桑樹SSR引物的開發(fā)及其多態(tài)性分析

摘要：利用FIASCO磁珠富集法開發(fā)出桑樹（Morus alba L.）基因組DNA的SSR位點(diǎn)引物46對(duì)，選出38對(duì)引物用于8份材料的多態(tài)性驗(yàn)證。結(jié)果表明，38對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出清晰譜帶210條，不同引物的擴(kuò)增條帶數(shù)1～12條，平均每對(duì)引物的擴(kuò)增帶數(shù)為5.526 3條；每對(duì)引物組合可檢測(cè)到SSR多樣性位點(diǎn)數(shù)3～9個(gè)，共檢測(cè)到106個(gè)多樣性位點(diǎn)；所有位點(diǎn)的平均PIC值為0.645 8；8份供試材料在SSR水平上表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性差異，其中野生品種葫蘆桑和巖桑聚為Ⅰ組，遺傳距離為0.746 0，栽培品種垂桑、荷葉白、劍持、新一之瀨、倫教40、雞桑聚為Ⅱ組，劍持與荷葉白遺傳距離最近（0.169 5），親緣關(guān)系最近，葫蘆桑和巖桑與荷葉白的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞：桑樹（Morus alba L.）；SSR引物；多態(tài)性分析

中圖分類號(hào)：S888 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）11-2824-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.028

桑樹（Morus alba L.）屬?？疲∕oraceae）桑屬（Morus L.），是蠶的優(yōu)良飼料，營(yíng)養(yǎng)豐富。桑屬有許多種及變種，目前，中國(guó)有桑樹種質(zhì)資源3 000余份，包括15個(gè)桑樹種和4個(gè)變種，是世界上桑樹種最多的國(guó)家[1]。桑樹的分類基本上是依據(jù)花柱、柱頭內(nèi)側(cè)的狀況，以及枝、葉、花序和聚花果的大小、性狀等的形態(tài)特征進(jìn)行，但有的性狀特征極易受到環(huán)境等非生物因素的影響，所以有時(shí)并不能真實(shí)反映桑樹種的親緣關(guān)系。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)標(biāo)記技術(shù)為物種鑒定、系統(tǒng)演化以及遺傳多樣性等的研究開辟了新的途徑。

DNA指紋技術(shù)是一種可檢測(cè)出大量DNA位點(diǎn)差異的分子生物學(xué)技術(shù)，在作物品種鑒定、品種注冊(cè)、純度檢測(cè)等方面具有重要作用[2]。SSR分子標(biāo)記近年來已被廣泛應(yīng)用于水稻、小麥、大麥、大豆、棉花、玉米等作物資源分析、基因定位、雜種親本鑒定和純度分析[3-6]。彭波等[7]利用24對(duì)SSR引物（其中來自桑樹基因組的16對(duì)、無花果基因組的8對(duì)）對(duì)172個(gè)桑樹品種（系）進(jìn)行研究，結(jié)果表明利用SSR對(duì)桑樹進(jìn)行系統(tǒng)研究是可行的。本研究利用FIASCO磁珠富集法開發(fā)桑樹荷葉白品種的基因組DNA的SSR位點(diǎn)引物，并對(duì)這些引物是否能夠擴(kuò)增及其多態(tài)性進(jìn)行驗(yàn)證，以期為桑樹遺傳圖譜的構(gòu)建、比較基因組結(jié)構(gòu)和功能分析等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的8份桑樹種及變種材料均采自安康學(xué)院蠶?；厣浞N質(zhì)資源圃。具體品種（系）的來源情況見表1。

1.2 方法

1.2.1 桑樹基因組DNA提取 采摘各供試桑種質(zhì)材料的新鮮嫩芽（約0.1 g），用改良CTAB法提取桑樹基因組的總DNA。

1.2.2 桑樹SSR引物開發(fā)

1）限制性酶切及連接。以桑樹中的典型代表品種荷葉白作為引物開發(fā)試驗(yàn)材料，基因組用MseⅠ進(jìn)行單酶切。酶切體系40 μL：模板DNA 1 μg，10×T4 DNA ligase Buffer 4 μL，MseⅠ（10 U/μL）1 μL、T4 ligase DNA 酶1 μL，其余用ddH2O補(bǔ)齊。25 ℃作用2 h。

2）預(yù)擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增做4管，每管的擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序如下：PCR擴(kuò)增體系為20 μL，含連接接頭的酶切DNA 1 μL、2×PCR mix 10 μL、M00 20 pmol、Taq酶1 U，其余用ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

3）PCR產(chǎn)物純化。將獲得的200 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物純化。

4）磁珠富集含有SSR位點(diǎn)的片段。用FIASCO磁珠富集法于磁場(chǎng)中收集上清液，將收集到的DNA濃縮后用E00、M00再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

5）陽(yáng)性克隆的篩選。用pMD18-T載體的通用引物M13-47（CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC）或RV-M（GAGCGGATAACAATTTCACACAGG）與重復(fù)序列（AG）9/（GT）9組成的雙引物對(duì)AG/GT富集文庫(kù)菌落進(jìn)行篩選檢測(cè)。反應(yīng)體系如下：DNA模板，單菌落（體積為0）；2×PCR Mix 7.5 μL，M13-47/RV-M（20 μmol/μL） 0.15 μL，20 μmol/μL （AG）9/（GT）9 0.15 μL，Taq酶 0.2 μL，ddH2O 7 μL，總體積15 μL。

反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s， 33次循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)擴(kuò)增出清晰電泳條帶的菌落進(jìn)行質(zhì)粒測(cè)序。

6）引物設(shè)計(jì)。利用Chromas軟件查看序列峰圖，手工校正序列，并篩選出含有SSR位點(diǎn)的序列。利用DNAman軟件去除載體和接頭序列，CodonCode Aligner軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，去除重復(fù)序列后用Primer5軟件進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)，并送華大基因生物公司合成。

1.2.3 SSR引物擴(kuò)增分析 PCR的反應(yīng)體系20 μL，包括模板DNA 25 ng，10×Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，10 μmol/L F-primer 0.25 μL，10 μmol/L R-primer 0.25 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，其余用ddH2O補(bǔ)齊。

PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，變性 30 s，72 ℃ 60 s，72 ℃ 5 min， 32個(gè)循環(huán)。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)引物擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)，選擇擴(kuò)增產(chǎn)物為目的條帶且擴(kuò)增穩(wěn)定的進(jìn)行5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

選取PAGE電泳平板上清晰可辨的電泳條帶，以“1”和“0”分別記錄條帶的“有”和“無”。在相同片段位置上有帶記為“1”，無帶記為“0”。一個(gè)引物為一個(gè)等位基因位點(diǎn)，將每個(gè)樣品在各個(gè)等位基因位點(diǎn)的片段大小，即其表現(xiàn)型按照Convert 1.31軟件要求的格式錄入到Excel中，然后用Convert 1.31軟件轉(zhuǎn)化成POPGENE軟件所要求格式。用POPGENE32軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)

為了獲得富集文庫(kù)，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增試驗(yàn)，結(jié)果如圖1。結(jié)果表明，預(yù)擴(kuò)增試驗(yàn)獲得500 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物，引物符合試驗(yàn)要求。

2.2 克隆PCR檢測(cè)

利用RV-M和（GT）9組成的雙引物從構(gòu)建的2個(gè)富集文庫(kù)進(jìn)行克隆PCR檢測(cè)（圖2）。結(jié)果顯示，陽(yáng)性克隆擴(kuò)增條帶清晰且單一，陽(yáng)性菌占到檢測(cè)菌落數(shù)的37.5%。

2.3 SSR位點(diǎn)PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)及引物評(píng)價(jià)

在發(fā)現(xiàn)SSR位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)其兩端的保守序列，設(shè)計(jì)了46對(duì)SSR位點(diǎn)PCR擴(kuò)增引物（表2）。為了檢測(cè)所設(shè)計(jì)的46對(duì)引物組合在桑屬內(nèi)PCR擴(kuò)增的有效性，以表1所列的雞桑、垂桑、荷葉白、新一之瀨、劍持、倫教40、葫蘆桑、巖桑8個(gè)桑樹品種為材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行等位位點(diǎn)多樣性檢測(cè)，結(jié)果見表3。從表3可以看出，引物SP4、SP12、SP14、SP16、SP17、SP45、SP46在8個(gè)樣品中均沒有擴(kuò)增到目的片段，引物SP2、SP8和SP28在個(gè)別樣本中沒有擴(kuò)增到目的片段，引物SP6雖然在瓊脂糖中擴(kuò)增得到目的片段，但擴(kuò)增條帶顯影太弱，且不穩(wěn)定，不適合進(jìn)行PAGE檢測(cè)。其他35對(duì)引物在8個(gè)檢測(cè)樣本中均獲得了穩(wěn)定的目的條帶。

從46對(duì)引物中篩選出38對(duì)有目的條帶且擴(kuò)增穩(wěn)定的引物用于多態(tài)性驗(yàn)證。8份材料的SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果見表4。結(jié)果表明，38對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出清晰譜帶210條，不同引物的擴(kuò)增帶數(shù)1～12 條不等，平均每對(duì)引物的擴(kuò)增條帶數(shù)為5.526 3條，帶數(shù)最多的為SP11（12條），最少的為SP1和SP24（各1條）；每對(duì)引物組合可檢測(cè)到SSR多樣性位點(diǎn)數(shù)為3～9個(gè)，共檢測(cè)到106個(gè)多樣性位點(diǎn)。根據(jù)軟件POPGENE計(jì)算得出觀察雜合度值Ho，其中Ho值范圍從0（說明無多態(tài)性）到1（說明無限多個(gè)等位形式具有相同的頻率）；所有位點(diǎn)的平均PIC值為0.645 8，最高位0.890 0，最低為0，即除了引物對(duì)SP1和SP24之外，其他均為多態(tài)性位點(diǎn)。

2.4 SSR位點(diǎn)在桑屬系統(tǒng)分類中的應(yīng)用

SSR電泳結(jié)果顯示，8份供試材料在SSR水平上表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性差異。按照SSR擴(kuò)增條帶的表型進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明這8份桑材料聚為2簇。從圖3和表5可以看出，野生品種葫蘆桑和巖桑聚為Ⅰ組，兩者遺傳距離較近，為0.746 0，遺傳相似系數(shù)為0.474 3。栽培品種垂桑、荷葉白、劍持、新一之瀨、倫教40聚為一枝后，與雞桑聚為同一簇（Ⅱ組），其中劍持與荷葉白遺傳距離最近（0.169 5），遺傳相似系數(shù)最大（0.844 1）。雞桑在Ⅱ組中與荷葉白的遺傳距離最遠(yuǎn)（0.959 2），遺傳相似系數(shù)最?。?.383 2）。即在供試材料中，劍持和荷葉白的親緣關(guān)系最近，葫蘆桑和巖桑與荷葉白的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 小結(jié)

桑樹SSR引物開發(fā)及分析成功的關(guān)鍵是獲取高質(zhì)量的基因組DNA。采用改良CTAB法提取桑樹DNA，通過0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明DNA無降解，帶型整齊。選出38對(duì)有穩(wěn)定目的擴(kuò)增條帶的引物用于8份桑樹材料的多態(tài)性驗(yàn)證，結(jié)果表明，38對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出清晰譜帶210條。不同引物的擴(kuò)增帶數(shù)1～12條，平均每個(gè)引物的擴(kuò)增帶數(shù)為5.526 3條。帶數(shù)最多的是SP11，為12條；最少的是SP1、SP24，各1條。每對(duì)引物組合可檢測(cè)到SSR多樣性位點(diǎn)數(shù)為3～9個(gè)，共檢測(cè)到106個(gè)多樣性位點(diǎn)。所有位點(diǎn)的平均PIC值為0.645 8，最高位0.890 0，最低為0。即除了引物對(duì)SP1和SP24之外，其他均為多態(tài)性位點(diǎn)。

8份供試材料在SSR水平上表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性差異。野生品種葫蘆桑和巖桑聚為Ⅰ組，遺傳距離較近，為0.746 0，遺傳相似系數(shù)為0.474 3；栽培品種垂桑、荷葉白、劍持、新一之瀨、倫教40聚在一起后與雞桑聚為Ⅱ組，其中劍持與荷葉白遺傳距離最近（0.169 5），遺傳相似系數(shù)最大（0.844 1），雞桑在Ⅱ組中與荷葉白的遺傳距離最遠(yuǎn)（0.959 2），遺傳相似系數(shù)最小（0.383 2）。即在供試的材料中，劍持和荷葉白的親緣關(guān)系最近，葫蘆桑和巖桑與荷葉白的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。該研究開發(fā)的桑樹SSR引物將為桑樹遺傳多樣性分析與親緣關(guān)系、種質(zhì)資源利用、育種群體的建立等奠定基礎(chǔ)。

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