β-葡萄糖醛酸酶在胰腺癌患者血清及組織中活性變化的臨床意義

郭 芳 何 陽 張萬里

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β-葡萄糖醛酸酶在胰腺癌患者血清及組織中活性變化的臨床意義

郭 芳 何 陽 張萬里

目的 聯(lián)合檢測胰腺癌患者血清及組織中β-葡萄糖醛酸酶(β-G)水平，分析其活性變化的臨床意義。方法選擇行手術(shù)治療的40例胰腺癌患者作為實驗組，同期健康體檢者作為對照組，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測外周血清中β-G的水平，免疫組織化學(xué)法檢測入組患者的胰腺癌組織及癌旁組織中β-G的陽性細(xì)胞百分率及陽性表達(dá)程度。結(jié)果實驗組手術(shù)前血清β-G水平為(16.59±1.69)ng/ml，出院前為(9.23±1.21) ng/ml，較治療前明顯降低，但高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；胰腺癌組織中β-G陽性細(xì)胞百分率為(62.5±4.1)%，明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；12例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者胰腺癌組織β-G陽性細(xì)胞百分率與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者比較無顯著差異(P>0.05)；中低分化腺癌β-G陽性表達(dá)率高達(dá)85%，明顯高于高分化腺癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論胰腺癌患者血清及組織中β-G水平升高，且腫瘤分化程度越低，其表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng)，與是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。

β-葡萄糖醛酸酶；胰腺癌；血清；組織

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1408～1411)

胰腺癌惡性程度高，病程短，難治愈，在臨床工作中非常常見，嚴(yán)重影響患者生命健康，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療對于延長胰腺癌患者的生存期尤為重要[1]。β-葡萄糖醛酸酶(β-G) 參與細(xì)胞增生，是機(jī)體組織細(xì)胞的酸性水解酶。文獻(xiàn)中指出，肝癌、胃癌患者的β-G發(fā)生了一定程度的活性改變[2-3]。本研究通過選取在我院住院的胰腺癌患者，檢測其血清及組織中β-G的水平，分析β-G在胰腺癌患者體內(nèi)活性發(fā)生變化的意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取于2013年1月到2015年1月在我院住院的行手術(shù)治療的胰腺癌患者40例，其中，男性22例，女性18例，年齡21～78歲，中位年齡為(41.25±1.22)歲?；颊叩呐R床表現(xiàn)包括腹痛、發(fā)熱、黃疸等。入組患者均經(jīng)病理證實,包括高分化腺癌19例,中分化腺癌13例,低分化腺癌18例，其中12例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。取胰腺癌灶中心的組織作為實驗組織，取胰腺癌旁的組織作為正常對照組織。取同期在我院體檢中心查體的健康成年人40例作為對照組，包括男性20例，女性20例，年齡20～80歲，中位年齡為(46.37±2.83)歲。所有入組患者在性別、年齡等方面無明顯差異，具有可比性(P>0.05)。

1.2 試劑與儀器

Na2EDTA抗凝劑，β-G ELISA試劑盒，RPMI1640培養(yǎng)基，PBS液，β-G封閉液+一抗，兔抗鼠免疫組化二抗試劑盒，DAB試劑盒，過氧化氫，多聚賴氨酸，0.01%檸檬酸鈉緩沖液，二甲苯，無水乙醇，石蠟，蘇木精，中性樹膠(北京四環(huán)公司)。普通離心機(jī)(上海飛鴿)；低溫冰箱(日本三洋公司)；酶標(biāo)儀(英國TECNA公司)；組織包埋機(jī)(日本SAKURA)；切片機(jī)(德國Leica公司)；計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(美國惠普)。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清β-G的水平 實驗組患者于術(shù)前及出院前用一次性注射器抽取其外周靜脈血3 ml，對照組在同一天相同時間抽取等量外周靜脈血，于常溫下靜置15 min后，以3 000 r/min離心，分離血清，收集上清液，于-85 ℃下凍存。

準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品：在含有不同量待檢物的小瓶中加入蒸餾水0.75 ml，輕輕混搖，至少15 min，并標(biāo)記濃度以便于計算。準(zhǔn)備洗液：濃洗液40 ml加入蒸餾水或去離子水960 ml。準(zhǔn)備孵育液：Tracer 600 μl加入抗β-G生物素12 ml。洗板：用洗液洗鏈霉親合素包被的酶標(biāo)板1次。加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本25 μl/孔。加孵育液100 μl/孔，室溫下震蕩1 h。用洗液洗6次/孔。加底物100 μl孔，室溫下震蕩30 min。加終止液100 μl/孔，室溫下震蕩1 min。酶標(biāo)儀405 nm處測各孔吸光度(OD)值，15 min內(nèi)測完。計算:以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，β-G濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得待測標(biāo)本β-G的含量。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法檢測組織中β-G的水平 取胰腺癌灶中心的組織作為實驗組織，取胰腺癌旁的組織作為正常對照組織。福爾馬林液固定；脫水、透明、浸蠟、包埋；切片、貼片、烤片；脫蠟、脫水，0.01%枸櫞酸緩沖液高壓熱修復(fù)；3%過氧化氫阻斷；山羊血清封閉；滴加一抗50 μl室溫靜置1 h；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗50 μl靜置10 min；鏈霉親和素-過氧化物酶50 μl靜置10 min；DAB顯色；終止；蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化；脫水、透明；封片；計算機(jī)圖像系統(tǒng)拍照，選取5個視野記錄。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)

以已知的該指標(biāo)的免疫組化染色陽性片作為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，HE 切片作對照觀察。

β-G陽性結(jié)果判定以細(xì)胞核不染色，細(xì)胞膜或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒為陽性染色，陰性(-)：染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)≤10%；弱陽性(+)：11%～25%；陽性(++)：26%～50%；強(qiáng)陽性(+++)：>50%。(-)為陰性；(+)～(+++)為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法檢測兩組血清β-G的水平

對入組患者采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清β-G的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗組手術(shù)前血清β-G水平為(16.59±1.69)ng/ml，出院前為(9.23士1.21)ng/ml，較治療前明顯降低，但高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具體結(jié)果見表1。

表1 酶聯(lián)免疫吸附法檢測兩組血清β-G的水平

2.2 胰腺癌及癌旁組織中β-G陽性細(xì)胞百分率

對入組患者的胰腺癌組織及癌旁組織中β-G的陽性細(xì)胞百分率進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中β-G的陽性細(xì)胞百分率為(62.5±4.1)%，明顯高于癌旁組織(33.4±2.7)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；12例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胰腺癌組織中β-G陽性細(xì)胞百分率與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者比較無顯著差異(P>0.05)；具體結(jié)果見圖1。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測不同分化程度胰腺癌組織中β-G的表達(dá)情況

采用免疫組織化學(xué)法，對不同分化程度的胰腺癌組織中β-G的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低分化腺癌有2例陰性表達(dá)，14例強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性率高達(dá) 95.0%；中分化腺癌其陽性率為85.0%，高分化腺癌的陽性率為72.5%，明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，具體結(jié)果見表2。

圖1 胰腺癌組織及癌旁組織中β -G的陽性細(xì)胞百分率

表2 免疫組織化學(xué)法檢測不同分化程度胰腺癌組織中β-G表達(dá)情況/例

3 討論

β-G分子量為28.5kD，是1種球蛋白，存在于細(xì)胞溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基，能夠與類固醇激素結(jié)合；對結(jié)合的葡萄糖醛酸苷的水解作用；參與細(xì)胞的增生作用等多種功能。β-G可分為內(nèi)源性β-G和外源性β-G兩類，外源性β-G由細(xì)菌產(chǎn)生，能分解結(jié)合膽紅素，分解后的游離膽紅素與鈣結(jié)合，形成結(jié)石。內(nèi)源性β-G，主要在組織、體液中，能夠水解結(jié)合的葡萄糖醛苷，與膽紅素結(jié)石的形成相關(guān)。研究表明，β-G發(fā)生活性改變，與細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展、增殖密切相關(guān)[4]。病理狀態(tài)下，β-G能夠水解癌周結(jié)締組織中的蛋白多糖及糖蛋白，破壞其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，降低其防御功能，促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤、擴(kuò)散，這個過程主要是通過作用于β-糖普鍵完成的[5]。

在本研究中，選擇在我院住院的行手術(shù)治療的胰腺癌患者作為實驗組，同期健康體檢者作為對照組，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測外周血清中β-G的水平，發(fā)現(xiàn)實驗組手術(shù)前血清β-G(16.59±1.69)ng/ml，出院前為(9.23±1.21)ng/ml，較治療前明顯降低，但高于對照組。這提示，胰腺癌患者血清β-G的水平較正常人升高，經(jīng)手術(shù)治療后有所下降但依然高于正常水平，血清中的活性檢測可作為胰腺癌診斷的指導(dǎo)指標(biāo)。采用免疫組織化學(xué)法對入組患者的胰腺癌組織及癌旁組織中β-G的陽性細(xì)胞百分率及陽性表達(dá)程度進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中β-G的陽性細(xì)胞百分率(62.5±4.1)%，明顯高于癌旁組織，但12例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織β-G陽性細(xì)胞百分率與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者無顯著差異。不同分化程度的胰腺癌組織中，中低分化腺癌組織中β-G陽性率高達(dá)85%，高分化腺癌的β-G陽性率為72.5%，明顯降低，這表明，機(jī)體組織中β-G的陽性細(xì)胞百分率與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，在惡性腫瘤中陽性率高，且分化程度越低，表達(dá)強(qiáng)度越高，但與是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。惡性腫瘤β-G的活性增高，主要有以下途徑：首先，會造成機(jī)體酶代謝發(fā)生變化，以更好地適應(yīng)腫瘤生存，惡性腫瘤細(xì)胞分泌β-G增多，癌細(xì)胞膜對β-G的通透性增加，缺乏β-G抑制劑；其次，腫瘤細(xì)胞不斷分化、增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移，破壞周圍正常組織，導(dǎo)致機(jī)體多數(shù)組織酶生成異常，患者血清及組織中分泌β-G增高[6-8]。張弘等應(yīng)用免疫電鏡技術(shù)，研究β-G與胰腺癌的超微結(jié)構(gòu)關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-G在胰腺癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯高于正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞[9]。既往研究在32例胰腺癌組織，其β-G的陽性細(xì)胞百分率為(62.5±4.1)%，而癌旁組織的β-G陽性細(xì)胞百分率僅為(43.3±2.8)%，較癌組織明顯降低，并且，隨著胰腺癌的分化程度不同，癌組織表達(dá)β-G的強(qiáng)度也有顯著差異，其分化程度與表達(dá)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)。該研究提示，雖然β-G不能作為單一診斷胰腺癌的指標(biāo)，卻能夠在一定程度上作為評價胰腺癌病情發(fā)展及分化程度的參考。從分子生物學(xué)發(fā)展的角度來看，通過活化癌基因，能夠產(chǎn)生大量癌性蛋白，屬于癌基因的表達(dá)產(chǎn)物，其作用在于破壞機(jī)體的酶反應(yīng)體系，影響機(jī)體細(xì)胞的分化、增殖、分泌，促進(jìn)癌細(xì)胞的成熟。惡性腫瘤細(xì)胞的基本特征就是細(xì)胞無限制的自主增殖，這是惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展的必要條件，細(xì)胞的無限自主增殖的過程受眾多因素的調(diào)控。β-G作為體內(nèi)參與細(xì)胞增生的酸性水解酶，當(dāng)機(jī)體組織細(xì)胞過度分化增殖時，β-G的表達(dá)明顯增加，活性增強(qiáng)，這可能是腫瘤細(xì)胞的一種自我調(diào)控，已適應(yīng)其自身的快速、過度的增殖狀態(tài)[10]。本研究的結(jié)果與既往的理論研究相一致。

綜上所述，胰腺癌患者血清及組織中β-G水平升高，且分化程度越低，表達(dá)強(qiáng)度越高，與是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。通過血清及組織聯(lián)合檢測β-G水平，對胰腺癌的診斷具有一定的指導(dǎo)意義。

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(編輯：吳小紅)

Clinical Significance of the Changes of the Activity of β-G in Serum and Tissues of Pancreatic Cancer

GUOFang,HEYang,ZHANGWanli.HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,430022.

Objective To detect the serum and tissues level of β-G in patients with pancreatic cancer,and to analyze the clinical significance of the changes of the activity of β-G.Methods 40 patients with pancreatic cancer were selected as the experimental group.The levels of β-G in peripheral blood were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.The expression of β-G positive cells in pancreatic cancer tissues and adjacent tissues were detected by immunohistochemistry.Results Serum β-G (16.59±1.69) ng/ml of the experimental group before surgery was significantly lower than before treatment,but was higher than the control group(P<0.05);The percentage of β-G positive cells in pancreatic cancer tissues (62.5±4.1)% was significantly higher than that of the adjacent tissues (P<0.05);There had no significant difference in percentage of β-G positive cells between 12 cases of lymph node metastasis pancreatic cancer tissues and non lymph node metastasis(P >0.05). The positive expression rate of β-G in the middle and low differentiation adenocarcinoma was 85%,which was significantly higher than that in the high differentiated adenocarcinoma (P<0.05).Conclusion Serum and tissues levels of β-G in patients with pancreatic cancer increased,and the lower the degree of differentiation,the higher the expression intensity,and it is not related with the occurrence of lymph node metastasis.

β-G;Pancreatic cancer;Serum;Tissue

430022 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.09.006

R735.9

A

1001-5930(2016)09-1408-04

2015-10-08

2016-02-27)