四唑染色法快速測定茄子種子生活力的研究

摘要：根據(jù)四唑（2，3，5-Triphenyl tetrazolium chloride，TTC）染色法測定種子生活力的原理，研究不同濃度四唑溶液、不同染色溫度和不同染色時間對茄子（Solanum melongena L.）種子生活力的影響，探索測定茄子種子生活力的最佳條件。結(jié)果表明，四唑溶液濃度、染色溫度、染色時間三者之間存在一定的相關(guān)性，通過改變?nèi)咧械囊徽呋騼烧呖梢赃_到改變其他兩者或一者的目的，因此，可根據(jù)實際需要來確定測定條件。在比較四唑染色法測定茄子種子生活力的不同條件后，認為處理組合11（浸種溫度20 ℃、浸種時間18 h、染色液濃度1.0%、染色溫度35 ℃、染色時間18 h）為最理想的處理組合，是TTC法快速測定茄子種子生活力的適宜方法。

關(guān)鍵詞：茄子（Solanum melongena L.）；種子；生活力；四唑染色法

中圖分類號：S641.1+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）10-2572-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.030

Abstract： Based on the principle of tetrazolium （2，3，5-Triphenyl tetrazolium chloride， abbreviation TTC） staining method for determination of seed viability，the effects of concentration of tetrazolium solution， staining temperature and staining time on seed viability of early-maturity eggplant （Solanum melongena L.） were studied to figure out the optimum conditions for determination of eggplant seed viability. The results showed that there was a certain correlation among the concentration of tetrazolium solution， staining temperature and staining time，by changing one or two factors of the three can achieve the purpose of changing the other two or one factor，therefore，it’s possible to determine the optimum conditions according to actual need. After comparing the different combinations of conditions of TTC method for testing early-maturity eggplant seed viability，it was concluded that processing combination 11（soaking seeds in water at 20 ℃ for 18 h，concentration of the tetrazolium solution at 1.0%，staining at 35 ℃ for 18 h） is the optimum processing combination， thus suitable for rapid determination of early-maturity eggplant seed viability.

Key words： eggplant（Solanum melongena L.）； seed； viability； tetrazolium staining

茄子（Solanum melongena L.）起源于印度、緬甸及鄰近地區(qū)，古稱酪酥、昆侖瓜等。其產(chǎn)量高、適應性強、結(jié)果期長，現(xiàn)在全世界都有分布，以亞洲面積最大[1]。中國是世界上最大的茄子生產(chǎn)國[2]，茄子栽培面積達73.67萬hm2，占世界總面積的49.16%[3]。茄子種植區(qū)域廣，種子用量大，但是休眠現(xiàn)象比較普遍[4]。如何快速測定茄子種子的生活力、確定茄子種子的最大發(fā)芽潛力、評定種子質(zhì)量、為種子生產(chǎn)和銷售提供參考依據(jù)等就成為當前休眠茄子種子急需解決的主要問題。種子生活力的快速測定法主要有四唑（2，3，5-氯化三苯基四氮唑；2，3，5-Triphenyl tetrazolium chloride，TTC）染色法、溴麝香草酚蘭（BTB）法和紫外熒光法等，其中以TTC染色法應用最廣。其原理為有生活力的種子胚細胞含有脫氫酶，具有脫氫還原作用，被種子所吸收的無色TTC接受了活種子呼吸過程中脫氫酶產(chǎn)生的氫，而變成還原態(tài)的紅色穩(wěn)定不擴散物質(zhì)[5]，即不溶于水的三苯基甲腙（TTF），而無生活力的種子則無此反應，故無染色出現(xiàn)，由此可按胚組織的染色情況區(qū)分有生活力的種子和無生活力的種子[6]?，F(xiàn)在國際種子檢驗規(guī)程（International Rules for Seed Testing）已成為農(nóng)業(yè)、園藝和林木的部分種子種類及應用范圍內(nèi)各類種子的鑒定標準[7]，但迄今為止工作比較集中于木本植物及麥類、豆類、玉米、棉花等大田農(nóng)作物種子；對蔬菜而言，除番茄屬作物外，其他蔬菜種子鑒定尚未列入此檢驗規(guī)程鑒定范圍。TTC測定技術(shù)在國內(nèi)農(nóng)林生產(chǎn)上尚未普遍應用，相關(guān)研究和報道極為匱乏。綜合現(xiàn)有的有關(guān)資料，農(nóng)作物種子生活力相關(guān)研究較多，但也只是局限于水稻[8]、小麥[9]、玉米[10]等糧食作物；而蔬菜種子生活力測定方法的研究極少，僅在番茄[11]、苦瓜[12]、冬瓜[13]等方面有部分報道。由于四唑染色法測定茄子種子生活力的試驗前人涉及較少，到目前為止，茄子種子生活力的具體鑒定標準和茄子種子四唑染色圖譜尚未見報道。為此，試驗以茄子種子為材料，采用TTC法測定茄子種子的生活力，比較快速預測茄子種子最大發(fā)芽潛力的適宜方法，探索茄子種子生活力四唑測定值與發(fā)芽率之間的數(shù)量關(guān)系，評價TTC法用于茄子種子生活力預測的可行性，從而為茄子種子生產(chǎn)和銷售提供參考依據(jù)，并為茄子種子生活力TTC測定法早日列入國家農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程和國際種子檢驗規(guī)程奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種子材料 參試茄子品種為早熟京茄1號（S. melongena cv.Jing Qie No.1），2014年9月新采收，由北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心提供。

1.1.2 儀器和藥品 儀器主要有發(fā)芽箱、發(fā)芽盒（透光）、恒溫培養(yǎng)箱（20、30、35 ℃各1個）、培養(yǎng)皿、鑷子、解剖刀、解剖針、標簽紙、濾紙、量筒、燒杯、容量瓶（100 mL）、棕色瓶、體視顯微鏡等。藥品四唑粉劑由日本東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn)，KH2PO4、Na2HPO4、Na2HPO4·2H2O等均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)芽試驗 對供試早熟京茄1號種子經(jīng)凈度分析之后，隨機選取100粒種子，4個重復，在發(fā)芽箱內(nèi)（20 ℃、16 h黑暗，30 ℃、8 h光照）進行紙上發(fā)芽試驗[14]，7 d初數(shù)，14 d終數(shù)，統(tǒng)計發(fā)芽率。

發(fā)芽率=（各重復發(fā)芽種子之和）/400×100%

1.2.2 TTC溶液的配制 ① 磷酸緩沖液的配制[14]。溶液Ⅰ：精確稱取9.078 g KH2PO4溶解于1 000 mL去離子水中；溶液Ⅱ：精確稱取9.472 g Na2HPO4或11.876 g Na2HPO4·2H2O溶解于1 000 mL去離子水中。然后取溶液Ⅰ2份和溶液Ⅱ3份混合即成。② 不同濃度TTC溶液配制[14]。1.0%TTC溶液：稱取1 g四唑粉劑溶解于100 mL磷酸緩沖液中。0.2%濃度TTC溶液：量取1份配好的1.0%濃度TTC溶液，加入4份磷酸緩沖液混合均勻。

1.2.3 種子浸泡、染色 對早熟京茄1號種子經(jīng)凈度分析之后，隨機數(shù)取100粒種子，4個重復。在20 ℃恒溫浸種18 h或在30 ℃恒溫浸種4 h，浸種結(jié)束后，取出種子，用濾紙吸干種子表面水分，快速人工去皮后進行避光染色。分別選用0.2%、1.0% 2種濃度的四唑染色液，在30、35 ℃恒溫條件下分別進行不同時間（1、18、36 h）染色，最后分別統(tǒng)計各處理組合的染色結(jié)果，即著色種子數(shù)目；試驗設置的處理組合見表1。

1.2.4 顯微觀察 種子經(jīng)染色后，統(tǒng)計每處理種子著色情況，選取每處理有代表性的著色種子進行縱切，在體視顯微鏡下觀察種子的切面染色效果，區(qū)分種子胚各部分的著色情況，辨別種子的生活力。需要注意的是種子經(jīng)染色和處理后，進行正確的觀察鑒定十分必要。一般鑒定原則是：凡是胚的主要構(gòu)造及有關(guān)活營養(yǎng)組織染成有光澤的鮮紅色、且組織狀態(tài)正常的為有生活力的種子；凡是胚的主要構(gòu)造局部不染色或染成異常的顏色和光澤、并且活營養(yǎng)組織不染色部分已超過1/2、或超過容許范圍以及組織軟化的、完全不染色或染成無光澤的淡紅色或灰白色、且組織已軟化腐爛或異常、蟲蛀、損傷的均為無生活力種子[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2007軟件處理、制表，利用IBM SPSS Statistics 20程序進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽情況

試驗觀察到的早熟京茄1號種子4次重復發(fā)芽數(shù)目分別為91、95、94、92粒，由此計算發(fā)芽率，

發(fā)芽率=（91+95+94+92）/400×100%=93%。

2.2 TTC染色法對茄子種子著色效果的影響

試驗設置的不同浸種溫度、不同浸種時間，不同染色液濃度、不同染色溫度、不同染色時間處理組合的茄子種子染色情況見表2。從表2中各處理組合著色種子數(shù)目及分析結(jié)果可以看出，當染色時間為1 h（見處理組合1、4、7、10、13、16、19、22），茄子種子染色效果很差，大多數(shù)種子沒有著色，只有少數(shù)種子有輕微的著色。

當浸種溫度為20 ℃、浸種時間為18 h、染色溫度較低（30 ℃）時，隨染色時間延長，著色種子數(shù)目增多，染色效果增強；而染色溫度較高（35 ℃）時卻發(fā)現(xiàn)在染色液較高濃度（1.0%）時，染色時間為36 h的處理染色效果不及染色時間為18 h處理的染色效果，著色種子數(shù)目減少，但相互之間沒有極顯著差異（P>0.01）。對應比較處理組合5、6和處理組合2、3以及處理組合11、12和處理組合8、9，可以發(fā)現(xiàn)，在染色溫度相同時，染色液濃度較高（1.0%）則著色種子數(shù)目顯著增多，種子染色效果有明顯的優(yōu)勢；對應比較處理組合8、9和處理組合2、3以及處理組合11、12和處理組合5、6卻發(fā)現(xiàn)，在染色液濃度相同時，染色溫度（35 ℃）較高有利于種子著色，著色種子數(shù)目增多。其中處理組合11著色種子數(shù)目最多，說明浸種溫度為20 ℃、浸種時間18 h、染色液濃度較高（1.0%）、染色溫度較高（35 ℃）、染色時間為18 h有利于茄子種子著色。

當浸種溫度為30 ℃、浸種時間為4 h、染色溫度相同（30 ℃或35 ℃）時，染色液濃度較高（1.0%）的處理種子著色具有明顯的優(yōu)勢，即對應比較處理組合17、18和處理組合14、15以及處理組合23、24和處理組合20、21，發(fā)現(xiàn)種子著色效果均有明顯的差異，且相互之間達到極顯著差異水平（P<0.01）。當染色液濃度相同且較低（0.2%）時，不同染色溫度處理下著色種子數(shù)目沒有極顯著差異（P>0.01）；染色液濃度較高（1.0%）、染色溫度較低（30 ℃）時，隨著染色時間的延長，著色種子數(shù)目增加，且達到極顯著差異水平（P<0.01）；而染色溫度較高（35 ℃）時，隨著染色時間的延長，著色種子數(shù)目反而有下降的趨勢，說明在染色液濃度（1.0%）較高時，染色溫度（35 ℃）較高同時染色時間（36 h）較長不利于種子著色，反而會降低種子的染色效果。

2.3 顯微觀察情況

將著色種子縱切、在顯微鏡下觀察種子切面染色情況；由于在試驗過程中處理組合1、4、7、10、13、16、19、22的著色種子數(shù)目均少于50粒，且染色程度很淺，故沒有進行縱切和在顯微鏡下觀察種子切面胚各部分的染色情況。

其余的各處理組合均選取了具有代表性的著色較為清晰的種子，縱切后在體視顯微鏡下觀察種子的切面染色效果，以區(qū)分種子胚各部分的著色情況，從而辨別種子的生活力。處理組合2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24的種子切面染色結(jié)果分別見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12、圖13、圖14、圖15、圖16。從上面這些著色種子縱切面在顯微鏡下觀察采集的圖像可以發(fā)現(xiàn)，圖4（處理組合6）、圖7（處理組合11）、圖8（處理組合12）、圖12（處理組合18）、圖13（處理組合20）、圖14（處理組合21）的染色情況較為清晰。再結(jié)合表2中各處理組合的著色種子數(shù)目及方差分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)圖13和圖14雖然較為清晰，但其處理組合20和21著色種子數(shù)目僅有72±3粒和68±3粒，均沒有反映出供試材料的實際生活力情況，故處理組合20和21不適合茄子種子生活力測定的最佳條件；而圖4（處理組合6）、圖7（處理組合11）、圖8（處理組合12）、圖12（處理組合18）的著色種子數(shù)目分別為91±2、97±3、94±4、92±2粒，相互之間也沒有出現(xiàn)極顯著差異（P>0.01），其中處理組合11著色種子數(shù)目最多，為97粒，且染色時間較短，為18 h，其余3個處理組合染色時間均為36 h，考慮染色時間對試驗周期的影響，故選擇處理組合11作為TTC法快速測定茄子種子生活力的理想處理組合。

3 小結(jié)與討論

采用TTC法測定種子的生活力，在染色前的準備階段，國際種子檢驗規(guī)程中規(guī)定茄科番茄屬的番茄種子需要將種子縱切為兩半，以方便觀察切面的染色情況。而茄子種子體型較小，種皮表面光滑，不易切開。試驗經(jīng)過多次探索，發(fā)現(xiàn)用解剖刀在浸種后快速人工去皮、并在適宜的條件下染色，則效果較好。在茄子種子經(jīng)剝皮染色之后，及時統(tǒng)計每組種子著色情況，選取每組有代表性的著色種子進行縱切，則此時縱切較易操作，接著在體視顯微鏡下觀察種子的切面染色效果，區(qū)分種子胚各部分的著色效果，就可辨別種子是否具有生活力。

通過試驗發(fā)現(xiàn)，在種子染色階段，染色時間1 h過短，不適于茄子種子的生活力測定。這很可能是由于染色時間過短，活種子呼吸過程中脫氫酶產(chǎn)生的氫非常有限，來不及與四唑染色液充分反應造成的。若是染色液濃度（1.0%）較高、染色溫度（35 ℃）較高、染色時間延長，則均有利于茄子種子的生活力測定。但在較高的染色液濃度時，染色溫度較高，同時染色時間（36 h）過長，則茄子種子的染色效果反而下降，這可能是由于種子長時間處于較高的染色溫度條件下內(nèi)部某些物質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞、導致種子生活力下降引起的。

試驗得到的TTC法快速測定茄子種子生活力的理想處理組合為處理組合11，其著色種子數(shù)目最多，為97粒，且染色時間較短，為18 h，其余條件是浸種溫度20 ℃、浸種時間18 h、染色液濃度1.0%、染色溫度35 ℃。

不過在試驗中普遍存在的問題是茄子種子著色程度深淺不勻，有些種子著色太淺，不能清晰地觀察種子胚各部分的染色情況；有些種子著色又太深，甚至全部被染成深褐色，也無法準確判斷種子胚各部分的生活力情況。這可能與種子本身的生活力強弱程度、染色液濃度及染色時間等因素有關(guān)。

由于本試驗為探索性工作，雖然得出的結(jié)論是在各種不同處理組合條件下最為理想的處理組合，有一定的說服力和科學性。但若想獲得TTC法快速測定茄子種子生活力更加適宜的條件參數(shù)，還需要設計更多的影響因素處理組合，如增加不同浸種溫度、時間組合，設計更多的染色液濃度梯度，增加更多的不同染色時間及染色溫度的處理組合，并選用不同的茄子品種等，從而提高快速測定茄子種子生活力方法的可信度。

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