降解多菌靈木霉Tr1原生質(zhì)體制備及再生條件研究

摘要：研究可降解多菌靈的木霉菌株Tr1的原生質(zhì)體制備及再生的適宜條件，發(fā)現(xiàn)該菌原生質(zhì)體制備的最佳條件為菌齡20 h，裂解酶液為5 mg/mL的溶菌酶和蝸牛酶的混合酶液，二者使用前按照體積比2∶1混合，酶解溫度30 ℃，50 r/min緩慢振蕩酶解2.5 h，滲透壓穩(wěn)定劑為0.7 mol/L KCl，原生質(zhì)體產(chǎn)量達6.44×106個/mL。原生質(zhì)體再生的優(yōu)化條件為：PDA為培養(yǎng)基，添加0.3 mol/L KCl和0.3 mol/L環(huán)己六醇作為滲透壓穩(wěn)定劑，采用雙層固體培養(yǎng)方式，有助于原生質(zhì)體的再生。

關(guān)鍵詞：多菌靈；木霉；原生質(zhì)體；制備；再生

中圖分類號：Q939.96 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）10-2500-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.014

Abstract：The suitable preparation and regeneration conditions of protoplast preparation of Trichoderma sp. Tr1 was studied. The results showed the optimum condition for preparation of protoplast of strain Tr1：The culture time of mycelium was 20 h， the protoplast lysate was a mixed solution of 5 mg/mL lysozyme and 5 mg/mL snail enzyme and they would be mixed according to the volume ratio of 2∶1 before using， it was mildly shaked with a speed of 50 r/min under 30 ℃ for 2.5 h， 0.7 mol/L KCl was used as osmotic stabilizer. Under this condition， the yield of protoplast could be 6.44×106/mL. The optimum condition for regeneration of protoplast was PDA as the basic culture medium，0.3 mol/L KCl and 0.3 mol/L inositol as the osmotic stabilizer， and double-layer solid culture was helpful for protoplast regeneration of Trichoderma sp. Tr1.

Key words： carbendazim； Trichderma sp.； protoplast； preparaton； regeneration

多菌靈（Carbendazim，MBC）是一種高效廣譜的苯并咪唑類殺菌劑，其廣泛使用給生態(tài)環(huán)境和人體健康造成了危害[1]。為解決多菌靈農(nóng)殘污染問題，人們開始研究多菌靈降解菌株，目前報道的降解菌株多為細菌，如紅平紅球菌、假單胞菌等[2，3]。雖然部分菌株對多菌靈的降解效率較高，但由于菌株本身對植物病原菌沒有拮抗作用，功能單一且制劑保存期短，市場應(yīng)用前景受到限制。

木霉菌是一類重要的植物病生防菌，研究和應(yīng)用廣泛[4]。但多數(shù)木霉菌株對多菌靈敏感，因此多菌靈在土壤中的殘留影響了木霉的生防效果。篩選和選育降解多菌靈的生防木霉菌，將實現(xiàn)生防和降解農(nóng)殘功能的有機結(jié)合。2008年田連生等[5]首次報道一株木霉對多菌靈有一定的降解能力。前期試驗篩選到一株可降解多菌靈的生防木霉，但降解效率低。應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)是目前得到優(yōu)良菌種的有效方法之一，原生質(zhì)體沒有細胞壁，對誘變劑反應(yīng)靈敏，容易得到正突變株[6，7]。因此利用原生質(zhì)體融合技術(shù)對哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和其他對多菌靈敏感的木霉生防菌株進行種間雜交，有望選育出對多菌靈高效降解的生防木霉菌株。本研究對可降解多菌靈的哈茨木霉Tr1原生質(zhì)體的制備條件進行了研究，為新菌種的選育奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

哈茨木霉Tr1為山東省應(yīng)用微生物重點實驗室分離獲得，對多菌靈具有一定的降解作用，同時對部分植物病原真菌具有一定的抑菌效果。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂10 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

無機鹽培養(yǎng)基：NH4NO3 1.0 g，NaCl 1.0 g，K2HPO4 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，瓊脂10 g，蒸餾水 1 000 mL，多菌靈（100 mg/mL）10 mL。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，蛋白胨0.4 g，酵母膏0.4 g，KH2PO4 0.2 g，K2HPO4 0.4 g，MgSO4·7H2O 0.005 g，pH 6.2～6.4。

STC培養(yǎng)液：0.6 mol/L山梨糖醇，0.01 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L CaCl2，pH 7.5。

原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基：培養(yǎng)基A，馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，0.3 mol/L KCl，0.3 mol/L環(huán)己六醇；培養(yǎng)基B，馬鈴薯 200 g，蔗糖10 g，0.3 mol/L KCl， 0.3 mol/L環(huán)己六醇；培養(yǎng)基C，馬鈴薯 200 g，葡萄糖10 g，0.6 mol/L KCl；培養(yǎng)基D，馬鈴薯 200 g，葡萄糖10 g，0.6 mol/L環(huán)己六醇；培養(yǎng)基E，馬鈴薯 200 g，蔗糖10 g，0.6 mol/L KCl；培養(yǎng)基F，馬鈴薯 200 g，蔗糖10 g，0.6 mol/L環(huán)己六醇。

1.3 試劑

酶：利用滲透壓緩沖液分別配制濃度為5 mg/mL的蝸牛酶、纖維素酶和溶菌酶，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

滲透壓緩沖液：0.7 mol/L KCl，0.1 mol/L PBS，pH 5.8。

1.4 菌絲的制備

在多菌靈為惟一碳源的無機鹽平板上培養(yǎng)哈茨木霉Tr1 5～7 d，用無菌水洗下孢子，配成1×107個/mL的孢子懸浮液，按照1%的接種量接種到PD培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)8～24 h。

1.5 原生質(zhì)體的制備

取搖床培養(yǎng)好的哈茨木霉菌絲培養(yǎng)液，用3層無菌紗布過濾收集菌絲體，用去離子水沖洗3次，用滲透壓緩沖液沖洗至菌絲呈半透明狀，收集菌絲并稱重。按照一定的比例加入新配制好的酶液，30 ℃、50 r/min緩慢搖床培養(yǎng)，定期鏡檢，發(fā)現(xiàn)有大量原生質(zhì)體形成后，用3層無菌擦鏡紙過濾菌絲，用滲透壓穩(wěn)定劑沖洗3次，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集原生質(zhì)體，利用STC洗滌原生質(zhì)體3次，最后懸浮于STC培養(yǎng)液中，原生質(zhì)體濃度調(diào)整為1×106個/mL。

1.6 不同因素對原生質(zhì)體形成的影響

1.6.1 菌絲培養(yǎng)時間對原生質(zhì)體形成的影響 將活化后的木霉Tr1分生孢子接入PD培養(yǎng)液中，分別培養(yǎng)12、16、20、24、28、32、36、40 h，然后稱取50 mg菌絲，加入1 mL酶液，充分混勻，30 ℃振蕩酶解2.5 h，比較原生質(zhì)體形成情況。

1.6.2 最佳酶系統(tǒng)的確定 分別設(shè)置不同的酶濃度和酶組分，取1 mL酶液加入到50 mg菌絲中，充分混勻，30 ℃、50 r/min緩慢搖床培養(yǎng)2 h，制備原生質(zhì)體，鏡檢觀察，計算原生質(zhì)體產(chǎn)量，確定最佳酶組合。

1.6.3 酶解時間、溫度、pH對原生質(zhì)體形成的影響 1 mL酶液對50 mg菌絲進行酶解，分別進行酶解時間、溫度和pH的單因素試驗，鏡檢比較原生質(zhì)體的形成情況。酶解時間設(shè)為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h；酶解溫度設(shè)置為20、25、30、35、40 ℃；pH設(shè)置為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0。

1.6.4 滲透壓緩沖液對原生質(zhì)體形成的影響 分別以0.7 mol/L甘露醇、蔗糖、MgSO4、NaCl替代滲透壓緩沖液中0.7 mol/L KCl作為穩(wěn)定劑，用上述不同滲透壓緩沖液配制酶液進行原生質(zhì)體的制備，30 ℃酶解2 h后制備原生質(zhì)體，鏡檢比較原生質(zhì)體的形成情況。

1.7 原生質(zhì)體的再生

1.7.1 再生培養(yǎng)基的選擇 取制備好的木霉Tr1原生質(zhì)體懸浮液1 mL與不同的再生培養(yǎng)基輕輕混合，培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計不同再生培養(yǎng)基的再生菌落數(shù)。

1.7.2 再生方式選擇 A：單層平板培養(yǎng)，將制備的原生質(zhì)體懸浮液適當(dāng)稀釋后吸取1 mL與冷卻至40 ℃左右的再生培養(yǎng)基輕輕混合倒入平板，培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計再生菌落數(shù)。B：先在培養(yǎng)皿底部鋪上一層PDA培養(yǎng)基，將制備的原生質(zhì)體懸浮液適當(dāng)稀釋后吸取50 μL與冷卻至40 ℃左右的再生培養(yǎng)基輕輕混合，倒入上述平板，培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計再生菌落數(shù)。

1.8 原生質(zhì)體滅活

1.8.1 木霉Tr1原生質(zhì)體的熱滅活 取一定濃度的木霉Tr1原生質(zhì)體懸浮液（1×106個/mL）分別置于50、55、60、65 ℃恒溫水浴箱中進行熱滅活，同一溫度分別于滅活時間5、10、15、20、25、30 min各取出等量原生質(zhì)體懸液進行再生培養(yǎng)，以未進行熱滅活的原生質(zhì)體為對照。

1.8.2 木霉Tr1原生質(zhì)體的紫外滅活 取一定濃度的木霉Tr1原生質(zhì)體懸浮液（1×106個/mL）等量于無菌培養(yǎng)皿中，分別與15 W紫外燈距離5、10、15、20 cm處照射5 min，各取出等量原生質(zhì)體懸浮液進行再生培養(yǎng)，以未進行紫外滅活的原生質(zhì)體為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的制備

2.1.1 菌絲培養(yǎng)時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 以溶菌酶和蝸牛酶的混合酶為酶系統(tǒng)，30 ℃處理不同時間段的木霉菌絲細胞壁2.5 h，試驗結(jié)果見圖1。由圖1可知，木霉菌絲培養(yǎng)20 h后，原生質(zhì)體制備的量最多，達到了6.45×106個/mL。因此，在后續(xù)試驗中，選擇培養(yǎng)20 h的木霉菌絲進行原生質(zhì)體的制備。

2.1.2 不同酶系統(tǒng)對木霉Tr1原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 原生質(zhì)體釋放的關(guān)鍵因素之一就是酶系統(tǒng)的選擇，不同屬真菌的細胞壁因其化學(xué)組分不同，對其破壁所需的酶系統(tǒng)要求也存在差異。本試驗采用不同酶組合對培養(yǎng)20 h的菌絲體進行處理，結(jié)果見表1。

由表1可知，單一的溶菌酶和蝸牛酶或者相互之間組合后的混合酶來對木霉菌絲進行破壁處理，均可產(chǎn)生一定的原生質(zhì)體，其中效果最好的為溶菌酶和蝸牛酶組合后的混合酶，由該混合體系處理木霉細胞壁，其原生質(zhì)體產(chǎn)量達到了6.35×106個/mL。因此在后續(xù)試驗中均采用此酶組合。

2.1.3 酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 以溶菌酶和蝸牛酶組合的混合酶系處理木霉細胞壁，隨著酶解時間的延長，原生質(zhì)體的產(chǎn)量逐漸增加，酶解2.5 h時，原生質(zhì)體產(chǎn)量達到最大（6.53×106個/mL）（圖2），其后原生質(zhì)體產(chǎn)量下降，因此后續(xù)試驗確定2.5 h為最佳酶解時間。

2.1.4 酶解溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 酶解過程中所用的溫度分別為20、25、30、35、40 ℃，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著酶解溫度的增加，原生質(zhì)體的產(chǎn)量逐漸增加，酶解溫度為30 ℃時，原生質(zhì)體產(chǎn)量最大，達到了6.51×106個/mL。其后，隨著溫度的升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量下降，說明30 ℃是溶菌酶和蝸牛酶混合后共同作用于木霉細胞壁的最佳溫度。

2.1.5 滲透壓緩沖液pH對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 以0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液為緩沖體系，檢測不同緩沖液的pH對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，pH 6.0時，酶的活性較高，對木霉細胞壁處理較好，原生質(zhì)體產(chǎn)量達到了6.48×106個/mL，本試驗最初選擇pH 5.8的磷酸鹽緩沖液配制滲透壓緩沖液，因此在后續(xù)的試驗中緩沖液pH均為5.8。

2.1.6 滲透壓緩沖液對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響 滲透壓穩(wěn)定劑在維持原生質(zhì)體內(nèi)外環(huán)境滲透壓的穩(wěn)定性方面起著至關(guān)重要的作用。本試驗分別以0.7 mol/L甘露醇、蔗糖、MgSO4、NaCl替代滲透壓緩沖液中0.7 mol/L KCl作為穩(wěn)定劑，處理木霉菌絲2.5 h，結(jié)果見圖5。由圖5可知，分別以甘露醇和KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑時，木霉Tr1原生質(zhì)體的產(chǎn)量都超過了6.44×106個/mL，二者在0.05水平上差異不顯著。一般認(rèn)為，原生質(zhì)體制備時無機鹽作為高滲穩(wěn)定劑的效果較好，本研究發(fā)現(xiàn)甘露醇和KCl兩者之間差異不顯著，但因為有機物較無機鹽成分復(fù)雜，因此在后續(xù)的試驗中，主要以KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑。

2.2 原生質(zhì)體的再生

對于木霉原生質(zhì)體融合育種，重要的一環(huán)是必須使原生質(zhì)體再生成具有細胞壁的細胞，這樣才能對產(chǎn)生的融合子進行遺傳鑒別、篩選和利用。綜合已發(fā)表的文獻，將稀釋后的原生質(zhì)體懸浮液分別涂布到6種再生培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后統(tǒng)計再生菌落數(shù)，結(jié)果見圖6。由圖6可知，在PDA培養(yǎng)基中添加0.3 mol/L KCl和0.3 mol/L環(huán)己六醇，有利于木霉Tr1原生質(zhì)體的再生。試驗中發(fā)現(xiàn)木霉Tr1在單層平板培養(yǎng)基和雙層固體平板培養(yǎng)基上均可以長出菌落，但在雙層培養(yǎng)基上更容易長出菌落，且長的菌落比較均勻，該再生方式同王升星等[8]的報道結(jié)果相同。

3 小結(jié)與討論

原生質(zhì)體的制備是絲狀真菌融合或轉(zhuǎn)化的一個關(guān)鍵點，要制備數(shù)量較多且質(zhì)量較高的原生質(zhì)體，需要對不同菌株的菌絲進行合適的處理才可以形成大量的原生質(zhì)體[9]。本研究對分離篩選到的多菌靈降解木霉Tr1進行原生質(zhì)體制備條件的研究，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的木霉菌絲如果菌齡過長，則菌絲細胞壁老化而增厚，不利于原生質(zhì)體的釋放；而菌齡較短，則菌絲容易斷裂，釋放的原生質(zhì)體較少。本研究中培養(yǎng)20 h的木霉菌絲，生長旺盛，菌絲量比較多，適于制備大量的原生質(zhì)體。因此，針對多菌靈降解木霉Tr1，選擇培養(yǎng)20 h的木霉菌絲進行原生質(zhì)體的制備。

本研究中對影響木霉Tr1原生質(zhì)體制備的因素進行分析，得出其原生質(zhì)體制備的最適條件：在菌絲體培養(yǎng)20 h的基礎(chǔ)上，分別用5 mg/mL的溶菌酶和蝸牛酶按照體積比2∶1混合， pH 5.5～6.5，按照菌絲重量與酶液體積比（50∶1，mg∶mL）處理菌絲，50 r/min緩慢振蕩，30 ℃酶解菌絲2.5 h，以0.7 mol/L KCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，在上述條件下，原生質(zhì)體產(chǎn)量達6.44×106個/mL。王升星等[8]建議酶解前用巰基乙醇處理木霉菌絲，可增加菌絲對酶處理的敏感性，本研究中曾用巰基乙醇處理，發(fā)現(xiàn)意義不大，推測培養(yǎng)20 h的菌絲完全適合原生質(zhì)體的制備。對木霉Tr1原生質(zhì)體的再生條件進行了研究，發(fā)現(xiàn)PDA培養(yǎng)基中添加0.3 mol/L KCl和0.3 mol/L環(huán)己六醇有利于原生質(zhì)體的再生。試驗中發(fā)現(xiàn)木霉Tr1在單層平板培養(yǎng)基和雙層固體平板培養(yǎng)基上均可以長出菌落，但在雙層培養(yǎng)基上更容易長出菌落，且長出的菌落比較均勻，該再生方式同王升星等[8]報道結(jié)果相同。

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