血痛定噴霧劑的制備及體外凝血作用的研究

侯 君，鄭德志，李聃丹，于波濤，呼永河

·論著·

血痛定噴霧劑的制備及體外凝血作用的研究

侯 君，鄭德志，李聃丹，于波濤，呼永河

目的制備中藥血痛定噴霧劑，并考察其對(duì)體外凝血指標(biāo)的影響。方法通過高分子材料PCEC合成、制備可同時(shí)傳輸疏水性（獨(dú)一味、祖師麻）和親水性藥物（三七）的高效透皮給藥的中藥外用噴霧劑——血痛定噴霧劑。結(jié)果制備的血痛定噴霧劑納米粒呈圓形顆粒狀分布，峰形單一，平均粒徑32.86 nm，帶負(fù)電荷，電位-1.79 mV。隨著噴霧劑濃度的增加，體外凝血酶時(shí)間、部分激活的凝血酶時(shí)間降低，凝血酶原時(shí)間呈不規(guī)律性變化，纖維蛋白原呈先遞減后遞增的趨勢(shì)。結(jié)論成功制備血痛定噴霧劑，明確其對(duì)體外凝血指標(biāo)的止血作用。

血痛定；噴霧劑；PCEC；高效透皮傳輸給藥系統(tǒng)

血痛定組方包含三七、獨(dú)一味、祖師麻等，其中三七，味甘、微苦，性溫，功能散瘀止血，用于外傷出血，跌撲腫痛[1]。獨(dú)一味，甘、苦，性平，功能活血止血，主用于跌打損傷，外傷出血[2]。上二藥配伍，活血止血，化瘀定痛，針對(duì)“筋傷”病機(jī)血不循經(jīng)，瘀血阻滯病機(jī)。祖師麻，辛苦，溫，功能祛風(fēng)濕、散瘀、止痛，針對(duì)“筋傷”外風(fēng)入絡(luò)，以助君藥?kù)铒L(fēng)化瘀止痛[3]。因此，血痛定具有較好的止血作用。本研究擬采用高分子材料合成、制備可同時(shí)傳輸疏水性和親水性藥物的高效透皮緩釋給藥系統(tǒng)，促進(jìn)血痛定中有效成分的透皮吸收、傳輸，制備具有快速、高效止血作用的中藥外用噴霧劑。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 己內(nèi)酯、PEG4000、辛酸亞錫等購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)；三七、獨(dú)一味、祖師麻提取物由本實(shí)驗(yàn)室制備。Varian 400型核磁共振氫譜（美國(guó)Varian公司）；X’Pert Pro型 X-射線衍射儀 (荷蘭Philips公司)；APV 2000型高壓勻質(zhì)機(jī)（德國(guó)APV公司）；MDF382E型超低溫冰箱（日本sanyo公司）；Zetasizer 3000型粒度與電勢(shì)分析儀(英國(guó)Malvern公司)；tec-10型透射電子顯微鏡(荷蘭Philips公司)；CA510型全自動(dòng)血凝儀（日本sysmex公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 家兔購(gòu)于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：川實(shí)動(dòng)管字第71號(hào)）。

1.3 血痛定噴霧劑的制備

1.3.1 聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（PCL-PEGPCL）共聚物PCEC的合成[4]按比例將己內(nèi)酯、PEG4000及辛酸亞錫（0.5%w/w，辛酸亞錫所加的量為PEG2000的0.5%）加入到三口燒瓶中。通過機(jī)械攪拌和氮?dú)獗Ｗo(hù)，在130℃油浴中反應(yīng)6 h，溫度升到180℃并抽至真空。20 min后終止反應(yīng)，待溫度降到室溫后，用二氯甲烷溶解聚合物，然后將其倒入冷石油醚中沉淀，過濾，在通風(fēng)櫥中使溶劑揮發(fā)，真空干燥備用。

1.3.2 PCEC的表征鑒定 （1）分子結(jié)構(gòu)鑒定：核磁共振氫譜1H-NMR表征PCEC分子結(jié)構(gòu)，聚合物被溶解到CDCl3。（2）結(jié)晶性能鑒定：X-射線衍射XRD表征聚合物材料的結(jié)晶性能，Cu Kα作靶。

1.3.3 載藥納米粒制備 將獨(dú)一味、祖師麻提取物與PCEC溶于乙酸乙酯中，然后加入三七提取物的水溶液（濃度為1 g/ml），3藥提取物皆占PCEC質(zhì)量的1%，PCEC的用量為乙酸乙酯質(zhì)量的5%。高速勻漿機(jī)乳化，轉(zhuǎn)速10 000 r/min，形成油包水的乳液；加入含50 ng/ml泊洛莎姆的水溶液中，再乳化，形成水包油包水的復(fù)乳。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃減壓蒸發(fā)20 min，使乙酸乙酯揮發(fā)，即得載藥納米粒。

1.3.4 載藥納米粒質(zhì)量控制 （1）粒徑分布測(cè)定：測(cè)試溫度為25℃，重復(fù)測(cè)試3次，取平均值。（2）ζ電位測(cè)定：測(cè)試溫度為25℃，重復(fù)3測(cè)試次，取平均值。（3）形貌分析：膠束用蒸餾水稀釋，滴到銅網(wǎng)上，磷鎢酸負(fù)染，室溫下干燥后透射電鏡觀察。

1.4 血痛定噴霧劑止血作用研究[5]

1.4.1 溶液配制

1.4.1.1 樣品溶液配制 精密稱定凍干血痛定噴霧劑粉末0.2 g，定容至100 ml容量瓶中，配制成為2 mg/ml的儲(chǔ)備液，臨用前稀釋成0.01～0.2 mg/ml溶液。

1.4.1.2 陽(yáng)性對(duì)照藥物溶液的配置 精密稱取云南白藥粉0.3 g，定容至100ml容量瓶中，配制成為3 mg/ml儲(chǔ)備液，臨用前配制成為 0.15 mg/ml的陽(yáng)性對(duì)照溶液。

1.4.2 血漿制備 健康家兔，雄性，體重2.5～3.0 kg，采血前24 h禁食，自由飲水。耳緣靜脈取血，3500 r/min離心10 min，收集上清，在-18℃冰箱保存。

1.4.3 血痛定噴霧劑對(duì)凝血酶時(shí)間（TT）的影響吸取血漿、蒸餾水，各濃度的血痛定溶液及云南白藥陽(yáng)性對(duì)照各30 μl至比色杯，預(yù)熱2 min，吸取30 μl的TT試劑至該比色杯，每組平行測(cè)定3份。

1.4.4 血痛定噴霧劑對(duì)凝血酶原時(shí)間（PT）的影響

吸取血漿、蒸餾水，各濃度的血痛定溶液及云南白藥陽(yáng)性對(duì)照各30 μl至比色杯，預(yù)熱2 min，吸取30 μl的PT試劑至該比色杯，每組平行測(cè)定3份。

1.4.5 血痛定對(duì)部分激活的凝血酶時(shí)間（APTT）的影響 吸取血漿、蒸餾水，各濃度的血痛定溶液及云南白藥陽(yáng)性對(duì)照各30 μl至比色杯，預(yù)熱2 min，吸取30 μl的CaCl2試劑至該比色杯，每組平行測(cè)定3份。

1.4.6 血痛定對(duì)纖維蛋白原（FIB）的影響 吸取血漿、蒸餾水，各濃度的血痛定溶液及云南白藥陽(yáng)性對(duì)照各40 μl至比色杯，預(yù)熱2 min，吸取20 μl的FIB試劑至該比色杯，每組平行測(cè)定3份。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血痛定噴霧劑的制備及質(zhì)量表征

2.1.1 PCEC的質(zhì)量表征 PEG的亞甲基特征峰值出現(xiàn)在3.65 ppm，4.18 ppm吸收峰則是PCL的-OCH2-CH2O-CO(CH2)5CO-的特征峰，說明PEG與PCL是由酯鍵相連的三嵌段共聚物（圖1）。圖2衍射峰單一而尖銳，說明PCEC的結(jié)晶性能良好。

圖1 核磁共振氫譜1H-NMR表征PCEC特征峰

圖2 X-射線衍射XRD表征PCEC結(jié)晶性能

2.1.2 血痛定噴霧劑的質(zhì)量表征 圖3為載藥納米粒的透射電鏡圖，表明載藥納米直徑＜50 nm。圖4為載藥納米粒的粒徑分布圖，表明該納米粒的平均粒徑尺寸為32.86 nm，峰形單一說明載藥納米粒粒度分布均勻；圖5為載藥納米粒電位分析圖，所測(cè)得該納米粒的電位為-1.79 mV。

圖3 載藥納米粒的透射電鏡圖

圖4 載藥納米粒的粒徑分布

圖5 載藥納米粒的電位圖

2.2 血痛定噴霧劑止血作用評(píng)價(jià)

2.2.1 對(duì)TT的影響 隨著噴霧劑濃度增加，TT縮短，有利于快速止血，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組結(jié)果（表1）。

2.2.2 對(duì)PT的影響 隨著噴霧劑濃度增加，PT呈不規(guī)律性變化（表2）。

表2 各組血槳凝血酶原時(shí)間比較(n=4)

2.2.3 對(duì)APTT的影響 隨著噴霧劑濃度增加（0.08～0.15 mg/ml），APTT呈遞減趨勢(shì)，優(yōu)于陽(yáng)性組，但繼續(xù)增加噴霧劑濃度 （0.2 mg/ml），APTT反而增加（表3）。

2.2.4 對(duì)FIB的影響 隨著噴霧劑濃度增加，F(xiàn)IB呈先遞減后遞增的趨勢(shì)，陽(yáng)性組優(yōu)于噴霧劑組（表4）。

3 討論

本研究運(yùn)用現(xiàn)代納米技術(shù)，對(duì)臨床驗(yàn)方進(jìn)行中藥有效成分或部位的研究與開發(fā)，避免了傳統(tǒng)中藥在加工過程中繁瑣的處理工序，使之形成納米中藥復(fù)方制劑，有利于藥物的規(guī)范化研究、開發(fā)、生產(chǎn)，大大提高了該制劑的現(xiàn)代化和標(biāo)準(zhǔn)化程度。血痛定噴霧劑是一種新型止血制劑，有效成分為PCLPEG-PCL共聚物。PCL是一種生物可降解、生物相容好的半結(jié)晶聚合物，它以微球、納米粒子和植入材料的形式在不同的藥物傳輸系統(tǒng)中得到了應(yīng)用。由于PCL的高結(jié)晶度和強(qiáng)疏水性，使得PCL降解緩慢，并且疏水的PCL納米粒子在靜脈注射后會(huì)很快被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除。純PCL粒子在水中很不穩(wěn)定，非常容易發(fā)生聚集。為了解決上述問題，課題組對(duì)PCL納米粒做了多種修飾，其中聚乙二醇（PEG）化的PCL納米結(jié)果最好。PEG化可使疏水性高分子納米粒具有兩親性，生物相容性提高，降解速度和藥物釋放行為可控，體內(nèi)循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)。這些特點(diǎn)使PEG化的PCL納米粒比純PCL納米粒在給藥系統(tǒng)中更有應(yīng)用前景。

表1 各組血槳凝血酶時(shí)間比較（n=4）

表3 各組血槳部分激話的凝血酶時(shí)間比較(n=4)

表4 各組血槳纖維蛋白原比較(n=4)

凝血酶在止、凝血中發(fā)揮了重要的作用。PT值反映外源性凝血因子，APTT反映內(nèi)源性凝血因子，TT值反映凝血共同途徑纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的抗凝過程。本研究發(fā)現(xiàn)，血痛定噴霧劑不能縮短PT和FIB，但可以顯著縮短APTT和TT值。因此推測(cè)，血痛定噴霧劑體外止血作用可能是影響抗凝系統(tǒng)和內(nèi)源性凝血因子起作用，而對(duì)外源性凝血因子和纖溶系統(tǒng)影響不大。

綜上所述，血痛定噴霧劑如能應(yīng)用臨床，可作為外科手術(shù)的重要輔助工具，極具臨床應(yīng)用前景。同時(shí)血痛定噴霧劑適合軍地兩用，具有極大的軍事和社會(huì)意義。

[1] 張子龍,王文全.三七本草研究概述[J].世界科學(xué)技術(shù)(中醫(yī)藥現(xiàn)代化),2010,12(2):271-276.

[2] 王煌,張智艷,程明和,等.獨(dú)一味化學(xué)成分研究進(jìn)展與臨床應(yīng)用[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志,2006,24(2):73-75.

[3] 李書慧,吳立軍,殷紅英.祖師麻化學(xué)和藥理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2002,27(6):401-403.

[4] 黃安亮,成麗.新型靶向FAK基因shRNA的陽(yáng)離子PCEC納米材料制劑對(duì)人乳腺癌增殖和凋亡的影響[J].華西藥學(xué)雜志, 2009,24(4):345-348.

[5] 向金,蓮程睿,張路晗.血竭的活血和止血作用研究[J].華西藥學(xué)雜志,2000,15(6):430-434.

Preparation and in vitro hemostatic effects of Xuetongding Spray

Hou Jun1,Zheng Dezhi2,Li Dandan3,Yu Botao1,Hu Yonghe41.Department of Pharmacy,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China;2.Department of Cardiovascular Surgery,General Hospital of Jinan Military Command, Jinan,Shandong,250031,China;3.Base for Drug Clinical Trail,Xinqiao Hospital Affiliated to Third Military Medical University, Chongqing,400037,China;4.Centre for High Humid Environment and Military Medicine,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China

Objective To prepare TCM Xuetongding Spray and observe its impacts on in vitro coagulation indexes.MethodsXuetongding Spray,the effective cutaneous TCM penetration for external use transmitting both hydrophobic drugs(Duyiwei and Zushima)and hydrophilic drugs (Sanqi)was synthetized and prepared with polymers PCEC.ResultsThe nanoparticles of Xuetongding Spray were round and uniform ly distributed,displayed a single peak.The average diameter was 32.86 nm,with negative charge and a potential of-1.79 mV.With the increase of spray concentration,the thrombin time in vitro and activated partial thrombin time decreased;the prothrombin time showed irregular changes;the fibrinogen decreased progressively first and then increased progressively.ConclusionXuetongding Spray is successfully prepared to identify its hemostatic effect in vitro.

Xuetongding Spray;PCEC;effective transdermal drug administration system

R 283

A

1004-0188（2016）12-1401-05

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.014

2016-07-22）

四川省科技廳科技支撐項(xiàng)目（2014SZ0037）；2014年度全軍后勤科研項(xiàng)目（BWS14J023）

610083成都，成都軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科（侯 君，于波濤）,高濕環(huán)境軍事醫(yī)學(xué)研究中心（呼永河）;濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院心血管外科（鄭德志）；第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院臨床藥理基地（李聃丹）；

呼永河，電話：028-86570206；E-mail：huyonghezyy@163. com