小檗堿對小鼠成骨細胞增殖和成骨活性的影響

李善昌，趙 剛，王飛飛，付雅楠

(佳木斯大學口腔醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154002)

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小檗堿對小鼠成骨細胞增殖和成骨活性的影響

李善昌，趙 剛，王飛飛，付雅楠

(佳木斯大學口腔醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：研究小檗堿對小鼠成骨細胞增殖和成骨活性的影響。 方法：在中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心購買成骨細胞MC3T3-E1，進行培養(yǎng)，待培養(yǎng)一定數(shù)量后應(yīng)用CCK8法檢測出小檗堿對成骨細胞增殖的影響，應(yīng)用ALP法檢測出小檗堿對成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響，應(yīng)用茜素紅法染色觀察小檗堿對成骨細胞鈣化結(jié)節(jié)形成的影響。結(jié)果：用CCK-8法檢測出，小檗堿在1×10-5mol/L時成骨細胞增殖率最高，其他濃度略有增殖，但程度相對減少；ALP 活性測定，小檗堿在1×10-5mol/L時成骨細胞堿性磷酸酶最高，其他濃度略有升高，但程度相對減少；小檗堿在濃度為1×10-5mol/L培養(yǎng)28d時鈣化結(jié)節(jié)形成最顯著。結(jié)論：小檗堿對小鼠成骨細胞增殖和成骨活性均有促進作用且在1×10-5mol/L時促進作用最明顯。

小檗堿;成骨細胞;增殖;成骨活性

成骨細胞是骨形成過程中十分重要的細胞，主要負責骨基質(zhì)的礦化，分泌和合成[1]。成骨與破骨過程的動態(tài)平衡是維持骨量正常的關(guān)鍵[2～4]。成骨細胞不僅能夠決定骨的形成，同時也可以調(diào)節(jié)破骨細胞對骨的吸收，它的增殖在很大程度上決定了最終形成的骨量。牙槽嵴頂下骨密度的變化要先于牙槽骨高度的變化，至少 30%的牙槽骨礦物含量喪失時才能在X線片上表現(xiàn)出高度的降低[5]。因此在臨床診斷和治療過程中，了解與認識成骨細胞在骨重建過程中的作用具有重要意義。

小檗堿(berberine)又名黃連素,是從毛茛科植物黃連根莖中提取的異喹啉生物堿,有抗炎、抗腫瘤、抗菌作用、降血糖和調(diào)血脂等作用[6,7]。近年來發(fā)現(xiàn)小檗堿對骨質(zhì)疏松具有預(yù)防作用[8]。為了進一步探討小檗堿抗骨質(zhì)疏松作用機制,本實驗采用細胞培養(yǎng)技術(shù),觀察小檗堿對體外培養(yǎng)的成骨細胞增殖、成骨活性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小檗堿標準品購買于中國藥品生物制品檢定所，純度≥98%，成骨細胞MC3T3-E1購買于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心、胎牛血清(Gibco公司)、青霉素鏈霉素溶液-雙抗(HyClone海可隆公司)、0.25%胰蛋白酶消化液(HyClone海可隆公司)、PBS(碧云天生物技術(shù)研究所)、二甲基亞砜(Sigma公司)、Cell Counting Kit-8試劑盒(Boster博士德生物) 、ALP試劑盒(南京建成生物工程研究所)、茜素紅(碧云天生物技術(shù)研究所) 。

1.2 主要儀器

電子天平(OHAUS,美國)、Olympus顯微鏡(日本Olympus顯微鏡)、酶標儀(TAKARA,日本)、CO2培養(yǎng)箱(美國ThermoForma公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

倒置相差顯微鏡下觀察購買的 MC3T3-E1成骨細胞,在無菌操作臺下，將原培養(yǎng)基吸去，加入3ML PBS溶液清洗2遍,加入0.25%胰酶1mL,于CO2培養(yǎng)箱中消化1min 后,在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)變化。當細胞收縮、變圓，大部分從培養(yǎng)瓶底脫落時,加入完全培養(yǎng)基2mL終止消化,反復(fù)吹打細胞使其成為均勻的單細胞懸液,移至15mL離心管,置于離心機中，1000rpm離心3min,吸去上清液,加入含10%胎牛血清、1%雙抗的α-DMEM培養(yǎng)基2mL,輕輕多次吹打,使其均勻。接種至2個新培養(yǎng)瓶中,每個培養(yǎng)瓶再加入4mL完全培養(yǎng)基，置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液1次。

1.3.2 細胞傳代

培養(yǎng)1～2d,待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%～90%時,用PBS沖洗，胰蛋白酶消化,懸成 1×105個/mL的密度備用。

1.3.3 Cck8 法測定小檗堿對MC3T3-E1細胞的增殖影響

取3塊96孔板，每塊板都分為對照組和實驗組,實驗組分為A、B、C、D、E五個亞組，每組5個復(fù)孔，用0.25%的胰酶消化成骨細胞后將其調(diào)整為密度為1×105個/mL,各組均加入100μL的細胞懸液。置于CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24h至細胞貼壁，為了保證每孔體積相同，對照組不加任何試劑，只加100μL完全培養(yǎng)基;實驗組各加入濃度分別為1×10-4mol/L，1×10-5mol/L，1×10-6mol/L，1×10-7mol/L，1×10-8mol/L小檗堿100μL，置37℃溫箱。細胞培養(yǎng)，并分別于1d，3d，5d分別取出一塊96孔板，按Cck8測試盒說明書進行檢測。用酶標儀測定450nm時每孔細胞OD值。以上實驗重復(fù)3次，求出其平均值。

1.3.4 ALP活性測定

取3塊96孔板,每塊板都分為空白對照組，標準對照組和實驗組,實驗組分為A、B、C、D、E五個亞組，方法同Cck8相同，分別于1d、3d、7d取出按堿性磷酸酶ALP測試盒說明書進行檢測。用酶標儀測定520nm時各孔吸光度OD值。按照試劑盒說明書計算出培養(yǎng)細胞中的ALP活力。

1.3.5 ME3T3-E1成骨細胞鈣化結(jié)節(jié)染色

6孔板中每孔接種1×105/mL成骨細胞1mL，培養(yǎng)24h待細胞貼壁后，實驗組分別加入不同濃度的小檗堿及含成骨誘導(dǎo)液的完全培養(yǎng)基1mL，對照組只加含成骨誘導(dǎo)液的完全培養(yǎng)基1mL，隔天換液,28d后將待測各孔培養(yǎng)液吸出，每孔加入2mL PBS清洗2遍，用茜素紅法染色并拍照。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 Cck8法測定小檗堿對MC3T3-E1細胞增殖影響

結(jié)果表明：與對照組相比，1×10-8mol/L實驗組在1d、3d均無統(tǒng)計學意義。1×10-7mol/L實驗組和1×10-4mol/L實驗組與對照組相比分別在1d、5d無統(tǒng)計學意義。其余實驗組在各個時間段與對照組相比都有統(tǒng)計學意義。各實驗組兩兩比較均有意義。說明各實驗組在不同時間段對成骨細胞增值均有不同程度的促進作用，并在 1×10-5mol/L促進增殖效果最明顯，見表1。

表1 小檗堿對小鼠成骨細胞增殖的影響

注：與對照組相比，無統(tǒng)計學意義(*P>0.05)。

2.2 ALP活性測定

結(jié)果表明：1×10-8mol/L實驗組在1d時與對照組比較無統(tǒng)計學意義。 1×10-4mol/L實驗組在7d時無統(tǒng)計學意義，說明高濃度的小檗堿在1d、3d時對成骨細胞ALP活性有促進作用，而在7d時則有抑制作用。其他濃度在各時間點均有促進作用，且隨時間推移，作用效果越顯著。其中 1×10-5mol/L在各個時間點上促進效果最明顯。見表2。

表2 小檗堿對小鼠成骨細胞ALP活性的影響

注：與對照組相比，無統(tǒng)計學意義(*P>0.05)。

2.3 茜素紅染色

結(jié)果表明：于28d對實驗組和對照組的成骨細胞進行染色，1×10-5mol/L實驗組與對照組相比鈣化結(jié)節(jié)形成最顯著。見圖1和圖2。

圖1 1×10-5mol/L 實驗組成骨細胞茜素紅染色(×10)

圖2 對照組成骨細胞茜素紅染色(×10)

3 討論

成骨細胞在骨代謝過程中起著重要的作用，促進成骨細胞增殖及分化成熟是防治骨質(zhì)疏松癥的主要方法之一，已有實驗證明復(fù)合材料明顯加速了骨修復(fù)進程,具有良好的成骨活性[9]。體外培養(yǎng)的成骨細胞也是進行新藥開發(fā)和藥效評估的重要模型[10～12]。在骨組織形成過程中，成骨細胞先合無鈣鹽沉積的類骨質(zhì)，由成骨膠纖維和有機骨基質(zhì)構(gòu)成，內(nèi)含唾液蛋白，類脂等。類骨質(zhì)不斷將成骨細胞包埋其中，使成骨細胞成為骨細胞，類骨質(zhì)經(jīng)鈣鹽沉積變成為骨組織。 近年來研究發(fā)現(xiàn)小檗堿具有通過抑制破骨細胞的形成分化來抑制骨吸收，提高骨小梁的厚度及減少骨量丟失的作用[13]。堿性磷酸酶是成骨細胞所分泌的一種酶蛋白，特異性高[14],是成骨細胞分化成熟的標志之一[15],也是很重要的評價骨形成的指標，是反應(yīng)成骨細胞活動強弱的非常重要的標志。鈣化結(jié)節(jié)是成骨細胞成骨活性的重要體現(xiàn)之一。Cck8法和Alp法均顯示1×10-5mol/L的小檗堿有明顯促進成骨細胞增殖和成骨活性的作用。不同濃度的小檗堿對成骨細胞起作用的時間點不同，說明此藥物對細胞增值和成骨活性的促進作用具有時效性。茜素紅染色顯示1×10-5mol/L小檗堿28d時能明顯促進鈣化結(jié)節(jié)形成。本實驗直接將小檗堿作用于成骨細胞，其作用機制需做進一步研究。

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The effects of berberine on the proliferation and osteogenic activity of osteoblasts in mice

LIShan-chang,ZHAOGang,WANGFei-fei，F(xiàn)UYa-nan

(Jiamusi Stomatological Hospital, Jiamusi 154002, China)

Objective: To study the effect of berberine on the proliferation and osteogenic activity of osteoblasts in mice. Methods: Osteoblasts MC3T3-E1, purchased in the Cell resource center, Shanghai institute of life science, Chinese Academy of Sciences, were needed to be cultivated a certain number. Berberine on bone cell proliferation was detected by using CCK8 method, and bone cell alkaline phosphatase activity was detected by using ALP method. The influence of bone cell calcification nodule formation was detected by using red method dyeing effect. Results: CCK-8 method was used to detect the proliferation rate of osteoblasts, and berberine in 1×10-5mol/L osteoblast proliferation rate is the highest, while other concentration was slightly proliferated, but the degree is relatively reduced. ALP activity determination of berberine in 1×10-5mol/L osteoblast alkaline phosphatase was the highest. The concentration of others slightly increased, but the degree was relatively reduced. Berberine cultivated in the concentration of 1×10-5mol/L 28 d was the most significant in calcified nodules form. Conclusion: Berberine can promote the proliferation and osteogenic activity of osteoblasts in mice and promote the effect when the concentration is 1×10-5mol/L.

berberine;osteoblast cells;proliferation;osteogenic activity

黑龍江省教育廳科研項目，編號：12521553。

李善昌( 1969～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。

王飛飛(1991～)女，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。E-mail:532103993@qq.com。

R285.5

A

1008-0104(2016)06-0024-03

2015-12-02)