GOX—CP4EPSP轉化甘藍型油菜的抗草甘膦研究

摘要：利用Genome walking方法在孟山都抗農達油菜（Brassica napus L.）中克隆了GOX-CP4EPSP雙順反子結構。利用農桿菌介導的遺傳轉化方法將PCAMBIA-GOX-CP4EPSP植物雙元表達載體轉化甘藍型油菜PolCMS恢復系“7-5”獲得轉基因植株。在田間對轉基因植株噴施400倍的農達（41%草甘膦異丙胺鹽），所有的轉基因家系都能存活，而非轉基因PolCMS恢復系“7-5”全部死亡。在轉基因植株葉片中能夠檢測到GOX和CP4EPSP基因的表達。對轉基因T1代3個家系在60 mg/L草甘膦培養(yǎng)基上的發(fā)芽試驗以及GUS染色分析表明抗草甘膦的單株能表達與GOX-CP4EPSP共轉化的GUS蛋白質，而對草甘膦敏感的單株和野生型對照植株都不能表達GUS蛋白質。鑒于GOX-CP4EPSP雙順反子在轉基因油菜中的有效性和穩(wěn)定性，可以作為雙子葉植物遺傳轉化的篩選標記。

關鍵詞：油菜（Brassica napus L.）；GOX-CP4EPSP；雙順反子；草甘膦抗性；農達；篩選標記

中圖分類號：S482.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）10-2661-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.053

Abstract： GOX-CP4EPSP Two-Cistron structure from Monsanto Roundup resistant Brassica napus L. was cloned by Genome walking Transgenic PolCMS restore line “7-5” with plant binary transformation vector PCAMBIA-GOX-CP4EPSP survived better under 400 time diluted solution with commercial glyphosate-containing 41% herbicide， while non-transgenic plants“7-5” died sprayed with the same diluted solution. In transgenic plants leaves， GOX and CP4EPSP stably expressed. Three transgenic T1 plant lines germination and growth in 60 mg/L glyphosate medium and GUS staining detection indicate glyphosate resistant plants show stable GUS expression， however glyphosate sensitive plants have no GUS activity assessed histochemically in X-Gluc solution. Due to the efficiency in transgenic Brassica napus L.， the use of GOX-CP4EPSP structure as a selectable marker provides an effective and alternative transformation selection system for dicot species.

Key words： Brassica napus L.； GOX-CP4EPSP； two-cistron； glyphosate resistance； roundup； selective marker

草甘膦（N-phosphonomethyl-glycine，Glyphosate）是一種內吸傳導型廣譜滅生性除草劑。1974年草甘膦作為除草劑在美國登記注冊之后，孟山都公司推出了草甘膦異丙胺鹽將其投放市場，商品名為農達（Roundup）[1]。目前，草甘膦是世界上應用最為廣泛的農藥品種[2-5]。

草甘膦被植物迅速吸收后隨著同化產(chǎn)物輸導到植物的整個器官中，對植物細胞分裂、葉綠素合成以及光合作用過程中的蛋白質代謝有著重要影響并導致植物死亡。根據(jù)草甘膦的抑制作用原理[6，7]，能使植物具有草甘膦抗性的方法有過量表達植物內源EPSP合酶；降解或者修飾解除草甘膦的抑制作用；在植物中轉化并表達外源EPSP合酶[8]。在細菌中，EPSPs是由aroA基因所編碼，大量抗草甘膦的aroA基因已被克隆，但只有少數(shù)基因被應用于商業(yè)化轉基因抗除草劑作物中[9-12]。目前抗草甘膦的作物大多數(shù)是轉入非敏感型的EPSP合酶基因，如從農桿菌（Agrobacterium sp.CP4）中分離出的EPSP合成酶，它對PEP具有較高的親和性但對草甘膦不敏感，可以很好地替代植物內源的EPSP合成酶系統(tǒng)，保證莽草酸途徑正常[13-15]。將CP4EPSP基因導入珂字棉312使其產(chǎn)生對草甘膦的抗性，是由于CP4EPSP合成酶競爭性與底物PEP結合從而產(chǎn)生草甘膦抗性[16]。對EPSP合酶基因實現(xiàn)突變能創(chuàng)造新的耐草甘膦EPSPs。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）中的aroA基因是草甘膦作用靶標EPSP合成酶的編碼基因，該基因中單個核苷酸所造成的氨基酸的變化（Pro101Ser）會使其與底物PEP和草甘膦的親和性下降，但與后者的親和性下降得更多，從而產(chǎn)生對草甘膦的抗性[17]。對aroA基因的多個氨基酸位點突變，以提高對PEP的親和力而降低對草甘膦的親和力可以優(yōu)化對草甘膦的抗性[18]。對草甘膦敏感的植物和細菌的EPSP合酶中100位置的氨基酸是保守的Gly，當EPSP發(fā)生雙突變（T971，P101S）會引起Gly移碼到96位的草甘膦結合位點，從而產(chǎn)生草甘膦的耐受性[19]。水稻EPSP合酶基因出現(xiàn)P106L的突變能在大腸桿菌及轉基因煙草中提高對草甘膦的抗性[20]。玉米中兩個密碼子的改變能提高玉米對草甘膦的耐受性[21]。在牛筋草的EPSPS發(fā)生突變P106S，能提高5倍草甘膦的耐受性[22]。草甘膦氧化-還原酶GOX（Glyphosate oxidoreductase）是一類以草甘膦為靶標的解毒抗性物質，它存在于植物中對草甘膦的降解作用比較緩慢，細菌的GOX對草甘膦的降解速度快，但是不能單獨使用，所以和抗草甘膦的CP4共同使用。Barry等[23]從耐草甘膦的細菌中克隆了草甘膦氧化還原酶基因（GOX），該基因能夠將草甘膦降解為氨甲基磷酸。將GOX基因和CP4EPSP基因轉化到小麥后得到了抗草甘膦的植株，并且GOX和CP4EPSP基因成為小麥遺傳轉化試驗中有效的篩選標記[24]。

本研究通過對不同品種甘藍型油菜（Brassica napus L.）進行草甘膦的耐受性試驗，確定在培養(yǎng)基上篩選油菜的合適濃度，根據(jù)Genome walking方法獲得具有抗性的GOX-CP4EPSP雙順反子的結構，將該結構連接在植物雙元表達載體PCAMBIA1301上，通過農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化甘藍型油菜PolCMS優(yōu)良恢復系“7-5”，獲得抗農達穩(wěn)定的轉基因家系。對轉基因植株葉片組織分析確定了抗性基因GOX和CP4EPSP都能夠穩(wěn)定表達，與GOX-CP4EPSP結構共表達的GUS基因能夠在草甘膦抗性培養(yǎng)基篩選到的陽性植株中穩(wěn)定表達，表明GOX-CP4EPSP表達能作為油菜遺傳轉化的篩選標記。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料、組培激素和除草劑 油菜優(yōu)良的PolCMS恢復系材料“7-5”和“7492”來自于華中農業(yè)大學油菜育種研究室?？共莞熟⒌挠筒藖碜杂谌A中農業(yè)大學油菜育種研究室以孟山都公司抗農達轉基因油菜作為供體親本，“6179”為輪回親本經(jīng)過多年回交以及抗性鑒定的抗草甘膦油菜。油菜組織培養(yǎng)中的激素2，4-D，6-芐基嘌呤和玉米素均購自Sigma公司。組培中使用篩選劑草甘膦（glyphosate）購自Sigma公司（P9556：N-磷酰基甲基-甘氨酸），組培篩選濃度60 mg/L。組培中使用的潮霉素（HPT）購自Roche公司，篩選濃度20 mg/L。人工溫室中噴施油菜的是稀釋400倍的農達（41%草甘膦異丙胺鹽）。

1.1.2 主要載體及試劑 植物表達的雙元轉化載體為pCAMBIA1301載體，Taq酶購自Fermentas公司，TA克隆試劑盒pGEM-T購自Promega公司，膠回收試劑盒購自美國Omega公司，Genome WalkerTM Universal Kit為Clontech產(chǎn)品，感受態(tài)細胞宿主菌E. coil DH5α。GUS染色液的配制：100 mg Gluc，先溶于1 mL的DMF。取80 mL 50 mmoL/L的磷酸鈉緩沖液（pH 7.0），加入1 mL 50 mmol/L鐵氰化鉀、 1 mL 50 mmol/L亞鐵氰化鉀和2 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），再加入已溶解的Gluc，再加20 mL的甲醇混勻。將配好的GUS檢測液分裝于1.5 mL的離心管中（1 mL/管，1組1管），-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 引物 引物合成和測序來自北京擎科生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同甘藍型油菜在草甘膦培養(yǎng)基上發(fā)芽試驗 將甘藍型油菜“7-5”，“7492”分別在添加了3種濃度40、60和80 mg/L草甘膦培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察在不同濃度草甘膦處理后的發(fā)芽情況。

1.2.2 GOX-CP4EPSP雙順反子的克隆 將轉育得到的抗草甘膦油菜材料構建基因組文庫，具體步驟參考洪登峰[25]。以構建好的文庫為模板，分別對GOX和CP4EPSP 2個元件的5′端和3′端進行兩輪PCR-Walking反應，引物見表1。PCR產(chǎn)物回收后測序，序列拼接后在NCBI-Blast網(wǎng)站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對序列，獲得雙順反子結構中完整的P-FMV、CTPI、GOX、E9 3′terminator、CTP2和CP4EPSP組分的序列。

1.2.3 轉基因植株PCR檢測 取植株的葉片按照CTAB小樣法提取總DNA。雙順反子中標記基因的特異引物GOX-F和GOX-R，EPSP-F和EPSP-R。半定量PCR檢測試驗中內參引物Actin-F和Actin-R。PCR反應體系：10×Buffer 2.0 μL，dNTPs （10 mmol/L）0.15 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.0 μL，Primer-F（10 μmol/L）0.2 μL，Primer-R（10 μmol/L）0.2 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，油菜總DNA模板（50 ng/μL）2 μL，ddH2O補足至20 μL，混合均勻后加礦物油覆蓋。PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.4 油菜下胚軸遺傳轉化培養(yǎng) 油菜種子消毒后置于發(fā)芽培養(yǎng)基MS+20 g/L 蔗糖+0.8% 瓊脂，暗培養(yǎng)7 d。將切成0.5 cm的油菜下胚軸置于預培養(yǎng)基MS+30 g/L 蔗糖+0.8%瓊脂 +1 mg/L 2，4-D，培養(yǎng)3 d。取活化好的含有植物雙元轉化載體的農桿菌（OD600 nm=0.1）侵染外植體，將侵染后的外植體轉移到鋪上濾紙的共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 d。將外植體轉移到脫菌培養(yǎng)基MS+30 g/L蔗糖+0.8%瓊脂+1 mg/L 2，4-D+250 mg/L羧芐青霉素二鈉+10 mg/L潮霉素或者60 mg/L草甘膦，培養(yǎng)7 d。轉移外植體到誘導愈傷培養(yǎng)基MS+4 mg/L 6-芐基嘌呤+2 mg/L 玉米素+30 g/L 蔗糖+0.8%瓊脂+250 mg/L羧芐青霉素二鈉+10 mg/L潮霉素或者60 mg/L 草甘膦+5 mg/L AgNO3培養(yǎng)2～3周，待外植體兩端愈傷膨大后轉移到誘導出芽培養(yǎng)基MS+3 mg/L 6-芐基嘌呤+2 mg/L玉米素+30 g/L蔗糖+0.8%瓊脂+250 mg/L羧芐青霉素二鈉+10 mg/L潮霉素或者60 mg/L草甘膦上直到出芽。

1.2.5 草甘膦篩選培養(yǎng)基上油菜苗的GUS檢測 將轉基因油菜T1代以及非轉基因對照的種子置于60 mg/L草甘膦培養(yǎng)基發(fā)芽，10 d后將培養(yǎng)基上的油菜苗放入X-Gluc染色液中37 ℃暗反應16 h，之后在76%乙醇中脫色1 d，拍照。

2 結果與分析

2.1 甘藍型油菜對不同濃度草甘膦的耐受性研究

將甘藍型油菜“7-5”和“7492”在40、60和80 mg/L草甘膦的培養(yǎng)基上發(fā)芽。隨著草甘膦濃度的增加，“7-5”和“7492”的根系生長受到抑制，主要表現(xiàn)為根毛不能正常伸展（圖1）。在40 mg/L草甘膦培養(yǎng)基中“7-5”和“7492”有20%單株的根毛能夠繼續(xù)伸長，而在60、80 mg/L草甘膦培養(yǎng)基上100%單株的根毛不能正常伸展，因此，將60 mg/L草甘膦濃度定義為轉基因抗除草劑油菜和非轉基因油菜發(fā)芽試驗中篩選濃度。

2.2 GOX-CP4EPSP雙順反子的克隆

利用GOX和CP4EPSP元件的特異引物在轉育得到的抗草甘膦的轉基因油菜材料中擴增出部分GOX和CP4EPSP元件的序列。根據(jù)所獲得的序列設計Genome walking反應的引物，利用巢式PCR分別擴增GOX元件以及CP4EPSP元件的上游和下游的序列，拼接后進行Blast比對，最后確定完整的FMV啟動子、葉綠體定位信號肽CTP、GOX基因編碼區(qū)、CP4EPSP基因編碼區(qū)以及Pea E9的3’terminator的序列（圖2）。

2.3 GOX-CP4EPSP轉化油菜的轉基因植株的抗性鑒定

將克隆得到的GOX-CP4EPSP雙順反子結構連接到植物表達載體PCAMBIA1301中，獲得GOX-CP4EPSP表達載體，并將pCAMBIA1301-GOX-CP4EPSP轉化甘藍型油菜“7-5”中。對所獲得的轉基因T1代3個家系的植株進行分子鑒定確定陽性單株，在人工溫室中對野生型非轉基因植株和T1代轉基因植株噴施農達。結果表明，轉基因陽性植株都表現(xiàn)對農達的抗性（圖3A、圖3B）。T1代轉基因植株在添加不同濃度的草甘膦培養(yǎng)基上發(fā)芽，結果顯示隨著草甘膦濃度的增加T1代種子正常發(fā)芽后能夠生長成幼苗，而非轉基因植株在添加不同濃度草甘膦的培養(yǎng)基上生長受到嚴重抑制（圖3C）。對T1代抗性植株自交后獲得的T2代種子在60 mg/L草甘膦培養(yǎng)基上發(fā)芽。相比非轉基因材料，轉基因植株種子能夠正常萌發(fā)并且根系發(fā)育正常，根毛舒展（圖3D）。

2.4 GOX和CP4EPSP基因在轉基因抗草甘膦植株中的表達分析

如圖4A所示，在4個轉基因T2代家系植株的葉片中都能夠檢測到GOX和CP4EPSP基因的表達。在人工溫室中對轉基因家系和非轉基因材料噴施稀釋400倍的農達，相比非轉基因材料，所有的轉基因單株表現(xiàn)出對農達的抗性（圖4B）。

2.5 利用GOX-CP4EPSP作為轉基因材料篩選標記

將轉基因T1代3個家系GB6、GD16、GE3和非轉基因的種子在60 mg/L草甘膦的培養(yǎng)基上發(fā)芽，其中GB6T1和GE3T1家系在培養(yǎng)基上能夠正常生長，而GD16T1在培養(yǎng)基上有少數(shù)單株和非轉基因油菜苗表現(xiàn)一致，它們的根系生長都受到嚴重抑制（圖5A箭頭所指）。pCAMBIA1301-GOX-CP4EPSP載體上含有GUS基因，轉基因抗草甘膦油菜單株中GUS基因能夠與GOX-EPSP雙順反子結構共表達。選取GB6T1、GE3T1和GD16T1家系中抗草甘膦的單株、非轉基因材料以及GD16T1在篩選培養(yǎng)基上表現(xiàn)對草甘膦敏感的植株置于X-Gluc染色液中染色。如圖5B所示，只有在草甘膦篩選培養(yǎng)基上正常生長的轉基因油菜才能檢測到GUS蛋白質的表達，而根系生長受到嚴重抑制的油菜苗中檢測不到GUS蛋白質表達。為避免植物內源組織染色產(chǎn)生的假陽性，對GD16家系在篩選培養(yǎng)基中具有抗性和敏感的單株取樣，檢測GUS基因。由表2可以看出，所有能夠在60 mg/L草甘膦培養(yǎng)基上正常生長的轉基因單株都能檢測到GUS基因以及GUS蛋白質的表達，而不能繼續(xù)生長的植株中檢測不到GUS蛋白質的表達，因此GOX-CP4EPSP雙順反子結構是油菜在草甘膦篩選培養(yǎng)過程中的有效篩選標記基因。

3 討論

農達是當今世界上銷售量最大并且使用最為廣泛的除草劑品種。EPSP合成酶催化phosphoenolpyruvate（PEP）轉化為S3P，早在1980年，研究者們就獲得了對草甘膦不敏感的EPSP合酶應用到作物抗除草劑的育種中。隨后在微生物中通過對EPSP合酶的位點特異性突變尋找到新的抗性突變，但是隨著突變后的EPSP合酶對草甘膦抗性的增強也同時會表現(xiàn)出對PEP的親和性下降從而影響催化活性。本試驗中所利用的CP4-EPSP合酶基因是因為在活性位點中有一個殘基（Ala-100）使其具有對草甘膦的抗性。而在自然界的植物和細菌中EPSP酶的此活性位點是Gly殘基。在一定濃度的草甘膦持久處理下可能會產(chǎn)生既能夠降低草甘膦活性也能保持穩(wěn)定催化效率的突變位點。至今為止從細菌中獲得了有效的抗草甘膦的EPSP合酶突變位點，而在植物中所得到抗除草劑的突變EPSP合酶基因用于抗除草劑應用的很少，這可能是因為天然抗草甘膦新基因的產(chǎn)生依賴于細菌或者植株組織的繁殖代數(shù)以及基因復制的穩(wěn)定性。相比細菌，大多數(shù)植物的生育期長并且基因復制過程受到嚴格調控，不易得到天然的抗草甘膦突變體。另外前人研究認為EPSP合酶是病原菌以及害蟲的靶酶，而草甘膦只具有微弱的抗真菌的作用，對EPSP合酶與草甘膦以及其余抑制劑結合的模式研究中可以設計出新型抗病蟲的除草劑抗性基因。

本研究利用孟山都公司轉基因抗農達的油菜中克隆到GOX-CP4EPSP的雙順反子結構，并利用遺傳轉化的方法將其轉化到甘藍型油菜PolCMS恢復系“7-5”中。轉基因T1代以及T2代都表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗性。相比傳統(tǒng)轉育的方法來獲得抗農達的油菜，這種方法可以有效地避免轉育過程中的遺傳背景對受體材料的影響，通過一次轉基因事件獲得抗農達的油菜省時省力。另外將轉基因T1代油菜和非轉基因材料在60 mg/L草甘膦的濃度下篩選后獲得了能夠正常生長的植株，在這些植株中都能夠檢測到共表達的GUS蛋白質的活性，而受到嚴重抑制的植株中檢測不到GUS蛋白質的表達。草甘膦具有能夠在植株分生組織中快速積累并有效抑制非轉化植株的特性，表明GOX-CP4EPSP雙順反子結構的表達能夠成為油菜轉化試驗的篩選標記基因。

隨著轉基因抗農達植物的廣泛種植，農達的長期而大量地使用所帶來的環(huán)境問題引起研究者的關注。雜草種群內存在著大量遺傳變異如基因突變、種內異花授粉會增加雜草的抗藥性，另外較強的除草劑選擇壓會篩選出抗藥遺傳類型的雜草群體，它們的除草劑靶基因序列或者表達發(fā)生改變導致與除草劑結合能力下降或者靶標酶濃度增加使得除草劑不能與其飽和[26-28]。在實際應用中可以在植物雙元轉化載體中引入兩種或者多種除草劑抗性基因，這樣可以通過一次轉基因事件高效獲得能抗多種不同原理除草劑的油菜新材料，在田間輪流使用不同類型的除草劑，合理搭配速效性除草劑和遲效性除草劑，延長除草劑的有效期，發(fā)揮其最大的防治效果可以有效避免雜草的耐藥性。

參考文獻：

[1] DUKE S O，POWLES S B. Glyphosate： A once-in-a-century herbicide[J]. Pest Manag Sci，2008，64：319-325.

[2] 蘇少泉.草甘磷述評[J].農藥，2005，44（4）：145-149.

[3] GIESY J P，DOBSON S，SOLOMON K R. Ecotoxicological risk assessment for roundup herbicide[J]. Rev Environ Contam Toxicol，2000，167：35-120.

[4] CERDEIRA A L， DUKE S O. The current status and environmental impacts of glyphosate-resistant crops[J].J Environ Qual， 2006，35：1633-1658.

[5] DILL G M，CAJACOB C A，PADGETTE S R. Glyphosate-resistant crops：History，status and future considerations[J].Pest Manag Sci，2008，64：326-331.

[6] 朱 玉，于中連，于 敏.草甘膦生物抗性和生物降解及其轉基因研究[J].分子植物育種，2003，1（4）：435-441.

[7] SCHONBRUNN E， ESCHENBURG S， SHUTTLEWORTH W A， et al. Interaction of the herbicide glyphosate with its target enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase in atomic detail[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98：1376-1380.

[8] BRADSHAW L D，PADGETTE S R，KIMBALL S L，et al. Perspectives on glyphosate resistance[J]. Weed Technol，1997，11：189-198.

[9] FUNKE T，HAN H，HEALY-FRIED M L，et al. Molecular basis for the herbicide resistance of roundup ready crops[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103：13010-13015.

[10] POWELL H A，KERBY N W，ROWELL P. Natural tolerance of cyanobacteria to the herbicide glyphosate[J]. New Phytol，1991，119：421-426.

[11] PRIESTMAN M A，F(xiàn)UNKE T，SINGH I M，et al. 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Staphylococcus aureus is insensitive to glyphosate[J].FEBS Lett，2005，579：728-732.

[12] TIAN Y S，XIONG A S，XU J，et al.Isolation from Ochrobactrum anthropicof a novel class II 5-enopyruvylshikimate-3-phosphate synthase with high tolerance to glyphosate[J].Appl Environ Microbiol， 2010，76：6001-6005.

[13] CHEN Y C S，HUBMEIER C， TRAN M，et al. Expression of CP4 EPSPS in microspores and tapetum cells of cotton （Gossypium hirsutum） is critical for male reproductive development in response to late-stage glyphosate applications[J]. Plant Biotechnology Journal，2006，4（5）：477-487.

[14] HECK G R，ARMSTRONG C L，ASTWOOD J D，et al. Development and characterization of a CP4 EPSPS-based，glyphosate-tolerant corn event[J]. Crop Science，2005，45（1）： 329-339.

[15] DUN B Q， WANG X J， LU W， et al. Reconstitution of glyphosate resistance from a split 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase gene in Escherichia coli and transgenic tobacco[J]. Applied and Environmental Microbiology，2007， 73（24）：7997-8000.

[16] MAY O L，CULPEPPER A S，CERNY R E，et al. Transgenic cotton with improved resistance to glyphosate herbicide[J].Crop Science，2004，44（1）：234-240.

[17] COMAI L， SEN L C， STALKER D M. An altered aroA gene product confers resistance to the herbicide glyphosate[J]. Science，1983，221： 370-371.

[18] CAO G，LIU Y，ZHANG S，et al. A novel 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase shows high glyphosate tolerance in Escherichia coli and tobacco plants[J]. PloS One，2012，7（6）：e38718.

[19] FUNKE T，YANG Y，HAN H，et al.Structural basis of glyphosate resistance resulting from the double mutation Thr97→Ile and Pro101→Ser in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli[J]. J Biol Chem，2009，284：9854-9860.

[20] ZHOU M，XU H，WEI X，et al. Identification of a glyphosate-resistant mutant of rice 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase using a directed evolution strategy[J]. Plant Physiol， 2006，140： 184-195.

[21] HOWE A R，GASSER C S，BROWN S M， et al. Glyphosate as a selective agent for the production of fertile transgenic maize （Zea mays L.） plants[J].Mol Breeding，2002，10：153-164.

[22] BAERSON S R，RODRIGUEZ D J，TRAN M，et al. Glyphosate-resistant goosegrass. Identification of a mutation in the target enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase[J].Plant Physiol，2002，129：1265-1275.

[23] BARRY G，KISHORE G，PADGETTE S，et al. Inhibitors of amino acid biosynthesis：strategies for imparting glyphosate tolerance to crop plants[J].Plant Physiol， 1992，7：139-145.

[24] ZHOU H，ARROWSMITH J W，F(xiàn)ROMM M E，et al.Glyphosate-tolerant CP4 and GOX genes as a selectable marker in wheat transformation[J].Plant Cell Reports，1995，15（3-4）：159-163.

[25] 洪登峰.甘藍型油菜顯性細胞核雄性不育基因Ms/Mf的定位[D].武漢：華中農業(yè)大學，2006.

[26] KEITH A. Safety assessment of genetically modified crops[J]. Toxicology，2002，181：421-426.

[27] GREEN J M. Evolution of glyphosate-resistant crop technology[J].Weed Science，2009，57（1）：108-117.

[28] WALLACE R D，SOSNOSKIE L M，CULPEPPER A S，et al. Tolerance of GlyTol？誖and GlyTol？誖+LibertyLink？誖cotton to glyphosate and glufosinate in the southeastern US[J].Cotton Sci，2011，15：80-88.