紫蘇RAS基因啟動(dòng)子的克隆及序列分析

摘要：迷迭香酸合成酶（Rosmarinic acid synthase，RAS）是紫蘇（Perilla frutescens）迷迭香酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，采用基因組步移方法，克隆得到長(zhǎng)度為2 022 bp的紫蘇RAS基因5′端的啟動(dòng)子片段，并對(duì)啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和順式作用元件進(jìn)行分析。結(jié)果表明，紫蘇RAS基因啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域除了含有基本的TATA-box和CAAT-box元件外，還含有多個(gè)與植物脅迫和生長(zhǎng)相關(guān)的順式作用元件，如脫落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素響應(yīng)的順式作用元件等，另外還包含多個(gè)光響應(yīng)順式作用元件。

關(guān)鍵詞：紫蘇（Perilla frutescens）；迷迭香酸合成酶；啟動(dòng)子；克隆；序列分析

中圖分類號(hào)：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）10-2656-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.052

Abstract： The rosmarinic acid synthase（RAS） is considered to be a key enzyme involved in rosmarinic acid biosynthesis pathway of Perilla frutescens. A 2 022 bp RAS gene promoter fragment was cloned using genomic walking technique. The analysis of transcription start point and cis-acting elements of the promoter showed that the fragment contained the conserved promoter sequence， such as TATA-box，CAAT-box. Furthermore，it contained many plant stress and growth-related cis-acting elements，such as cis-acting element involved in the ABA，MeJA and GA responsiveness，and it has many light responsive elements as well.

Key words： Perilla frutescens； rosmarinic acid synthase； promoter； cloning； sequence analysis

基因的表達(dá)和調(diào)控是植物基因工程研究的重要內(nèi)容，啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控中最主要的調(diào)控元件，對(duì)其功能及調(diào)控相關(guān)的研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)。啟動(dòng)子提供RNA聚合酶及其轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，能結(jié)合RNA聚合酶及其轉(zhuǎn)錄因子的區(qū)域稱為順式作用元件。植物基因啟動(dòng)子中包含多種重要的順式作用元件參與調(diào)控下游相應(yīng)基因的表達(dá)，并決定轉(zhuǎn)錄的方向和效率以及所用的RNA聚合酶類型[1]，因此，對(duì)植物啟動(dòng)子的研究有助于了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的表達(dá)模式及其調(diào)控機(jī)制。植物啟動(dòng)子由核心區(qū)域和上游調(diào)控區(qū)構(gòu)成，核心啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)構(gòu)通常包含TATA-box和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。TATA-box位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游幾十個(gè)堿基處，毗鄰核心啟動(dòng)子的上游區(qū)域即是啟動(dòng)子上游調(diào)控序列，富含轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。部分與逆境有關(guān)的啟動(dòng)子序列中還包含相應(yīng)的與逆境誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件，如脫落酸響應(yīng)元件（Abscisic acid responsive element）[2]、茉莉酸響應(yīng)元件（Jasmonate responsive element）[3]、乙烯響應(yīng)元件（Ethylene responsive element）[4]和低溫響應(yīng)元件（Low temperature responsive element）[5]等。植物基因工程的啟動(dòng)子根據(jù)其作用方式及功能可分為3類：組成型啟動(dòng)子、特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[6]。

紫蘇（Perilla frutescens）為唇形科紫蘇屬一年生草本植物，別名紅蘇、香蘇、蘇子、赤蘇，是國(guó)家衛(wèi)生部第一批頒布的藥食兼用的60種中藥之一[7]，紫蘇的莖葉和紫蘇油中含有酚類、萜類、黃酮類以及花青素和多糖等多種具有生物活性功能的成分，其生物活性主要表現(xiàn)為抗氧化、降血脂、抑癌、抗炎、止血、提高記憶力和視覺能力等[8]。

迷迭香酸合成酶（RAS）是迷迭香酸生物合成途徑中將苯丙氨酸支路和酪氨酸支路連接合成迷迭香酸前體物質(zhì)的關(guān)鍵酶[9]。目前，已經(jīng)在多種植物中克隆得到RAS基因序列，如彩葉草[10]、香蜂草[11]和薰衣草[12]等，但迄今對(duì)迷迭香酸合成酶基因上游啟動(dòng)子的研究尚未見報(bào)道。因此，對(duì)RAS基因啟動(dòng)子序列的克隆及分析將有助于探究RAS基因在紫蘇迷迭香酸生物合成途徑中的作用。在前期從紫蘇中克隆所得RAS基因的基礎(chǔ)上[13]，首先克隆RAS基因全長(zhǎng)DNA序列，以此為依據(jù)設(shè)計(jì)特異性引物，采用基因組步移（Genome walking）技術(shù)克隆得到紫蘇RAS基因的啟動(dòng)子序列，對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，本研究為后續(xù)的啟動(dòng)子功能分析及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，并為通過調(diào)控啟動(dòng)子來提高RAS基因的表達(dá)水平，促進(jìn)紫蘇迷迭香酸的生物合成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試種子 供試紫蘇種子由黑龍江省饒河縣饒河農(nóng)場(chǎng)提供，種植于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、光照時(shí)間16 h/d，葉片采集后于液氮中速凍并放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 pMD 18-T Vector試劑盒、大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α菌株、DNA Marker、Plant DNA Isolation Reagent和LA Taq酶均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)于Axygen公司；Genome Walker Universal Kit購(gòu)自Clontech公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，引物合成與測(cè)序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫蘇基因組DNA的提取及檢測(cè) 以紫蘇幼苗葉片為試驗(yàn)材料，使用Plant DNA Isolation Reagent提取基因組DNA，具體試驗(yàn)方法參照試劑盒說明書，并將提取的總DNA在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.2 紫蘇RAS基因全長(zhǎng)DNA序列的克隆及分析以已克隆出的紫蘇RAS基因的cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：KC355369）為參考，設(shè)計(jì)用于克隆RAS全長(zhǎng)DNA的引物RAS-F（5′-ATGAAGATAGAAGTCAAAGAC-3′）和RAS-R（5′-TCAAATCTCATAAAACAAC-3′），以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)并采用Axygen DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的條帶的回收與純化，連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，經(jīng)抗性篩選并挑選陽性克隆后由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 紫蘇RAS基因啟動(dòng)子的克隆 參考Genome Walker Universal Kit說明書，用4個(gè)限制性內(nèi)切酶（DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ、StuⅠ）分別酶切基因組DNA，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化處理。將純化后的產(chǎn)物與Genome Walker Adaptor連接，構(gòu)建基因組步移文庫(kù)，以此作為啟動(dòng)子克隆的模板。

根據(jù)紫蘇RAS基因DNA序列分析結(jié)果，設(shè)計(jì)用于基因組步移的下游特異性引物，RAS-GSP1（5′-CGACCAGGGCGCGGCTGAGCGCCGC-3′）和RAS-GSP2（5′-AAGTTGGCCGCGCCGTCGTGGCGGTA-3′），并將試劑盒提供的AP1和AP2作為上游引物，采用巢式PCR擴(kuò)增RAS基因啟動(dòng)子序列，PCR反應(yīng)體系及條件參考試劑盒說明書。用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，然后進(jìn)行TA克隆并提取重組質(zhì)粒送至測(cè)序公司測(cè)序。

1.2.4 紫蘇RAS基因啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析 啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)采用Neural Network Promoter Prediction（http：//www. fruitfly.org/seq_tools/

promoter.html）預(yù)測(cè)，并采用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序列中的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇RAS基因全長(zhǎng)DNA序列分析

參考紫蘇RAS基因的cDNA序列，通過PCR反應(yīng)獲得RAS基因的全長(zhǎng)DNA序列（圖1），以測(cè)序得到的序列信息，設(shè)計(jì)用于基因組步移的特異性引物。序列分析發(fā)現(xiàn)紫蘇RAS基因是一個(gè)無內(nèi)含子基因（Intron-free gene），與已報(bào)道的從香蜂草（Melissa officinalis）中克隆得到的RAS基因結(jié)構(gòu)相似[11]。

2.2 紫蘇RAS基因啟動(dòng)子的克隆

基因組DNA（圖2a）經(jīng)DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ、StuⅠ 4個(gè)限制性內(nèi)切酶消化后（圖2b），經(jīng)過純化、連接Adaptor后作為模板，與引物RAS-GSP1和AP1進(jìn)行Outer PCR擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果如圖2c所示。在7號(hào)泳道（EcoRⅤ酶切構(gòu)建文庫(kù)）出現(xiàn)了一條暗的條帶，以其作為模板，并以RAS-GSP2和AP2為引物進(jìn)行Inner PCR反應(yīng)，得到了大小為2 000 bp的片段，如圖2d所示。將PCR產(chǎn)物切膠回收并進(jìn)行TA克隆后，送至寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序，得到長(zhǎng)度為2 022 bp的5′側(cè)翼區(qū)序列。

2.3 紫蘇RAS基因啟動(dòng)子的序列分析

利用Neural Network Promoter Prediction對(duì)RAS基因啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在 1 918～1 968 bp處序列為：5′-AAAATTATAGTATA AGAGGGGCAAAATGGGTAATTCAGGTGGAATAAA TA-3′存在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)堿基為位于1 958 bp處的G，其可能性為97%。啟動(dòng)子序列除含有多個(gè)啟動(dòng)子必需的CAAT-Box和TATA-Box外，還有與激素、光照和環(huán)境因素等相關(guān)的調(diào)控元件（圖3）。各元件在序列中的詳細(xì)信息見表1。

3 小結(jié)與討論

植物的生長(zhǎng)發(fā)育受基因的調(diào)控，基因調(diào)控可分為基因結(jié)構(gòu)活化、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯及翻譯后水平調(diào)控等，從調(diào)控效果來看，最為有效的調(diào)控方式是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控主要涉及啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶3種因素的相互作用，其中最為主要的調(diào)控元件是啟動(dòng)子，對(duì)基因啟動(dòng)子的分離與功能的解析能更好地了解基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，并可以進(jìn)一步采用基因工程手段實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)[14]。

目前，植物啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用已取得了重大進(jìn)步，并已成功分離多種植物中的啟動(dòng)子序列[15-17]。RAS是紫蘇迷迭香酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，迄今未見其啟動(dòng)子的研究報(bào)道。本研究利用基因組步移技術(shù)，從紫蘇基因組DNA中獲得了RAS基因的5′端2 022 bp的側(cè)翼序列，推測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)G（定義為+1）位于起始密碼子上游67 bp處。通過PlantCARE在線分析，發(fā)現(xiàn)距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)最近的TATA-box，位置與其在真核生物基因中的通常分布情況相一致。該啟動(dòng)子序列含有真核生物典型的核心啟動(dòng)子區(qū)域，并含有眾多應(yīng)答激素和脅迫信號(hào)的順式作用元件，如脫落酸響應(yīng)順式元件（ABRE），赤霉素響應(yīng)元件（GARE-motif），干旱誘導(dǎo)相關(guān)MYB結(jié)合位點(diǎn)（MBS）和植物生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（TGA-element）等。在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，光作為一種重要的信號(hào)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，常見的受光調(diào)節(jié)啟動(dòng)子中的順式作用元件有3-AF1 binding site、AE-Box、GA-motif、GAG-motif、G-Box、I-box、Sp1和TCT-motif等，其中I-box更是單子葉和雙子葉植物中很多光調(diào)控基因啟動(dòng)子所具有的、帶有重要功能的調(diào)控元件[18]。本研究發(fā)現(xiàn)在RAS基因啟動(dòng)子序列中含有3-AF1 binding site、G-Box、I-box和Sp1光應(yīng)答原件，能夠調(diào)節(jié)其受光誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄活性。另外，在啟動(dòng)子中存在茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)的順式作用元件（CGTCA-motif），表明RAS基因的表達(dá)受到茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)，這與之前報(bào)道的MeJA在一定程度上可以上調(diào)RAS基因的轉(zhuǎn)錄水平相一致[13]。

綜上所述，紫蘇RAS基因啟動(dòng)子序列中具有的多種響應(yīng)元件說明其表達(dá)可能受到干旱、光脅迫以及茉莉酸甲酯、脫落酸、赤霉素等環(huán)境因素的影響，但是由于生物基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性，所預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子順式作用元件是否與預(yù)測(cè)的功能完全一致還有待進(jìn)一步驗(yàn)證和分析。為此，后續(xù)將采用啟動(dòng)子缺失等方法對(duì)其功能和結(jié)構(gòu)域開展研究，并進(jìn)一步通過構(gòu)建嵌合啟動(dòng)子為紫蘇的定向育種提供參考依據(jù)。

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