（H、I、PPL）的居群?jiǎn)沃耆訑?shù)建議設(shè)為20～25株。基于以上君遷子取樣策略的研究，結(jié)合柿屬植物已經(jīng)開發(fā)的分子標(biāo)記[9，10]和居群遺傳分析水平，有望在挖掘君遷子新類型以及合理利用與保護(hù)野生君遷子種質(zhì)方面獲得更多的理論依據(jù)。

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