冬蟲(chóng)夏草菌絲狀菌源增殖培養(yǎng)的研究

賀宗毅，李 黎，張德利，李 卿，毛先兵，陳仕江*

(1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.重慶市中藥資源學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400065；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，中藥資源中心重慶分中心，重慶 400065；4.甘孜州康定貢嘎中華蟲(chóng)草產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司，四川甘孜 626000；5.西南藥業(yè)股份有限公司，重慶 400000)

?

冬蟲(chóng)夏草菌絲狀菌源增殖培養(yǎng)的研究

賀宗毅1,2,3,4，李 黎1,2,3,4，張德利1,2,3,4，李 卿1，毛先兵5，陳仕江1,2,3,4*

(1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.重慶市中藥資源學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400065；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，中藥資源中心重慶分中心，重慶 400065；4.甘孜州康定貢嘎中華蟲(chóng)草產(chǎn)業(yè)有限責(zé)任公司，四川甘孜 626000；5.西南藥業(yè)股份有限公司，重慶 400000)

冬蟲(chóng)夏草菌是珍稀瀕危名貴中藥材冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型菌種，是侵染蝠蛾幼蟲(chóng)的唯一菌種，其侵染后形成名貴中藥材冬蟲(chóng)夏草。冬蟲(chóng)夏草菌在不同營(yíng)養(yǎng)及條件下生長(zhǎng)形態(tài)不同，主要有絲狀體和菌球體兩種生長(zhǎng)形態(tài)。冬蟲(chóng)夏草菌絲狀菌體能夠侵染蝠蛾幼蟲(chóng)，有可能作為一種新的接種體被廣泛應(yīng)用；但絲狀菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻、生長(zhǎng)緩慢、菌絲體得率低的特點(diǎn)，阻礙了冬蟲(chóng)夏草菌絲狀菌體作為侵染蝠蛾幼蟲(chóng)的接種體的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用，從而阻礙了冬蟲(chóng)夏草人工培殖產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。為了提高冬蟲(chóng)夏草菌絲狀菌體的生物表達(dá)量，本文對(duì)營(yíng)養(yǎng)及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，得出了最佳條件為：葡萄糖質(zhì)量濃度40 g/L、酵母粉質(zhì)量濃度65 g/L、培養(yǎng)溫度17℃、MgSO4質(zhì)量濃度3 g/L、KH2PO4質(zhì)量濃度1.5 g/L、培養(yǎng)時(shí)間12 d，按最優(yōu)培養(yǎng)條件，冬蟲(chóng)夏草菌絲狀菌體干重得率15.67 g/L，為下一步新的接種體的制備提供菌源保障。

冬蟲(chóng)夏草菌；絲狀菌體；蟲(chóng)草蝠蛾幼蟲(chóng)；培養(yǎng)

冬蟲(chóng)夏草Ophiocordycepssinensis(Berk.)(Sungetal.，2007)系我國(guó)特產(chǎn)珍稀名貴中藥材，是冬蟲(chóng)夏草菌O.sinensis侵入蝠蛾屬Hepialus幼蟲(chóng)體內(nèi)后形成的一種菌物藥，是冬蟲(chóng)夏草菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育的產(chǎn)物。冬蟲(chóng)夏草的用藥歷史始載于《本草綱目拾遺》，稱(chēng)其有“補(bǔ)肺益腎、止血化痰”之功效。近代藥理和臨床研究表明，冬蟲(chóng)夏草與冬蟲(chóng)夏草菌絲體產(chǎn)物藥理作用相近，均具有免疫調(diào)節(jié)(Wuetal.，2006)、抗氧化(Dong&Yao，2008)、調(diào)節(jié)高脂血癥(Zhangetal.，2006)、調(diào)節(jié)血糖(Kohetal.，2003)、抗腫瘤(Wuetal.，2005)、延緩衰老(Jietal.，2009)等功效。

目前蝠蛾幼蟲(chóng)的接種體來(lái)源有冬蟲(chóng)夏草菌的分生孢子和冬蟲(chóng)夏草菌絲體，分生孢子是接種體的主要來(lái)源，但在冬蟲(chóng)夏草人工培殖的產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)冬蟲(chóng)夏草菌產(chǎn)分生孢子的能力在逐漸下降，甚至有些批次的菌體不產(chǎn)生分生孢子，阻礙了冬蟲(chóng)夏草人工培殖的產(chǎn)業(yè)化，在蝠蛾幼蟲(chóng)接種體領(lǐng)域?qū)で笮碌耐黄茖?huì)推動(dòng)冬蟲(chóng)夏草人工培殖產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。已有研究表明除冬蟲(chóng)夏草菌分生孢子具有侵染力外，冬蟲(chóng)夏草菌絲體亦具有侵染力(俞永信，2004)。長(zhǎng)期以來(lái)冬蟲(chóng)夏草菌絲狀菌體作為侵染體的研究沒(méi)有得到重視，致使可用于接種體制備的絲狀菌體培養(yǎng)的報(bào)道較少。

冬蟲(chóng)夏草菌在不同營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)形態(tài)不同，菌球體更易獲得，絲狀菌體的形成對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求更為苛刻，因此是否能夠大量培養(yǎng)出絲狀菌體對(duì)推動(dòng)蝠蛾幼蟲(chóng)接種體的創(chuàng)制具有重要意義。本文以絲狀菌體生物量和腺苷為考察指標(biāo)，研究絲狀菌體增殖培養(yǎng)條件，為下一步蝠蛾幼蟲(chóng)接種體的制備提供菌源保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株：冬蟲(chóng)夏草Ophiocordycepssinensis菌種，保存于重慶市中藥研究院。

儀器設(shè)備：凈化工作臺(tái)SW-CJ-1D(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；生化培養(yǎng)SPX-150B-Z(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng))；分析天平AUY120(島津國(guó)際貿(mào)易公司)；Aailent 1260(安捷倫科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 斜面種子培養(yǎng)

于母種試管中切取出黃豆粒大小的菌絲塊，接種于斜面中部。16℃恒溫培養(yǎng)30 d。菌種用斜面培養(yǎng)基保存和培養(yǎng)。斜面培養(yǎng)基為PPDA培養(yǎng)基。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的斜面菌種切取蠶豆大小，接于液體培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝液量100 mL，16℃，150 r/min，搖床培養(yǎng)12 d 。

液體種子基礎(chǔ)培養(yǎng)基為：葡萄糖15 g，酵母粉5 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，水1000 mL。

1.2.3 滅菌及接種

滅菌：將配制好的液體培養(yǎng)基分裝，500 mL三角瓶裝液量100 mL，用棉塞和牛皮紙封口后，放入高壓鍋內(nèi)，在121℃條件下滅菌25 min。

接種：在潔凈工作臺(tái)上進(jìn)行接種，選用純化的試管菌種，挑取黃豆粒大小的菌絲接入三角瓶液體中，每瓶接一支固體菌種，接菌時(shí)，室內(nèi)要嚴(yán)格消毒，防止雜菌進(jìn)入培養(yǎng)液而影響蟲(chóng)草菌絲生長(zhǎng)。

1.2.4 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

按10%的接種量取液體種子進(jìn)行接種，250 mL三角瓶裝液量100 mL，16℃，150 r/min，搖床培養(yǎng)12 d 。

1.2.5 生物量計(jì)算

將培養(yǎng)液置于有孔徑為0.1 cm的篩板上，反復(fù)用蒸餾水沖洗篩板至絲狀菌體全部通過(guò)篩板，收集濾液，離心(4000 r/min，15 min)，用蒸餾水沖洗菌絲濾餅2次，再離心，菌絲60℃電熱恒溫干燥箱中烘干至恒重，稱(chēng)重得菌絲體干重生物量。

1.2.6 Plackett-Burman篩選實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Plackett-Burman篩選實(shí)驗(yàn)：為了篩選出影響冬蟲(chóng)夏草菌絲狀菌體生長(zhǎng)的顯著因子，本文將在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)Plackett-Burman篩選實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因子取高(+1)，低(-1)2個(gè)水平。以菌絲體干重生物量為響應(yīng)值Y。參數(shù)和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，各因素的效應(yīng)評(píng)價(jià)及系數(shù)估計(jì)見(jiàn)表3。P<0.05說(shuō)明該因素對(duì)菌絲體生物量的影響是顯著的，可對(duì)該因素作進(jìn)一步的考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

正交實(shí)驗(yàn)：將對(duì)Plackett-Burman篩選的因素指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)考察。各因素選取水平情況、試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表4和表5。

1.2.7 冬蟲(chóng)夏草菌絲體腺苷含量的測(cè)定

將烘干至恒重的菌絲體粉碎并過(guò)三號(hào)藥篩，得冬蟲(chóng)夏菌菌絲體粉末，按2015版《中國(guó)藥典》附錄VI D方法測(cè)定。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPPS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Origin 8.5進(jìn)行軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 碳源的確定

分別考察葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉等6種碳水化合物對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌絲狀菌體生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。碳源是冬蟲(chóng)夏草菌能量代謝的來(lái)源，不同種類(lèi)的碳源對(duì)其冬蟲(chóng)夏草菌絲體得率影響不盡相同。由圖1可知冬蟲(chóng)夏草菌利用碳源的情況各不相同，經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明以葡萄糖為碳源時(shí)冬蟲(chóng)夏草菌絲體產(chǎn)量顯著高于其它碳源(P<0.05)，而以蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉為碳源時(shí)，菌體產(chǎn)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。故選葡萄糖作為冬蟲(chóng)夏草菌生長(zhǎng)的碳源。

圖1 碳源種類(lèi)對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of carbon sources on Ophiocordyceps sinensis cell growth 注：0，空白；1，葡萄糖；2，蔗糖；3，半乳糖；4，麥芽糖；5，乳糖；6，可溶性淀粉。Note：0，Control；1，Glucose；2，Sucrose；3，Galactose；4，Malt sugar；5，Lactose；6，Starch.

2.1.2 氮源的確定

分別考察有機(jī)氮源蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和無(wú)機(jī)氮源尿素、硫酸銨、磷酸二氫銨對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。結(jié)果如圖2。氮源是冬蟲(chóng)夏草菌生長(zhǎng)過(guò)程中不可缺少的元素，研究了上述氮源，從圖2中可知冬蟲(chóng)夏草菌能較好地利用有機(jī)氮源，幾乎不利用無(wú)機(jī)氮源，這與冬蟲(chóng)夏草菌侵染到蝠蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)后利用昆蟲(chóng)體為營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)模式一致。有機(jī)氮源所產(chǎn)菌絲體量均顯著優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源所產(chǎn)菌絲體的量(P<0.05)，以酵母粉為氮源時(shí)的菌絲體產(chǎn)量顯著優(yōu)于以蛋白胨、牛肉膏為氮源時(shí)的產(chǎn)量(P<0.05)，故選擇酵母粉作為冬蟲(chóng)夏草菌培養(yǎng)的氮源。

圖2 不同氮源對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 The effect of nitrogen sources on Ophiocordyceps sinensis cell growth 注：1，空白；2，蛋白；3，酵母粉；4，牛肉膏；5，尿素；6，硫酸銨；7，磷酸二氫銨。Note：1，Control；2，Peptone；3，Yeast powder；4，Beef extract；5，Urea；6，Ammonium sulfate；7，Ammonium dihydrogen phosphate.

2.1.3 碳源質(zhì)量濃度對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌體生長(zhǎng)的影響

碳源是冬蟲(chóng)夏草菌能量代謝的來(lái)源。在培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度的葡萄糖，其它條件一致，培養(yǎng)完成后研究其對(duì)腺苷含量及菌絲體生物量的影響。結(jié)果如圖3所示。在一定的葡萄糖質(zhì)量濃度范圍內(nèi)腺苷產(chǎn)量和菌絲體干重均隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增大而增大。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度分別為40 g/L、50 g/L時(shí)，冬蟲(chóng)夏草菌絲體干重分別達(dá)到最大值與次大值，但兩者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度分別為40 g/L時(shí)菌絲體干重均顯著優(yōu)于其它水平(P<0.05)(葡萄糖質(zhì)量濃度50 g/L除外)；葡萄糖質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)，更有利于腺苷的合成，但與葡萄糖質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)無(wú)顯著差異(P>0.05)，腺苷作為次生代謝產(chǎn)物，可能與腺苷合成途徑中需要耗能有關(guān)。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度超過(guò)50 g/L時(shí)，均不利于腺苷及菌體生物量的積累。綜合菌絲體干重得率考慮，選擇葡萄糖質(zhì)量濃度為40 g/L進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖3 葡萄糖添加量對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 The effect of the amount of glucose on Ophiocordyceps sinensis cell growth

2.1.4 氮源質(zhì)量濃度對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌體生長(zhǎng)的影響

向培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度的酵母粉，其它條件相同，研究其對(duì)腺苷含量及菌絲體生物量的影響。結(jié)果如圖4所示。隨著酵母粉質(zhì)量濃度的增加，蟲(chóng)草菌體干重及腺苷產(chǎn)量增加。當(dāng)酵母粉質(zhì)量為60 g/L或大于60 g/L時(shí)，菌絲體干重達(dá)到最大值并趨于平穩(wěn)，菌體產(chǎn)量顯著優(yōu)于其它酵母粉質(zhì)量濃度(P< 0.05)，說(shuō)明60 g/L的酵母粉用量能夠滿(mǎn)足冬蟲(chóng)夏草菌菌絲體的生長(zhǎng)。而酵母粉質(zhì)量為75 g/L時(shí)更有利于菌絲體內(nèi)腺苷含量的累積，但與酵母粉質(zhì)量濃度為60 g/L、90 g/L時(shí)無(wú)顯著差異(P>0.05)。綜合經(jīng)濟(jì)性考量，選擇酵母粉用量為60 g/L。

圖4 酵母粉添加量對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌生長(zhǎng)的影響Fig.4 The effect of the amount of yeast powder on Ophiocordyceps sinensis cell growth

2.1.5 培養(yǎng)溫度對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌生長(zhǎng)的影響

冬蟲(chóng)夏草菌來(lái)源于高原特有物種冬蟲(chóng)夏草，冬蟲(chóng)夏草主產(chǎn)區(qū)平均溫度長(zhǎng)年低于20℃，使得冬蟲(chóng)夏草菌具“嗜低溫”的生物學(xué)特性且對(duì)溫度敏感。因此在進(jìn)行冬蟲(chóng)夏草菌絲體培養(yǎng)時(shí)對(duì)溫度的篩選極其重要。其它條件相同，分別研究了不同溫度對(duì)腺苷含量及菌絲體生物量的影響。結(jié)果如圖5所示。冬蟲(chóng)夏草菌絲體生物量及腺苷含量隨著溫度的升高而升高，當(dāng)溫度超過(guò)19℃時(shí)均不利于菌絲體及腺苷的積累，當(dāng)溫度達(dá)到22℃時(shí)，菌絲體幾乎不生長(zhǎng)，其對(duì)溫度的敏感性亦顯示了其嗜低溫的特性。當(dāng)培養(yǎng)溫度為16℃時(shí)，菌體產(chǎn)量顯著優(yōu)于其它溫度培養(yǎng)下的菌絲體產(chǎn)量(P<0.05)，故選擇16℃作為冬蟲(chóng)夏草菌的培養(yǎng)溫度。

圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌生長(zhǎng)的影響Fig. 5 The effect of the temperature on Ophiocordyceps sinensis cell growth

2.1.6 無(wú)機(jī)鹽配比對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌生長(zhǎng)的影響

圖6 不同無(wú)機(jī)鹽配比對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌生長(zhǎng)的影響Fig.6 The effect of mineral salts ratio on Ophiocordyceps sinensis cell growth

2.1.7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌生長(zhǎng)的影響

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇1-15 d為培養(yǎng)周期，在其它條件不變的情況下，考察其對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖7。隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，冬蟲(chóng)夏草菌絲體及腺苷含量逐漸增加，當(dāng)?shù)降?2天時(shí)腺苷含量和菌體干重均達(dá)到最大值，此后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)腺苷含量及菌體生物量近趨于平穩(wěn)，因此選擇12 d作為培養(yǎng)時(shí)間。

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌生長(zhǎng)的影響Fig.7 The effect of incubation time on Ophiocordyceps sinensis cell growth

2.2 Plackett-Burman篩選實(shí)驗(yàn)

為了篩選出影響冬蟲(chóng)夏草菌體生長(zhǎng)的顯著因子，根據(jù)碳源、氮源濃度、無(wú)機(jī)鹽元素配比、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間的單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)n=12的Plackett-Burman篩選實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因子取高(+1)，低(-1)2個(gè)水平。培養(yǎng)完成后以菌絲體干重生物量為響應(yīng)值Y。參數(shù)和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。各因素的效應(yīng)評(píng)價(jià)及系數(shù)估計(jì)見(jiàn)表3。P<0.05說(shuō)明該因素對(duì)菌絲體生物量的影響是顯著的，可對(duì)該因素作進(jìn)一步的考察。從表3可得：葡萄糖質(zhì)量濃度、酵母粉質(zhì)量濃度、無(wú)機(jī)鹽配比和培養(yǎng)溫度對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌絲體生物量具有顯著性影響。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)葡萄糖濃度、酵母粉濃度、培養(yǎng)溫度及無(wú)機(jī)鹽配比4個(gè)對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌絲體生長(zhǎng)具有顯著影響的因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。根據(jù)單因素中4個(gè)因素的試驗(yàn)結(jié)果，取各因素的最優(yōu)值作為中間水平進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)。各因素選取水平情況見(jiàn)表，試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表4和表5。

表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

Table 2 Plackett-Burman design and response value

序號(hào)Sequencenumber葡萄糖質(zhì)量濃度(g/L)Theamountofglucose酵母粉質(zhì)量濃度(g/L)Theamountofyeastpowder培養(yǎng)溫度(℃)Temperature培養(yǎng)時(shí)間(d)Time無(wú)機(jī)鹽配比(g/L)Mineralsaltsratio菌絲干重(g/L)Dryweightofmycelium1-111-11734±0282-1-1-111914±03131-1-1-11819±03941-111-1761±0445111-11665±036-1111-1762±036711-111821±0338-1-1-1-1-192±03491-11-1-1781±0421011-11-1846±03611-1-1111735±02812-11-1-1-1855±037

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。Note：Data in the same column with different capital.

表3 方差分析

注：置信度95%，P<0.05表示顯著。Note：The confidence level was 95%，The data was significantly atP<0.05.

表4 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

Table 4 The factor level of orthogonal experiment

水平Levelsρ(葡萄糖)(g/L)ρ(glucose)Aρ(酵母粉)(g/L)ρ(yeastpowder)B培養(yǎng)溫度(℃)TemperatureCρ(MgSO4∶KH2PO4)(g/L)D135551525∶12524060163∶15345651735∶175

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。Note：Data in the same column with different capital.

從表4、表5中的結(jié)果可表明：葡萄糖是影響冬蟲(chóng)夏草菌絲狀菌體生長(zhǎng)最顯著因素，其余3個(gè)因素的顯著性影響程度依次是酵母粉、培養(yǎng)溫度、無(wú)機(jī)鹽配比。從表5可知4個(gè)實(shí)驗(yàn)因素的最佳培養(yǎng)組合為：A2B3C3D2，即葡萄糖質(zhì)量濃度40 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度65 g/L，培養(yǎng)溫度17℃，KH2PO4質(zhì)量濃度1.5 g/L，MgSO4質(zhì)量濃度3 g/L。按優(yōu)化后的培養(yǎng)條件，12 d后測(cè)得冬蟲(chóng)夏草菌絲狀菌體干重平均值為15.67 g/L，腺苷含量平均值為6.52 mg/g樣品。比未優(yōu)化前的菌絲生物量(平均8.54 g/L)提高了83.5%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析表明效果顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

在了解冬蟲(chóng)夏草菌的“嗜低溫”、“嗜葷”、“耐缺氧”的生物學(xué)特性基礎(chǔ)上(柯傳奎，2005)，確定了培養(yǎng)冬蟲(chóng)夏草菌絲狀菌體的最優(yōu)培養(yǎng)條件：葡萄糖質(zhì)量濃度40 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度65 g/L，培養(yǎng)溫度17℃， KH2PO4質(zhì)量濃度1.5 g/L，MgSO4質(zhì)量濃度3 g/L，培養(yǎng)時(shí)間12 d，此時(shí)絲狀菌體干重達(dá)15.67 g/L，腺苷含量6.52 mg/g樣品。試驗(yàn)結(jié)果獲得了大量的絲狀菌體產(chǎn)物，未見(jiàn)菌絲球形成，可為蝠蛾幼蟲(chóng)接種體的制備提供絲狀體菌源。

冬蟲(chóng)夏草菌作為冬蟲(chóng)夏草的唯一無(wú)性型菌種現(xiàn)已得到確證(沈南英等，1983；劉錫琎等，1989；李增智等，2000)。但科研工作者為了找尋侵染蝠蛾幼蟲(chóng)的菌種，從上世紀(jì)七十年代開(kāi)始進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)二十余年的研究，從冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體上分離了涉及無(wú)性型菌種11屬22種真菌，其中包括蝙蝠蛾擬青霉(戴如琴等，1989；戴如琴等，2008)、蝙蝠蛾被孢霉(陳慶濤等，1986)、中國(guó)金孢霉(梁宗琦，1991)等真菌，這些菌種存在于冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體上或伴隨著冬蟲(chóng)夏草的成熟(朱佳石等，2007；楊金玲等，2008；高凌等，2011；姚藝桑等，2011；朱佳石等，2012)，但以上菌種均不是侵染蝠蛾幼蟲(chóng)最終形成冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型菌種。已有研究表明除冬蟲(chóng)夏草菌產(chǎn)生的分生孢子能夠侵染蝠蛾幼蟲(chóng)外，冬蟲(chóng)夏草菌絲體亦能侵染蝠蛾幼蟲(chóng)(俞永信，2004)，說(shuō)明采用冬蟲(chóng)夏草菌絲進(jìn)行侵染成為可能。目前在冬蟲(chóng)夏草菌絲體液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方面的報(bào)道較多，但部分報(bào)道所述菌種非真正的冬蟲(chóng)夏草菌(趙潤(rùn)等，2008；朱朝陽(yáng)等，2013；王文風(fēng)等，2016)，加之在這些報(bào)道中其培養(yǎng)目的是獲得具有增強(qiáng)免疫功能的菌粉原料，為了獲得最大生物量在培養(yǎng)過(guò)程中以高營(yíng)養(yǎng)、高剪切力、高通氧為主(沈南英等，1998；姚一建等，2006；王曉玲等，2016)，致冬蟲(chóng)夏草菌體生長(zhǎng)以菌球形態(tài)生長(zhǎng)為主，按其報(bào)道方法培養(yǎng)的冬蟲(chóng)夏草菌菌絲球未見(jiàn)有蝠蛾幼蟲(chóng)被侵染。因此，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道以生產(chǎn)菌粉原料為目的的培養(yǎng)方法與本文目的不同。最近的研究還顯示通過(guò)冬蟲(chóng)夏草菌株的篩選，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，獲得較高產(chǎn)分生孢子的菌株，為蝠蛾幼蟲(chóng)的侵染提供大量的分生孢子(張宗耀等，2016)，這是目前蝠蛾幼蟲(chóng)被侵染的主要途徑，但誘導(dǎo)冬蟲(chóng)夏草菌產(chǎn)分生孢子條件復(fù)雜、苛刻，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，極易污菌，規(guī)模化生產(chǎn)難，且冬蟲(chóng)夏草菌多次傳代菌種退化嚴(yán)重(呂延華等，2016)，分生孢子產(chǎn)量極不穩(wěn)定。因此，提供一種新的、產(chǎn)量穩(wěn)定的菌絲原料對(duì)接種體的創(chuàng)制具有重要意義。

References)

Chen QT, Wang Q, Liu B. A study on morphology ofMortierellahepialisp. nov.[J].JournalofShanxiUniversity(Natural Science Edition), 1986, 4: 70-74. [陳慶濤, 王琪, 劉波. 蝙蝠蛾被孢霉新種的形態(tài)學(xué)研究[J]. 山西大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版), 1986, 4: 70-74]

Dai RQ, Lan JL, Chen WH,etal. The study on the new species ofPaecilomyceshepialid[J].JournalofChinaAgriculturalUniversity, 1989, 2: 221-224. [戴如琴, 蘭江麗, 陳偉華, 等. 蝙蝠蛾擬青霉新種的研究[J]. 北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1989, 2: 221-224]

Dai RQ, Li XM, Shao AJ,etal. Nomenclatural validation ofPaecilomyceshepialid[J].Mycosystema, 2008, 5: 641-644.[戴如琴, 李曉明, 邵愛(ài)娟, 等. 蝙蝠蛾擬青霉名稱(chēng)的合格化[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2008, 5: 641-644]

Dong CH, Yao YJ. In vitro evaluation of antioxidant activities of aqueous extracts from natural and cultured mycelia ofCordycepssinensis[J].LWT-FoodScienceandTechnology, 2008, 41 (4): 669-677.

Gao L, Li XH, Zhao JQ,etal.Detection of multipleOphiocordycepssinensismutants in premature stroma ofCordycepssinensisby Massarray SNP MALDI-TOF mass spectrum genotyping[J].JournalofPekingUniversity(Health Sciences), 2011, 2: 259-266. [高凌, 李曉紅, 趙建晴, 等. MassARRAY單核苷酸多態(tài)性MALDI-TOF質(zhì)譜基因分型法檢測(cè)未成熟冬蟲(chóng)夏草子座中多個(gè)冬蟲(chóng)夏草菌突變基因型[J]. 北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2011, 2: 259-266]

Ji DB, Ye J, Li CL,etal. Antiaging effect ofCordycepssinensisextract[J].PhytotherapyResearch, 2009, 23 (1): 116-122.

Ke CK. The Study onOphiocordycepsSinensisin China [M]. Beijing: Science and Technology of China Press, 2005. [柯傳奎. 中國(guó)冬蟲(chóng)夏草研究[M]. 北京: 中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社, 2005]

Koh JH, Kim JM, Chang UJ,etal. Hypocholesterolemic effect of hot water extract from mycelia ofCordycepssinensis[J].Biological&PharmaceuticalBulletin, 2003, 26: 84-87.

Liang ZQ.A new chrysosporium species isolated fromCordycepssinensis[J].Mycosystema, 1991, 1: 50-56. [梁宗琦. 一個(gè)分離自冬蟲(chóng)夏草的金孢霉新種[J]. 真菌學(xué)報(bào), 1991, 1: 50-56]

Liu XJ, Guo YL, Yu YX,etal. Isolation and identification ofOphiocordycepssinensisasexual stage[J].Mycosystema, 1989, 1: 35-40. [劉錫琎, 郭英蘭, 俞永信, 等. 冬蟲(chóng)夏草菌無(wú)性階段的分離和鑒定[J]. 真菌學(xué)報(bào), 1989, 1: 35-40]

Li ZZ, Huang B, Li CR,etal. Molecular evidence for anamorph determination ofCordycepssinensis(Berk. ) SACC I. Relation betweenHirsutellasinensisandC.sinensis[J].Mycosystema, 2000, 1: 60-64. [李增智, 黃勃, 李春如, 等. 確證冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型的分子生物學(xué)證據(jù)I. 中國(guó)被毛孢與冬蟲(chóng)夏草之間的關(guān)系[J]. 菌物系統(tǒng), 2000, 1: 60-64]

Lv YH, Liang GH, Zhu ZG,etal. The solid fermentation ofOphiocordycepssinensisstrains isolated from different parts of specimen and different generations [J].Mycosystema, 2016, 4: 433-439. [呂延華, 梁關(guān)海, 朱志鋼, 等. 冬蟲(chóng)夏草不同部位來(lái)源的菌株及多次傳代固體發(fā)酵特性[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2016, 4: 433-439]

Shen NY, Zeng L, Zhang XC,etal. The separation ofOphiocordycepssinensisfungi[J].EdibleFungi, 1983, 5: 1-5. [沈南英, 曾璐, 張顯恥, 等. 冬蟲(chóng)夏草真菌的分離[J]. 食用菌, 1983, 5: 1-5]

Shen NY, Zeng L, Huang R. The fermentation method ofOphiocordycepssinensis[P]. China, 1998, CN1197843,1998-11-04. [沈南英, 曾璐, 黃榮. 中國(guó)冬蟲(chóng)夏草真菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法[P]. 中國(guó), CN1197843,1998-11-04]

Sung GH, Hywel-Jones NL, Sung JM，etal. Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi[J].StudiesinMycology, 2007, 57: 5-59.

Wang WF, Xu GH, XU L,etal. A kind of fermentation method onHirsutellasinensispowder[P]. China, 2016, CN1807574, 2016-06-15. [王文風(fēng), 徐國(guó)華, 徐玲, 等. 一種快速深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)中國(guó)被毛孢菌粉的方法 [P]. 中國(guó), 2016, CN105670942A, 2016-06-15]

Wang XL, Zhu CY, Liu GQ,etal. Analysis of key active compounds and fermentation technology ofOphiocordycepssinensismycelium [J].JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnology, 2016,1: 91-98. [王曉玲, 朱朝陽(yáng), 劉高強(qiáng), 等. 冬蟲(chóng)夏草深層發(fā)酵與功效成分分析 [J] . 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2016, 1: 91-98]

Wu Y, Sun H, Qin F,etal. Effect of various extracts and a polysaccharide from the edible mycelia ofCordycepssinensison cellular and humoral immune response against ovalbumin in mice[J].PhytotherapyResearch, 2006, 20 (8): 646-652.

Wu YL, Ishurd O, Sun CR,etal. Structure analysis and antitumor activity of (1-3)-beta-d-glucans(cordyglucans) from the mycelia ofCordycepssinensis[J].PlantaMedica, 2005, 71 (4): 381-384.

Yang JL, Xiao W, He HX,etal. Molecular phylogenetic analysis ofPaecilomyceshepialiandCordycepssinensis[J].ActaPharmaceuticaSinica, 2008, 4: 421-426. [楊金玲, 肖薇, 何惠霞, 等. 蝙蝠蛾擬青霉與冬蟲(chóng)夏草關(guān)系的分子系統(tǒng)學(xué)研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 4: 421-426]

Yao YJ, Dong CH, Wang B,etal. A kind of cultural method and special medium onOphiocordycepssinensis[P]. China, 2006, CN1807574, 2006-07-26. [姚一建, 董彩虹, 王波, 等. 一種冬蟲(chóng)夏草的培養(yǎng)方法及其專(zhuān)用培養(yǎng)基 [P]. 中國(guó)， 2016, CN1807574, 2006-07-26]

Yao YS, Zhou YJ, Gao L,etal. Dynamic alteration of the differential fungal expressions ofOphiocordycepssinensisand its mutant genotypes in stroma and caterpillar during maturation of naturalCordycepssinensis[J].JouralofFungalResearch, 2011, 1: 37-49, 53. [姚藝桑, 周妍嬌, 高凌, 等. 冬蟲(chóng)夏草成熟過(guò)程中冬蟲(chóng)夏草菌及其突變基因型在子座和僵蟲(chóng)體中的差異表達(dá)[J]. 菌物研究, 2011, 1: 37-49, 53]

Yu YX. Studies on artificial culture ofCordycepssinensis[J].JouralofFungalResearch, 2004, 2: 42-46. [俞永信. 人工培養(yǎng)冬蟲(chóng)夏草研究[J] . 菌物研究, 2004, 2: 42-46]

Zhang GQ, Huang YD, Bian Y,etal. Hypoglycemic activity of the fungiCordycepsmilitaris,Cordycepssinensis,TricholomamongolicumandOmphalialapidescensin streptozotocin-induced diabetic rats[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology, 2006, 72 (6): 1152-1156.

Zhang ZY, Liang GH, Liang L,etal. Effects of medium and environmental conditions on the sporulation ofOphiocordycepssinensisin solid fermentation [J].Mycosystema, 2016, 4: 440-449. [張宗耀, 梁關(guān)海, 梁蕾, 等. 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對(duì)冬蟲(chóng)夏草固體發(fā)酵產(chǎn)分生孢子的影響[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2016, 4: 440-449]

Zhao R, Guo CJ, Liu GQ. Optimizing on liquid culture media ofCordycepssinensismycelia [J].JournalofTianjinNormalUniversity(Natural Science Edition), 2008, 1: 8-11. [趙潤(rùn), 郭成金, 劉高強(qiáng). 冬蟲(chóng)夏草菌絲體液體培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2008, 1: 8-11]

Zhu CY, Liu GQ, Kang SM,etal. Optimization of fermentation conditions of exo-polysaccharides byOphiocordycepssinensisin liquid fermentation [J].FoodScienceandTechnology, 2013, 5: 18-21. [朱朝陽(yáng), 劉高強(qiáng), 曠思敏, 等. 冬蟲(chóng)夏草真菌產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件的優(yōu)化[J] . 食品科技, 2013, 5: 18-21]

Zhu JS, Guo YL, Yao YS,etal. Coexistence ofHirsutellasinensisandPaecilomyceshepialiDNA during maturation ofCordycepssinensisand changes in fungal competitive proliferation capability and chemical profiles [J].JournalofFungalResearch, 2007, 4: 214-224. [朱佳石, 郭英蘭, 姚藝桑, 等. 冬蟲(chóng)夏草成熟過(guò)程中冬蟲(chóng)夏草和蝙蝠蛾擬青霉DNA共存及競(jìng)爭(zhēng)增殖力、化學(xué)成分變化[J]. 菌物研究, 2007, 4: 214-224]

Zhu JS, Zhao JG, Gao L,etal. Dynamically altered expressions of at 6Ophiocordycepssinensismutants in the stroma ofCordycepssinensis[J].JournalofFungalResearch, 2012, 2: 100-112. [朱佳石, 趙家剛, 高凌, 等. 至少6個(gè)突變基因型冬蟲(chóng)夏草菌在冬蟲(chóng)夏草子座中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化[J]. 菌物研究, 2012, 2: 100-112]

The research on the proliferative culture ofOphiocordycepssinensisfilamentous mycelium

HE Zong-Yi1,2,3,4，LI Li1,2,3,4，ZHANG De-Li1,2,3,4，LI Qing1，MAO Xian-Bing5，CHEN Shi-Jiang1,2,3,4*

(1.Chongqing Academy of Chinese Materia Medica，Chongqing 400065，China；2.Chongqing Key Laboratory of Chinese Medicine Resources，Chongqing 400065，China；3.Chongqing Sub-center of the National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Chongqing 400065，China；4.Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture Kangding GonggaOphiocordycepssinensisIndustry Co. LTD.，Ganzi 626000，Sichuan Province，China；5.Southwest Pharmaceutical Co. Ltd.，Chongqing 400000，China)

The herb ofOphiocordycepssinensisis that genusHepialuscaterpillars were infected by parasitic fungusO.sinensisto form a combination of insect and fungi，which it is precious and specific natural resources in China.The asexual stage of the herb ofO.sinensiswasO.sinensiswhich has has two kinds of morphology—the filamentous and pellet mycelium under different nutritional conditions. Moreover，only the filamentous mycelium can infect theHepialuscaterpillars，so it may be applied widely as a new inoculant.However，the defect of slow growth and low yield from the filamentous mycelium ofO.sinensishas hindered its application in the inoculant of theHepialuscaterpillars，and the modern industrial cultivation.In order to improve the yield of theO.sinensismycelium，the nutritional conditions were optimized by orthogonal experiment design. The results showed that the yield of filamentous mycelium reached 15.67 g/L under the conditions of glucose 40 g/L，yeast powder 65 g/L，temperature 17℃，KH2PO41.5 g/L，MgSO43 g/L and incubation time 12 days.The optimized yield of filamentous mycelium in this study will provide a large of raw materials for the preparedHepialusmoths larva inoculant.

Ophiocordycepssinensis；filamentous mycelium；Hepialusmoths larva；culture

重慶市科技平臺(tái)項(xiàng)目(cstc2014ptyjd10001)；重慶市科技惠民計(jì)劃項(xiàng)目(2013gs500102-D2014-3)；重慶市社會(huì)民生科技創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)(cstc2015shmszx120032)；重慶市科技攻關(guān)項(xiàng)目(cstc2013yykfB110002)

賀宗毅，男，1986年生，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)槎x(chóng)夏草人工培殖，E-mail: cqhcmthzy2004@163.com

* 通訊作者 Author for correspondence, E-mail: shijiangchen@163.com

Received：2016-08-18；接受日期 Accepted：2016-11-21

Q965;S567.3+5

A

1674-0858(2016)06-1205-09