水稻防御信號NO對褐飛虱產(chǎn)卵刺激的響應(yīng)

周金明，顏 靜，尤珂珂，高媛媛，周 強

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣州 510275)

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水稻防御信號NO對褐飛虱產(chǎn)卵刺激的響應(yīng)

周金明，顏 靜，尤珂珂，高媛媛，周 強*

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣州 510275)

植物對昆蟲產(chǎn)卵刺激產(chǎn)生的防御反應(yīng)不僅可以直接抑制卵的發(fā)育，還可以為防御下一步若蟲/幼蟲帶來的危害做準(zhǔn)備。對褐飛虱產(chǎn)卵處理后水稻植株內(nèi)一氧化氮(NO)合成的關(guān)鍵酶-硝酸還原酶基因的表達(dá)量和NO含量進(jìn)行測定，對比褐飛虱取食和機械損傷處理，結(jié)果顯示褐飛虱產(chǎn)卵能夠誘導(dǎo)水稻硝酸還原酶基因的表達(dá)和NO的生成。處理后12 h，水稻硝酸還原酶基因表達(dá)量顯著高于取食和和機械損傷處理；12-24 h產(chǎn)卵誘導(dǎo)的NO含量顯著高于對照和機械損傷組水稻。褐飛虱產(chǎn)卵誘導(dǎo)水稻啟動NO合成關(guān)鍵基因的表達(dá)和物質(zhì)合成表明，與取食危害類似，水稻同樣會對褐飛虱產(chǎn)卵刺激產(chǎn)生響應(yīng)，誘導(dǎo)NO升高，啟動相應(yīng)的植物防御體系。

水稻；褐飛虱；產(chǎn)卵；硝酸還原酶基因；NO

大部分植食性昆蟲從產(chǎn)卵就開始了對植物的侵害，包括直接和間接兩種方式。比如產(chǎn)蟲癭的昆蟲將卵產(chǎn)在植物體內(nèi)破壞植物的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，半翅目昆蟲產(chǎn)卵時用產(chǎn)卵器劃開植物表皮，從而對植株造成直接機械損傷(Hilkeretal., 2007)。許多鱗翅目和膜翅目的昆蟲在成蟲階段是不取食的，但是雌成蟲會將卵產(chǎn)在植物上，并且對于成蟲與幼蟲取食生態(tài)位相同的昆蟲比如鞘翅目和半翅目來說，產(chǎn)卵的地點也就是植物接下來要遭受孵化出的幼蟲的取食為害的部位，這是產(chǎn)卵危害的間接方式(Walling, 2000)。植物也能產(chǎn)生應(yīng)對昆蟲產(chǎn)卵的直接和間接防御反應(yīng)，通過殺死卵或者將它們脫離開植物，或者吸引天敵，從而減輕昆蟲取食為害(Reymond, 2013；Hilker, 2015；Pashalidouetal., 2015)。

植物在遭受植食性昆蟲取食后產(chǎn)生防御反應(yīng)的研究已較深入(Kalskeetal., 2014；Huetal., 2015；Khanetal., 2016)，但是植物響應(yīng)昆蟲產(chǎn)卵脅迫的研究卻較少(Hilker, 2005)。通過對菜粉蝶產(chǎn)卵-擬南芥和甜菜夜蛾產(chǎn)卵-煙草這兩個體系的研究，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵特異性誘導(dǎo)了植物的全面防御反應(yīng)，包括啟動水楊酸、茉莉酸和其它應(yīng)激反應(yīng)途徑(Dawnetal.，2007；Gouhier-Darimontetal.，2013；Bandolyetal.，2015；Bandoly & Steppuhn，2016)。

一氧化氮(NO)是植物細(xì)胞受生物和非生物脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生防御反應(yīng)的重要信號物質(zhì)之一。自1998年報道了NO在植物抗病反應(yīng)中的信號分子作用以來(Delledonneetal.，1998；Durneretal., 1998)，通過藥理、生化和遺傳學(xué)途徑證明植物受到無毒致病菌和激發(fā)子的誘導(dǎo)下，細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生NO，并啟動防御體系(Wendehenneetal.，2004；Delledonne 2005)。NO通過調(diào)控活性氧水平和毒性，減輕脅迫產(chǎn)生的氧化傷害發(fā)揮作用，NO還作為信號分子與水楊酸協(xié)同參與抗逆信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)抗逆基因表達(dá)和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic Acquired Resistance，SAR)的形成(Delledonneetal.，2001)。抗病刺激因子誘導(dǎo)處理、非生物脅迫和發(fā)育等過程中NO的產(chǎn)生主要來源于硝酸還原酶(Nitrate reductase, NR)(Brightetal., 2006; Srivastavaetal., 2009)。NR以 NAD(P)H 為電子供體催化硝酸鹽還原生成亞硝酸鹽，也是高等植物體內(nèi)控制碳代謝和氮代謝的關(guān)鍵酶與限速酶(Kaiseretal.，1999)。

褐飛虱Nilaparvatalugens(St?l)是我國最主要的水稻害蟲，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量(呂進(jìn)等，2013)。褐飛虱將卵產(chǎn)在水稻的葉鞘組織內(nèi)，產(chǎn)卵器不僅傷害了水稻組織，而且將卵留在水稻組織內(nèi)，除傳播水稻病原微生物外，也可能導(dǎo)致水稻產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng)。本實驗室的研究工作發(fā)現(xiàn)，褐飛虱產(chǎn)卵能夠誘導(dǎo)水稻胰蛋白酶抑制因子合成酶基因的表達(dá)，與取食危害類似，水稻同樣會對褐飛虱產(chǎn)卵刺激產(chǎn)生響應(yīng)，啟動相應(yīng)的植物防御體系(解曉軍等，2011)。但是對于水稻啟動哪些防御途徑來應(yīng)對褐飛虱產(chǎn)卵為害尚有待深入研究。

本研究以單子葉模式植物水稻及其主要害蟲褐飛虱產(chǎn)卵為模型，以植物抗逆相關(guān)信號分子NO為指標(biāo)，分析水稻對褐飛虱產(chǎn)卵刺激的響應(yīng)，以期闡明水稻應(yīng)對褐飛虱產(chǎn)卵的防御過程，為深入了解產(chǎn)卵誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御反應(yīng)的分子機理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水稻品種和蟲源

1.2 水稻處理

褐飛虱產(chǎn)卵處理： 在每株水稻幼苗的葉鞘部位接3頭剪除口針的羽化后3 d的褐飛虱懷卵雌蟲(處于產(chǎn)卵高峰期)，分別處理水稻0(對照)、6、12、24、36、48 h。

褐飛虱取食處理： 在每株水稻幼苗的葉鞘部位接3頭3齡的褐飛虱若蟲，分別處理水稻0(對照)，6、12、24、36、48 h。

機械損傷處理： 在每株水稻幼苗的葉鞘部位用已消毒的4號昆蟲針刺20下，分別處理水稻0(對照)，6、12、24、36、48 h。 以上每個處理重復(fù)3次。

1.3 基因表達(dá)的測定

用RT-PCR的方法測定不同處理對水稻防御相關(guān)基因表達(dá)的影響。取不同處理的水稻葉片100 mg，在液氮冷凍條件下碾成粉末，在液氮揮發(fā)完全前將其移入2 mL的離心管，Trizol試劑盒(GibcoBRL)提供的方法提取水稻總RNA。取1 μg不同處理的水稻葉片總RNA，Invitrogen 公司的SuperScript Ⅱ 逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒合成cDNA第一鏈。 PCR擴增用rTaq DNA 聚合酶(TaKaRa)，擴增條件：94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30 個循環(huán)后于72℃延伸8 min。逆轉(zhuǎn)錄及PCR所用特異性引物見表1。 取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖(1%)電泳， 每個處理設(shè)3個重復(fù)。熒光定量PCR的方法測定不同處理對水稻蛋白酶抑制劑基因表達(dá)的影響。水稻RNA的提取方法同上，取1 μg不同處理的水稻葉片總RNA，TaKaRa公司的PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒合成cDNA第一鏈。用于熒光定量PCR的BBPI的特異引物和內(nèi)參基因Actin引物分別設(shè)計為：

QNR-F： 5′-CTGTCCTAACCGAGTTCATATC-3′，

QNR-R:5′-GTCGTCCACCATGACTTCCTG-3′；

QActin-F：5′-ACTGTCCCCATCTATGAAGGA-3′，

QActin-R：5′-CTGCTGGAATGTGCTGAGAGA-3′。

據(jù)SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) Kit提供的方法，用ABI Prism 7900HT進(jìn)行熒光定量PCR，運行條件為：預(yù)變性：95℃ 30 s，1個循環(huán)；PCR反應(yīng)：95℃ 5 s；60℃ 30-34 s，40個循環(huán)。每個處理取3個樣品，每個樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA在每次熒光定量PCR時進(jìn)行3個重復(fù)，重復(fù)運行3次。 NR基因的相對拷貝數(shù)根據(jù)2-ΔΔCT 方法(Livak and Schmittgen，2001)進(jìn)行分析。

表1 PCR所用基因特異引物

Table 1 The primers for PCR validation

基因名稱Nameofgene登錄號GenBankcode已知功能Function特異引物PrimersequenceNRNM?195697No合成關(guān)鍵酶NitratereductaseF：5′?CTGTCCTAACCGAGTTCATATC?3′R：5′?GTCGTCCACCATGACTTCCTG?3′ActinX15865肌蛋白(對照)ActinforCKF：5′?ACTGTCCCCATCTATGAAGGA?3′R：5′?CTGCTGGAATGTGCTGAGAGA?3′

1.4 水稻NO含量的測定

硝酸還原酶法測定NO含量，參照試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京)，步驟如下：

(1)將水稻樣品用蒸餾水洗凈擦干，剪碎、混勻后稱取0.5 g組織樣品；

(2)樣品放入預(yù)冷的研缽中加入5 mL的磷酸緩沖液(pH7.0)，研磨勻漿后，4℃，4000 rpm, 離心15 min，取上清液待測；

(3)標(biāo)準(zhǔn)液配置: 0.1 mL的標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水定容稀釋至10 mL，混勻；

(4)取 0.1 mL的樣品提取液，加入0.4 mL的混合試劑，其中空白管中為0.1 mL 的蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)管中為0.1 mL的100 μmol/L標(biāo)準(zhǔn)液，混勻后在37℃準(zhǔn)確水浴60 min；

(5) 分別加入0.2 mL的試劑3和0.1 mL的試劑4，充分漩渦混勻30 s，室溫靜置40 min；

(6) 離心15 min，4000 rpm，取0.5 mL上清液加入0.6 mL的顯色劑顯色；

(7) 混勻后，室溫靜置10 min，蒸餾水調(diào)零，550 nm，測各管吸光度值；

NO含量(μmol/L)=(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)× 標(biāo)準(zhǔn)品濃度

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SAS 8.1統(tǒng)計軟件(SAS Institute Inc, USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析( SAS/ANOVA),多重比較SNK檢驗(P<0.05)比較各處理間差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐飛虱產(chǎn)卵誘導(dǎo)水稻硝酸還原酶基因(NR)的表達(dá)

NR是植物NO合成途徑的關(guān)鍵酶，參與植物的防御反應(yīng)。褐飛虱產(chǎn)卵為害能誘導(dǎo)NR基因的表達(dá)。雖然機械損傷和褐飛虱取食也能誘導(dǎo)NR的表達(dá)，但是這兩者的誘導(dǎo)作用要明顯弱于褐飛虱產(chǎn)卵處理(圖1)。

圖1 NR基因在不同處理水稻葉片中的表達(dá)Fig.1 Expression patterens of defense-related genes in adult Nilaparvata lugen oviposited rice leaves注：NR，硝酸還原酶；Actin，肌動蛋白；CK，健康植株；MT，機械損傷植株；FT，取食為害植株；OT，產(chǎn)卵為害植株；每個處理重復(fù)3次。Note:NR，Nitrate reductase; Actin，Internal standard of RT-PCR; CK，Healthy rice seedlings; MT，Mechanical damaged rice seedlings; FT，N. lugen fed rice seedlings; OT，Adult N. lugen oviposited rice seedlings; three replicates.

褐飛虱產(chǎn)卵誘導(dǎo)NR基因的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢，在12 h后表達(dá)量達(dá)最高值，處理48 h后NR基因的表達(dá)量基本上回復(fù)到對照水平。褐飛虱產(chǎn)卵處理后6、12、24、36、48 hNR基因的表達(dá)量分別為對照(0 h)的1.32，1.61，1.44，1.26和1.05倍。6 h、12 h、24 h和36 hNR基因的表達(dá)量顯著高于對照水平，其中處理12 h 后NR基因的表達(dá)量最高，并且顯著高于6 h，24 h和36 h，而6 h，24 h和36 h三者之間差異不顯著(圖2)。

將褐飛虱產(chǎn)卵對NR基因的定量誘導(dǎo)表達(dá)作用與其它處理方式進(jìn)行對比，處理6 h后，褐飛虱產(chǎn)卵與機械損傷處理的誘導(dǎo)作用差異不顯著，但是褐飛虱取食的誘導(dǎo)作用顯著強于兩者；處理后12 h，褐飛虱產(chǎn)卵的誘導(dǎo)作用顯著強于另外兩種處理，且另外兩種處理之間差異不顯著；處理后24 h，3種處理方式的誘導(dǎo)作用無明顯差異；處理后36 h褐飛虱產(chǎn)卵與機械損傷處理的誘導(dǎo)作用差異不顯著，但是褐飛虱取食的誘導(dǎo)作用顯著強于兩者；處理后48 h,3種處理下的NR基因的表達(dá)量基本上都回復(fù)到對照水平。褐飛虱產(chǎn)卵處理誘導(dǎo)NR表達(dá)量的最高值出現(xiàn)在處理后12 h，而取食處理和機械損傷處理則分別出現(xiàn)在6 h和24 h(圖2)。

圖2 定量PCR檢測不同處理方式對NR基因的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.2 The quantitative induction of different treatments on rice NR gene注：CK，健康植株；MT，機械損傷植株；FT，褐飛虱取食處理植株；OT，褐飛虱產(chǎn)卵處理植株；6-48 h，產(chǎn)卵分別處理6-48 h。注：不同字母之間代表差異顯著。 Note:CK，Healthy rice seedlings; MT，Mechanical damaged rice seedlings; FT，N. lugen fed rice seedlings; OT，Adult N. lugen oviposited rice seedlings; 6-48 h，different treatment times. Note: Different small letters show the significant different among the different treatments (P<0.05).

2.2 褐飛虱產(chǎn)卵對水稻NO含量變化的影響

褐飛虱產(chǎn)卵處理下，一氧化氮(NO)的含量逐漸上升，上升狀態(tài)一直持續(xù)到處理后24 h，并且在處理后24 h時含量達(dá)最大值，隨后，NO含量逐漸下降，至處理后36 h基本上回復(fù)到對照水平(圖3)。

圖3 褐飛虱產(chǎn)卵不同時間對水稻NO含量變化的影響Fig.3 Effect of Adult Nilaparvata lugen oviposition on rice NO level注：0-48 h，產(chǎn)卵分別處理6-48 h；數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。 Note:0-48 h，different treatment times; Data Means±SE.

將褐飛虱產(chǎn)卵對水稻NO的含量的誘導(dǎo)作用與其它處理方式進(jìn)行對比：褐飛虱取食和機械損傷處理下，NO的含量變化與產(chǎn)卵處理相似，都是先上升后下降，但是取食處理下的NO的含量最高值的出現(xiàn)在處理后6 h，產(chǎn)卵處理下的NO的含量最高值的出現(xiàn)在處理后24 h。褐飛虱產(chǎn)卵與機械損傷處理下NO的含量差異不顯著，但是褐飛虱取食處理下NO的含量明顯高于前兩種處理；處理后12 h，產(chǎn)卵和取食處理下NO的含量明顯高于機械損傷，但兩者差異不顯著；處理后24 h，褐飛虱產(chǎn)卵處理下的NO的含量明顯高于另外兩種處理；在處理后36 h和48 h，3種處理下的NO的含量均差異不明顯且都接近與對照水平(圖4)。

圖4 不同處理方式對水稻NO含量變化的影響Fig.4 Effects of different treatments on rice NO level注：CK，健康植株；MT，機械損傷植株；FT，褐飛虱取食處理植株；OT，褐飛虱產(chǎn)卵處理植株；6-48 h，產(chǎn)卵分別處理6-48 h。不同字母之間代表差異顯著。Note:CK，Healthy rice seedlings; MT，Mechanical damaged rice seedlings; FT，N. lugen fed rice seedlings; OT，Adult N. lugen oviposited rice seedlings; 6-48 h，different treatment times. ifferent small letters show the significant different among the different treatments (P<0.05).

3 結(jié)論與討論

卵對于植物來說是一種潛在的威脅，如果植物能夠感受昆蟲的產(chǎn)卵過程或卵的存在，并提前對此做出防御反應(yīng)，這對寄主植物來說是非常有利的。目前的研究表明植物已經(jīng)進(jìn)化出了一些機制和反應(yīng)來防御昆蟲的產(chǎn)卵入侵，以達(dá)到提前應(yīng)對幼蟲的取食為害的目的(Hilker, 2007)。褐飛虱將卵產(chǎn)在水稻的葉鞘組織內(nèi)。在這個過程中，水稻受到雙重傷害，即褐飛虱的產(chǎn)卵器不僅傷害了水稻組織，而且將卵留在了水稻組織內(nèi)，必然誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生相關(guān)反應(yīng)。實驗表明：機械損傷，褐飛虱取食和褐飛虱產(chǎn)卵處理都能誘導(dǎo)水稻NO的上升，并且三者的誘導(dǎo)作用依次增強，產(chǎn)卵與取食處理誘導(dǎo)的NO含量的最大值比較接近。此外，NO的含量變化都有隨處理時間呈先上升后下降的趨勢。但是褐飛虱產(chǎn)卵處理在12 h時才明顯誘導(dǎo)NO含量升高，24 h達(dá)到最大值，隨后逐漸降低，而褐飛虱取食處理在6 h時誘導(dǎo)NO的含量即達(dá)到最大值。Gershenzonv等(1991)以擬南芥NR基因突變株進(jìn)行的實驗表明，NO的產(chǎn)生可由機械和傷害脅迫誘導(dǎo)。由以上結(jié)果推測，雖然褐飛虱產(chǎn)卵和取食處理都對NO含量的變化有誘導(dǎo)作用，但是兩者也許基于不同的機制。產(chǎn)卵處理對NO含量的誘導(dǎo)晚于取食處理也許是由于產(chǎn)卵處理激活的反應(yīng)途徑不同于取食處理，從而經(jīng)過不同的過程誘導(dǎo)NO含量的變化。

NO信號物質(zhì)在水稻的直接防御過程中起著重要的作用。本研究實驗證實了機械損傷、褐飛虱取食和產(chǎn)卵處理都能誘導(dǎo)兩種物質(zhì)含量的變化，且都是先上升后下降的趨勢，其中首次在水稻中發(fā)現(xiàn)褐飛虱產(chǎn)卵能誘導(dǎo)NO的含量變化。植物體內(nèi)NO的來源復(fù)雜，除了酶促反應(yīng)途徑外，還有底物直接降解生成等(Moreauetal., 2010)。對于褐飛虱取食和產(chǎn)卵對兩種物質(zhì)含量的誘導(dǎo)機制是否存在差異以及兩種處理具體是怎樣激活各種途徑從而誘導(dǎo)了NO含量的上升還不清楚，這也是下一步研究的目標(biāo)。

實驗中發(fā)現(xiàn)與取食和機械損傷相比，產(chǎn)卵明顯刺激水稻產(chǎn)生損傷組織，即產(chǎn)卵痕周圍組織的壞死，可能有兩方面的原因，一是產(chǎn)卵器的直接傷害而導(dǎo)致組織細(xì)胞失水枯死；二是水稻對褐飛虱產(chǎn)卵或留在組織內(nèi)的卵產(chǎn)生了超敏反應(yīng)，導(dǎo)致水稻組織出現(xiàn)程序性壞死，從而將褐飛虱卵與水稻組織隔離開來，使卵因缺少水分供應(yīng)而致胚胎發(fā)育受到影響，對卵產(chǎn)生直接防衛(wèi)作用。但是對于水稻是啟動哪些防御途徑來應(yīng)對褐飛虱產(chǎn)卵為害尚有待研究。

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Rice endogenous NO response to ovipostion stimulation ofNilaparvatalugens(St?l)

ZHOU Jin-Ming, YAN Jing, YOU Ke-Ke, GAO Yuan-Yuan, ZHOU Qiang*

(State Key Laboratory of Biocontrol, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

Herbivorous insects laying their eggs on plant tissue face the risk of aggressive plant responses that either have direct negative effects on eggs or inform parasitoids about the presence of eggs and thus indirectly harm the eggs by involving the third trophic level and, plants can take insect egg deposition as a warning signal of future larval herbivory. Compared to the rice brown planthopper (BPH)Nilaparvatalugens(St?l) feeding and mechanical wound, BPH oviposition upregulated the transcripts of rice Nitrate reductase gene and NO substance levels. After BPH oviposition treatment of 12 h, the expression levels of Nitrate reductase gene were significantly higher than BPH feeding and mechanical wound treatment, the content of NO substance was significantly higher than untreated rice. These results indicate that, as feeding damage as, rice could be respond to BPH oviposition through inducing NO substance and initiating relevant defence systems, which inhibit the damage of BPH.

Rice；Nilaparvatalugens(St?l)；oviposition；nitrate reductase；NO

國家自然科學(xué)基金(31071680，31272038)

周金明，男，1989年生，碩士研究生，研究方向為昆蟲與植物相互關(guān)系

*通訊作者 Author for correspondence，E-mail: lsszhou@mail.sysu.edu.cn

Received：2016-10-16；接受日期 Accepted：2016-11-08

Q963; S433

A

1674-0858(2016)06-1078-06