西瓜種子細(xì)菌性果腐病消毒方法研究

摘要：研究了物理方法（干熱處理）、化學(xué)藥劑（甲醛、鹽酸、過氧化氫、次氯酸鈉）以及殺菌劑對西瓜（Citrullus lanatus）種子細(xì)菌性果腐病消毒效果的影響。結(jié)果表明，3%的HCl和5%的甲醛處理20 min及0.5%或1% ZC處理1 h，對西瓜種子細(xì)菌性果腐病防治效果良好，對西瓜種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢無顯著影響，且對種子胚根生長具有明顯的促進(jìn)作用，建議在生產(chǎn)上推廣使用。

關(guān)鍵詞：西瓜（Citrullus lanatus）；細(xì)菌性果腐病；消毒方法

中圖分類號：S436.5；S651 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2808-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.024

瓜類細(xì)菌性果腐病（Bacterial Fruit Blotch，BFB）主要初侵染源為帶菌種子，通過傷口、皮孔侵染，是典型的由種子帶菌引起的侵染性病害[1]。病害一旦發(fā)生，幼苗大面積死亡，果實大面積腐爛，且擴(kuò)展非常迅速，導(dǎo)致瓜類作物毀滅性的損失。

生產(chǎn)健康的種子，防止種子帶菌和種子進(jìn)行消毒是有效控制果腐病發(fā)生的主要措施[2]。目前種子消毒的方法主要有物理處理、化學(xué)藥劑處理、發(fā)酵處理等。Lovic等[3]發(fā)現(xiàn)1% HCl處理15 min可降低種子發(fā)病率；趙秋菊等[4]發(fā)現(xiàn)先用5% HCl或5%雙氧水或過氧乙酸40倍稀釋液消毒1 h，再經(jīng)71 ℃干熱殺菌4 d可將西瓜病株率降低到1%以下；張國裕等[5]發(fā)現(xiàn)用0.5%漂白粉消毒5 min即可殺死種子表皮所攜帶的果腐病病菌，而干熱處理對該病菌的殺菌效果不明顯。前人關(guān)于西瓜種子果腐病消毒的研究已有報道，但存在標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、研究結(jié)果不一致等問題。為此，試驗結(jié)合前人的研究結(jié)果，對多種果腐病的消毒方法進(jìn)行了研究，以期在同一標(biāo)準(zhǔn)下篩選出適合西瓜種子消毒的方法，為西瓜細(xì)菌性果腐病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試西瓜品種為早佳8424，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心提供。細(xì)菌性果腐病病原菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli）（以下簡稱Aac）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)研究室提供。

供試化學(xué)品：甲醛和過氧化氫均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，鹽酸購自信陽市化學(xué)試劑廠，次氯酸鈉購自天津市東麗新中村。殺菌劑：殺菌劑1號（ZC）購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、殺菌劑2號（XJ）購自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

KBA培養(yǎng)基配方：蛋白胨20 g，硫酸鎂1.5 g，磷酸氫二鉀1.5 g，甘油10 g，瓊脂粉13 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.4。KB液體培養(yǎng)基配方：KBA配方中不加瓊脂粉。

1.2 抗利福平Aac菌株的誘變

制備含0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20、30、50、75、100 μg/mL利福平（Rif）的KBA平板，從低濃度到高濃度逐次誘變抗100 μg/mL Rif的Rif-Aac菌株，在含100 μg/mL Rif的KBA平板上繼代培養(yǎng)5代后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Rif-Aac帶菌西瓜種子的制備

將Rif-Aac菌株在KBA平板上劃線培養(yǎng)48 h（28 ℃），挑取單菌落，接種于含100 μg/mL Rif的KB培養(yǎng)液中，30 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)菌液在6 000 r/min下離心5 min，棄上清液后收集菌體，用0.1 mol/L的無菌PBS（pH 7.2）緩沖液重新懸浮，裝入250 mL三角瓶中，調(diào)整菌懸液OD600 nm介于0.3～0.4（菌體濃度約108 CFU/mL）之間。將西瓜種子充分浸入菌懸液中，250 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，濾去菌液，自然風(fēng)干后備用。

1.4 種子消毒方法

1.4.1 物理方法 干熱處理在烘箱中進(jìn)行。采用溫度、時間雙因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，溫度設(shè)70、75、80 ℃ 3個水平，時間設(shè)24、48、72 h 3個水平，以接種過Aac的種子（CK1）和健康種子（CK2）為對照，共11個處理，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子。種子干熱處理后浸種，采用平皿培養(yǎng)法將種子置入滅菌的濾紙上，加入無菌水保濕，置于30 ℃培養(yǎng)箱催芽，120 h后測定發(fā)芽率，統(tǒng)計發(fā)病種子數(shù)。從已催芽的種子中選取30粒播種于消毒基質(zhì)中，進(jìn)行穴盤育苗，觀察并統(tǒng)計發(fā)病率。

1.4.2 化學(xué)方法 采用藥劑濃度、處理時間雙因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，分別配制1%、3%、5%的HCl和甲醛，1%、5%、10%的過氧化氫，1%、2.5%、5%的次氯酸鈉；以上各藥劑處理時間設(shè)10、20、30 min 3個水平。從各藥劑消毒后的沙培苗中隨機(jī)選取5株幼苗，加入5 mL無菌水在無菌研磨缽中研磨成勻漿，靜置5 min后，吸取1 mL研磨液涂布于含100 μg/mL Rif的KBA平板上，30 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察記錄菌落產(chǎn)生情況。對照及重復(fù)同“1.4.1”。

1.4.3 殺菌劑處理方法 配制4‰的XJ，處理時間分別為10、20、30 min；配制0.5%、1%的ZC，處理時間為1 h，對照及重復(fù)同“1.4.1”。

1.5 西瓜種子發(fā)芽勢、胚根長及發(fā)芽率的測定

各處理采用平皿培養(yǎng)法隨機(jī)選取50粒種子置入滅菌的濾紙上，加入無菌水保濕，放入30 ℃培養(yǎng)室催芽，72 h 后測定發(fā)芽勢、胚根長，120 h后測定發(fā)芽率，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)50粒種子。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SAS 8.0進(jìn)行新復(fù)極差檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 物理方法對西瓜種子細(xì)菌性果腐病的消毒效果

從表1可以看出，干熱處理具有一定的消毒效果，但不能完全殺滅種子攜帶的Aac病原菌，且對種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率有一定的影響。與對照相比，經(jīng)干熱處理后，隨著溫度的升高、作用時間的延長，各處理種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率總體呈下降趨勢，部分處理的發(fā)芽勢、發(fā)芽率與對照差異顯著。經(jīng)干熱處理后，與CK1相比，各處理的種子帶菌率降低5.3～27.3個百分點，幼苗發(fā)病率降低11.1～31.1個百分點，不符合種子檢疫性消毒后零發(fā)病、零檢出的要求。

2.2 化學(xué)方法對西瓜種子細(xì)菌性果腐病的消毒效果

2.2.1 鹽酸對種子的消毒效果 鹽酸對西瓜帶菌種子的消毒效果見表2。從表2可以看出，除5% HCl處理30 min外，其他處理種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率之間無顯著差異。鹽酸處理后的種子胚根長均大于CK1和CK2。通過沙培觀察子葉或胚根是否染病來評價消毒效果，1% HCl處理30 min、3% HCl處理20 min、3% HCl處理30 min、5% HCl處理20 min、5% HCl處理30 min的子葉及胚根均未出現(xiàn)病斑?？剐云桨宸蛛x結(jié)果顯示，僅有3% HCl處理20 min、3% HCl處理30 min、5% HCl處理20 min、5% HCl處理30 min幼苗中未分離出Aac菌。結(jié)合癥狀觀察結(jié)果，認(rèn)為1% HCl處理30 min幼苗中可能潛伏不足以致病數(shù)量的病原菌。綜合消毒效果及成本，3%HCl處理20 min比較適宜應(yīng)用于實際生產(chǎn)。

2.2.2 甲醛對種子的消毒效果 由表3可知，與CK2相比，大部分處理對種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率及胚根長影響較小。3%甲醛處理種子30 min后的沙培幼苗未出現(xiàn)感病癥狀，但抗性平板上出現(xiàn)Aac菌落，說明該處理消毒不徹底。5%甲醛對種子消毒20 min或30 min未出現(xiàn)病斑和未檢出菌落，具有很好的消毒效果?？紤]到5%甲醛作用30 min后抑制胚根生長，因此推薦5%甲醛處理帶菌種子20 min。

2.2.3 次氯酸鈉對種子的消毒效果 由表4可知，雖然次氯酸鈉能促進(jìn)種子胚根的生長，比CK1的胚根長增加了5.5～10.9 mm，但消毒效果差，且一定程度上影響了西瓜種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率。因此，實際生產(chǎn)中次氯酸鈉不適宜作為種子消毒劑來處理攜帶Aac的西瓜種子。

2.2.4 過氧化氫對種子的殺菌效果 由表5可以看出，過氧化氫處理對帶菌種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率及胚根長影響不大，但對種子Aac菌的消毒效果差，結(jié)果均為陽性。說明過氧化氫不適宜用來處理攜帶Aac的西瓜種子。

2.3 殺菌劑對西瓜種子的消毒效果

選用推廣的2種殺菌劑，按照推廣藥劑的使用操作設(shè)計，試驗結(jié)果見表6。由表6可知，0.5%和1%ZC對攜帶Aac的西瓜種子作用1 h均有良好的消毒效果，而XJ不能殺滅西瓜種子攜帶的Aac菌。此外，ZC處理的種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率與CK1差異不顯著，胚根長顯著高于CK2。因此，0.5%和1% ZC可在實際生產(chǎn)中推薦使用。

3 小結(jié)與討論

由于西瓜細(xì)菌性果腐病是種傳病害，對西瓜種子進(jìn)行消毒是防治該病發(fā)生的最有效的方法之一。細(xì)菌性果腐病較耐干熱高溫，趙秋菊等[4]發(fā)現(xiàn)西瓜種子干熱處理抑制BFB的能力低于藥劑處理；Wall等[6]也發(fā)現(xiàn)干熱處理對BFB的抑制效果不顯著。本試驗也證明了干熱處理對果腐病的消毒效果較差。

王欽英等[7]和趙廷昌等[8]均發(fā)現(xiàn)，3% HCl處理15 min，水洗后，用600倍加瑞農(nóng)稀釋液浸種處理過夜對細(xì)菌性果斑病有較好的防治效果；杜艷梅等[9]發(fā)現(xiàn)1% HCl處理5 min對西瓜細(xì)菌性果斑病防治效果最好。試驗結(jié)果表明，3% HCl和5%甲醛處理20 min對西瓜細(xì)菌性果腐病具有較好的消毒效果，而過氧化氫和次氯酸鈉等化學(xué)藥劑消毒效果較差；0.5%和1% ZC殺菌劑處理1 h對細(xì)菌性果腐病菌具有良好的消毒效果，對西瓜種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢無顯著影響，且對種子胚根生長具有明顯的促進(jìn)作用，建議在生產(chǎn)上推廣使用。

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