響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取魚(yú)腥草葉中多糖的工藝

摘要：采用酶解法提取魚(yú)腥草（Houttuynia cordata）葉中多糖，并采用響應(yīng)面試驗(yàn)法設(shè)計(jì)及建立回歸方程模型，以優(yōu)化酶法為提取工藝。以多糖提取量為指標(biāo)，考察液料比、纖維素酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度等因素對(duì)多糖提取量的影響。結(jié)果表明，影響魚(yú)腥草葉多糖提取量的主次順序?yàn)椋阂毫媳?gt;酶解溫度>酶解時(shí)間>酶添加量；確定最佳提取工藝條件為纖維素酶添加量0.9%、液料比52∶1（mL∶g）、酶解溫度31 ℃ 、酶解時(shí)間174 min。在此條件下，纖維素酶法提取魚(yú)腥草葉多糖的提取量為32.95 mg/g，表明采用響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取魚(yú)腥草葉多糖是合理可行的。

關(guān)鍵詞：魚(yú)腥草（Houttuynia cordata）；響應(yīng)面法；提取工藝；多糖

中圖分類號(hào)：S567.23+9；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）10-2622-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.043

Abstract：In this study， polysaccharide of Houttuynia cordata Thunb leaves is extracted by using enzymatic method， and use the response surface methodology（RSM） to design and build the regression equation model， so optimize the extraction process of enzymatic method. With the extraction rate of polysaccharide as the index， observe the effects of cellulose concentration， the ratio of water to material， and extraction temperature and time on the yield of polysaccharide. Subsequently， the primary and secondary order of factors that effects the Polysaccharide of Houttuynia cordata Thunb leaves is following： the ratio of water to material is the most factor， followed by extraction temperature， time and cellulose concentration. And the best extraction conditions is that 1.3% cellulose concentration at 37 ℃ for 174 min in a water-to-material ratio of 57∶1， The experimental result show that using response surface method to optimize the condition of extracting polysaccharide of Houttuynia cordata Thunb leaves is reasonable and feasible.

Key words： Houttuynia cordata Thunb； response surface methodology； extraction conditions； polysaccharide

魚(yú)腥草（Houttuynia cordata）是中國(guó)藥典收錄的草藥，草藥來(lái)源是三白草科（Saururaceae）植物蕺菜。魚(yú)腥草味辛，性寒涼，具有清熱解毒、利尿通淋消癰排膿及健胃消食的功效[1]。主要分布于中國(guó)中部、東南部及西南部各省區(qū)[2，3]，目前在四川、云南、貴州等地栽培較多[3]，資源極其豐富[4]。自古以來(lái)，魚(yú)腥草都可供食藥兩用[5]，它既是一種頗受歡迎的傳統(tǒng)特味野菜，同時(shí)也是一種傳統(tǒng)的中藥材，極具開(kāi)發(fā)潛力。臨床上多用于治療上呼吸道感染、流感、肺炎、肝炎等疾病，同時(shí)被推薦為治療SARS的8種中藥之一，2004年還被推薦為3種抗禽流感的中成藥之一[6，7]。近幾年來(lái)，魚(yú)腥草中大多數(shù)天然活性成分得以開(kāi)發(fā)利用，其中，多糖是魚(yú)腥草的主要有效成分之一。研究結(jié)果表明，魚(yú)腥草多糖具有抗菌、抗病毒、提高機(jī)體免疫力和利尿等作用[8-14]。

目前，魚(yú)腥草多糖的提取主要是對(duì)根部位進(jìn)行，對(duì)魚(yú)腥草葉多糖的研究鮮有報(bào)道；工藝上多采用熱水提取工藝，采用酶法提取的報(bào)道相對(duì)較少。本研究以魚(yú)腥草地上部分（葉）為原料，采用酶法提取魚(yú)腥草葉多糖，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定魚(yú)腥草葉中多糖提取的最佳酶添加量、提取時(shí)間、提取溫度及液料比，并通過(guò)響應(yīng)面分析確定魚(yú)腥草葉中多糖提取的最優(yōu)工藝，從而為魚(yú)腥草多糖有關(guān)產(chǎn)品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

魚(yú)腥草葉：市售，棄去莖，去雜后于55 ℃烘箱中烘干，粉碎，過(guò)60目篩，密封好后置于干燥器中備用。

纖維素酶（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司）；無(wú)水乙醇、濃硫酸、5%苯酚、葡萄糖等均為分析純。

SHZ-Ⅲ循環(huán)水式真空泵（上海一展實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；UV1000紫外分光光度計(jì)（上海奧斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 多糖含量測(cè)定 多糖含量的測(cè)定方法采用的是苯酚-硫酸比色法[15]。精密稱取干燥至恒重的葡萄糖0.010 0 g，加水定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確吸取 0.000、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mL，分別置于10 mL具塞比色管中，補(bǔ)加蒸餾水至2 mL，加入5%苯酚1 mL，混合均勻后快速加入濃硫酸5 mL，搖勻后置于沸水浴中保溫15 min，取出在室溫放置15 min，在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)495 nm波長(zhǎng)處以蒸餾水調(diào)零，測(cè)定各組的吸光度，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

A=0.628 6x+0.003 2

式中，A為吸光度，x為葡萄糖濃度，μg/mL，R2=0.999 2。

1.2.2 魚(yú)腥草葉多糖的提取工藝 工藝流程：魚(yú)腥草葉→清洗→粉碎→除蛋白質(zhì)→酶法提取→離心（上清液）→真空濃縮→4～5倍95%乙醇沉淀過(guò)夜→復(fù)溶。

1.2.3 多糖溶液樣品的處理 用移液管準(zhǔn)確吸取容量瓶中的待測(cè)液1 mL于10 mL具塞比色管中，再加入蒸餾水補(bǔ)至2 mL，5%苯酚溶液1 mL，濃硫酸5 mL，搖勻后置于沸水中15 min，再室溫冷卻15 min，在紫外分光光度計(jì)495 nm處測(cè)定其吸光度，從而可計(jì)算樣品多糖提取量。

式中，C為多糖濃度（μg/mL），V為多糖樣品的測(cè)定體積（mL），N為稀釋倍數(shù)，M為魚(yú)腥草葉的質(zhì)量（g）。

1.2.4 單因素對(duì)多糖提取量的影響 分別稱取1 g原料6份，在液料比為40∶1（mL∶g，下同），酶解時(shí)間120 min和酶添加量1.2%的條件下，分別在30、36、42、48、54、60 ℃恒溫水浴，計(jì)算多糖提取量。分別稱取1 g原料6份，在液料比為40∶1，酶解溫度42 ℃和酶添加量1.2%的條件下，分別提取60、90、120、150、180、210 min，計(jì)算多糖提取量。分別稱取1 g原料6份，在液料比為40∶1，酶解溫度為42 ℃和提取時(shí)間120 min的條件下，酶添加量分別為0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%恒溫水浴，計(jì)算多糖提取量。分別稱取1 g原料6份，在酶解溫度為42 ℃，酶解時(shí)間120 min和酶添加量1.2%的條件下，液料比分別為40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1，計(jì)算多糖提取量。

1.2.5 響應(yīng)面法對(duì)魚(yú)腥草葉多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[16，17]，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法[18]在4因子3水平上對(duì)魚(yú)腥草葉多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，因素與水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解溫度對(duì)多糖提取量的影響 由圖1可知，當(dāng)溫度低于42 ℃時(shí)，魚(yú)腥草葉多糖提取量隨著酶解溫度的升高而顯著增加；當(dāng)溫度高于42 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，魚(yú)腥草葉多糖提取量顯著降低。這是因?yàn)槔w維素酶的作用條件很溫和，是一類具有最適反應(yīng)溫度的物質(zhì)，溫度過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)影響纖維素酶的作用效果，過(guò)低會(huì)抑制酶的催化活性，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶失活，故纖維素酶的最佳酶解溫度為42 ℃。

2.1.2 酶添加量對(duì)多糖提取量的影響 由圖2可知，魚(yú)腥草葉多糖隨著酶添加量的增加而增加；但當(dāng)酶添加量大于1.2%時(shí)，隨著酶添加量增加，多糖提取量沒(méi)有顯著提高，可能是因?yàn)槊笣舛纫呀?jīng)趨于飽和，植物細(xì)胞內(nèi)多糖已基本溶出，繼續(xù)增加纖維素酶用量，對(duì)魚(yú)腥草葉多糖提取量沒(méi)有顯著影響且增加生產(chǎn)成本。根據(jù)這一結(jié)果可知最佳酶添加量為1.2%。

2.1.3 液料比對(duì)多糖提取量的影響 由圖3可知，在液料比從40∶1增加到50∶1的過(guò)程中，魚(yú)腥草葉多糖的提取量顯著增加，在液料比為50∶1時(shí)達(dá)到最高值；但隨著液料比繼續(xù)增大，魚(yú)腥草葉多糖的提取量降低，液料比過(guò)高，形成飽和溶液，不利于多糖物質(zhì)的溶出，并且水用量過(guò)大也不利于后續(xù)濃縮工作，造成能源浪費(fèi)，不能應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。根據(jù)這一結(jié)果確定最佳液料比為50∶1。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)多糖提取量的影響 由圖4可知，魚(yú)腥草葉多糖提取量隨著酶解時(shí)間的增加不斷增大，但當(dāng)酶解時(shí)間大于150 min后，多糖提取量的增加趨于平緩。原因可能是增加酶解時(shí)間到達(dá)一定程度使纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁中的纖維素物質(zhì)已經(jīng)充分酶解，隨著酶解時(shí)間的增加，對(duì)多糖的提取量影響不大，反而會(huì)對(duì)資源造成浪費(fèi)，間接增加生產(chǎn)成本。根據(jù)這一結(jié)果，確定最佳酶解時(shí)間為150 min。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 方差分析 根據(jù)表1的試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了29次試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，使用Design Expert 8.0版軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出，該模型的P<0.000 1，說(shuō)明模型極其顯著。失擬項(xiàng)P=0.793 5﹥0.05不顯著，失擬項(xiàng)表示模型的模擬和實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果的吻合度，不顯著說(shuō)明了該模型的模擬還是很精確的。根據(jù)回歸系數(shù)，得到魚(yú)腥草葉多糖提取量的二次多元回歸方程為：

Y=31.63+0.54A-2.53B-1.48C+3.14D+1.91AB+3.21AC-1.57AD+0.30BC-0.93BD-1.39CD-3.03A2-2.87B2-3.25C2-4.58D2

由回歸模型的校正確定系數(shù)R2Adj=0.980 8，可知該模型擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小；由各響應(yīng)性狀的相關(guān)系數(shù)R2=0.990 4可知，預(yù)測(cè)值和真實(shí)值之間具有高度的相關(guān)性；變異系數(shù)（CV）表示試驗(yàn)的精確度，CV值越大，試驗(yàn)的可靠性越低，此試驗(yàn)CV=2.29%，較低，說(shuō)明試驗(yàn)操作可靠。綜合以上分析，該模型與實(shí)際情況擬合很好，可以用于評(píng)價(jià)魚(yú)腥草葉多糖提取量的實(shí)際情況。由方差分析結(jié)果可知，研究范圍內(nèi)的4個(gè)因素對(duì)提取量影響的先后順序?yàn)橐毫媳?gt;酶解溫度>酶解時(shí)間>酶添加量。

2.2.2 響應(yīng)面分析 圖5至圖9表明了纖維素酶法提取魚(yú)腥草葉多糖工藝中4個(gè)因素之間交互作用對(duì)多糖提取量的影響。圖5為酶添加量和酶解溫度的交互作用，當(dāng)溫度一定時(shí)，魚(yú)腥草葉多糖提取量隨著酶添加量的增加先增加后下降；當(dāng)酶添加量不變時(shí)，隨著溫度的升高，多糖提取量也呈現(xiàn)出了先增加后下降的趨勢(shì)，表明酶添加量、酶解溫度過(guò)高過(guò)低都不利于魚(yú)腥草葉多糖的提取。等高線延酶解溫度方向的軸向比酶添加量軸向密集，說(shuō)明酶解溫度對(duì)多糖提取量的影響比酶添加量的影響大。圖6為酶添加量和酶解時(shí)間的交互作用，當(dāng)酶添加量一定時(shí)，隨著酶解時(shí)間的增加，多糖提取量呈現(xiàn)先緩慢增加后急劇下降的趨勢(shì)，但酶解時(shí)間一定時(shí)，隨著酶添加量的增加，多糖提取量的也是先增加后下降，但是變化幅度不大，酶添加量和酶解時(shí)間的交互作用顯著，酶解時(shí)間曲線較陡，酶添加量的曲線相對(duì)較平緩，說(shuō)明酶解時(shí)間對(duì)多糖提取量的影響比酶添加量的影響大。圖7為酶添加量和液料比的交互作用，當(dāng)酶添加量處于較低位置時(shí)，隨著液料比的增加，多糖提取量顯著增加后呈下降趨勢(shì)；當(dāng)酶添加量處于中位置時(shí)，隨著液料比的增加，多糖提取量也是先增加后趨于不變；當(dāng)酶添加量處于高位置時(shí)，隨著液料比的增加，多糖提取量先增加后下降，液料比一定時(shí)，多糖提取量隨著酶添加量變化而變化的趨勢(shì)同上。但液料比的變化曲線高于酶添加量的變化曲線，說(shuō)明液料比對(duì)多糖提取量的影響比酶添加量的影響大。圖8為酶解溫度和液料比的交互作用，當(dāng)酶解溫度一定時(shí)，隨著液料比的增加，多糖提取量顯著增大，到48 ℃左右時(shí)呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)；當(dāng)液料比一定時(shí)，隨著酶解溫度的增加，多糖提取量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是由于溫度過(guò)高降低了酶活性，從而影響了多糖提取量。液料比曲線較陡，酶解溫度曲線較平緩，且液料比曲線延展高度明顯高于酶解溫度曲線，說(shuō)明說(shuō)明液料比對(duì)多糖提取量的影響比酶解溫度的影響大。圖9為酶解時(shí)間和液料比的交互作用，當(dāng)酶解溫度一定時(shí)，隨著液料比的增加，多糖提取量顯著增大，到48 ℃左右時(shí)呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)；當(dāng)液料比在低位置時(shí)，隨著酶解溫度的增加，多糖提取量先緩慢增大后又緩慢下降；當(dāng)液料比在中高位置時(shí)，隨著酶解溫度的增加，多糖提取量先基本不變?cè)俪示徛陆?，等高線沿液料比方向的軸向比酶解時(shí)間軸向密集，說(shuō)明液料比對(duì)多糖提取量的影響比酶解時(shí)間的影響大。對(duì)上述二次多項(xiàng)式方程求偏導(dǎo)得到最佳提取條件為酶添加量為0.89%，提取溫度為30.85 ℃，提取時(shí)間為173.7 min，液料比為51.8∶1。理論最佳提取量為33.21 mg/g。

為了驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，將得到的最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證，考慮到試驗(yàn)的可操作性，以酶添加量為0.9%，提取溫度31 ℃，提取時(shí)間174 min，液料比52∶1，在此最佳條件下，纖維素酶法提取魚(yú)腥草葉多糖的提取量為32.95 mg/g，與理論最大值33.21 mg/g基本相符，因此采用響應(yīng)面法得到的魚(yú)腥草葉多糖提取工藝具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究采用了纖維素酶酶解法提取魚(yú)腥草葉多糖，纖維素酶可破碎細(xì)胞壁從而使多糖物質(zhì)得到充分提取，從而顯著提高了魚(yú)腥草葉多糖提取量。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)該酶法提取過(guò)程中的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了合理有效的提取量與酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、液料比的數(shù)學(xué)模型，同時(shí)該模型能較好地預(yù)測(cè)多糖的提取量。應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的酶法提取魚(yú)腥草葉多糖的最佳提取工藝條件為：纖維素酶添加量0.9%，提取溫度31 ℃，提取時(shí)間174 min，液料比52∶1，此時(shí)多糖提取量為32.95 mg/g，與模型驗(yàn)證的提取量33.21 mg/g接近，說(shuō)明響應(yīng)面法能較好地用于魚(yú)腥草葉多糖提取工藝的優(yōu)化，可為多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究及多糖類產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

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