中國裸燕麥品種色氨酸含量的熒光檢測與評價

任 祎 武 嬌 Olof Olsson

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)1，太谷 030801)

(瑞典隆德大學(xué)2,瑞典 22100)

中國裸燕麥品種色氨酸含量的熒光檢測與評價

任 祎1武 嬌1Olof Olsson2

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)1，太谷 030801)

(瑞典隆德大學(xué)2,瑞典 22100)

本試驗旨在對我國主要裸燕麥栽培品種中色氨酸的含量水平進行評價，并分析其與蛋白質(zhì)含量的關(guān)系。 利用木瓜酶對新鮮燕麥粉進行水解，在激發(fā)波長288 nm和發(fā)射波長352 nm處檢測水解產(chǎn)物的熒光強度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對色氨酸含量進行定量。利用全自動蛋白質(zhì)分析儀檢測籽粒中總氮的含量來定量蛋白質(zhì)，同時對9個裸燕麥栽培品種在4個不同產(chǎn)區(qū)種植的蛋白質(zhì)和色氨酸含量分別進行檢測并作顯著性差異和相關(guān)性分析。結(jié)果表明， 中國裸燕麥品種平均的色氨酸含量為2.39 mg/g，大于國外報道的皮燕麥品種平均色氨酸含量1.70 mg/g。品種和地區(qū)以及兩者互作引起的燕麥色氨酸含量的差異顯著， 且燕麥色氨酸和蛋白質(zhì)含量之間具有一定的相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.353。

燕麥 色氨酸 熒光光譜

色氨酸是人體必需的氨基酸之一，在蛋白質(zhì)合成中起著重要的作用[1]，也是機體煙酸合成的唯一來源[2]。最新的研究報道，色氨酸可減輕抑郁癥狀[3]， 攝入富含色氨酸的谷物可以改善睡眠質(zhì)量， 增強機體的抗氧化水平[4]。 谷物是人體蛋白質(zhì)及氨基酸攝入的主要來源，其中的色氨酸含量是評價蛋白質(zhì)品質(zhì)的指標(biāo)之一[5]。尤其在一些發(fā)展中國家，飲食結(jié)構(gòu)主要以單一谷物為主，提高蛋白質(zhì)的含量和品質(zhì)就顯得更為重要。蛋白質(zhì)中的氨基酸，特別是谷物籽粒蛋白質(zhì)中的色氨酸，定量測定是比較困難的，這是因為在普通的酸水解過程中，色氨酸全部被破壞掉，而用堿水解又破壞了其他氨基酸[6]，應(yīng)用氨基酸自動分析儀和HPLC分析單項色氨酸的成本很昂貴，不易推廣。由于蛋白質(zhì)水解后在270～300 nm處有吸收，這種吸收主要來自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，當(dāng)激發(fā)波長為280 nm時，蛋白質(zhì)水解液大致有相同的熒光光譜，最大值在313 nm和350 nm處，前者恰與酪氨酸一致，后者與色氨酸一致，所以可以設(shè)定發(fā)射波長為350 nm，對色氨酸進行含量檢測[8]。使用熒光光譜檢測色氨酸含量目前在食物和湖水中也已經(jīng)有過報道，此方法結(jié)果準(zhǔn)確，并且比HPLC方法準(zhǔn)確度和靈敏度高，但是利用熒光檢測色氨酸含量在谷物籽粒中還鮮見有關(guān)報道[7-9]。

燕麥?zhǔn)且环N富含膳食纖維高營養(yǎng)的谷物，其營養(yǎng)保健功能日益突顯，燕麥在谷物中蛋白質(zhì)含量較高，且氨基酸組成均衡，因此其營養(yǎng)價值被認(rèn)為優(yōu)于其他谷物[10-11]。林偉靜等[12]曾對我國燕麥籽粒中各種營養(yǎng)成分包括氨基酸含量進行了評價，但對色氨酸含量卻未做檢測和評價。國外有文獻報道燕麥粉中色氨酸的含量大約在1.7 mg/g[13]， 而我國的裸燕麥籽粒中色氨酸含量鮮有報道。本研究應(yīng)用熒光分析法對燕麥籽粒中色氨酸含量進行了檢測，并在此基礎(chǔ)上對我國主要裸燕麥品種在不同產(chǎn)區(qū)的色氨酸含量差異做出了分析。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

燕麥種子：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，9個不同品種于2011年分別在內(nèi)蒙古武川、河北張家口、甘肅定西和吉林白城4個主要產(chǎn)區(qū)種植，品種均為裸燕麥，其中內(nèi)蒙古地區(qū)的晉燕8號和甘肅的晉燕14號因倒伏未收獲，其余材料收獲后在室溫下干燥。 干燥的籽粒研磨用實驗室微型磨:德國Fritsch公司，型號為Mini-Mill Pulverisette 23，研磨速度設(shè)置為45次/s，研磨時間為30 s，獲得的新鮮燕麥全粉用于檢測；熒光強度的檢測使用熒光計：美國PTI公司，型號為Photon technology intetnational 814 ；全自動蛋白質(zhì)分析儀：荷蘭Skalar公司，型號為Primacs S N。

木瓜蛋白酶溶液、EDTA、二硫蘇糖醇(Dithiothreitol)、尿酸和硼酸鈉：Sigma-Aldrich Sweden AB公司; 谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品: Fluka公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑的配制

水解液：使用新鮮配制的水解液，每周配制1次。用去離子水配制200 mL水解液， 分別加入尿酸、硼酸鈉、二硫蘇糖醇和EDTA，使終濃度分別為 8、0.1、0.005和0.002 mol/L，調(diào)整pH值至7.6。

色氨酸的標(biāo)準(zhǔn)液： 先配制標(biāo)準(zhǔn)液的貯存液，使用時再稀釋，標(biāo)準(zhǔn)液最終濃度為0.392 nmol /μL。

1.2.2 樣品的酶解

參照?ste[8]的方法使用木瓜酶水解燕麥粉。 稱取50 mg的新鮮燕麥粉(其中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為15%)，裝入水解管，加入1 mg木瓜酶，酶活性為16～40 U/mg蛋白質(zhì)，然后加入5 mL水解液，置于恒溫37 ℃，振蕩水解24 h, 酶解后10 000 r/min離心20 min，4 ℃， 上清液直接用于熒光分析。

1.2.3 色氨酸的檢測

參照?ste[8]的方法對樣品進行激發(fā)波長和發(fā)射波長掃瞄，確定最佳激發(fā)波長為288 nm，最佳發(fā)射波長為352 nm。在此條件下測定樣品的熒光強度，對于每個樣品，首先加入3 mL含0.1 mol/L硼酸鈉的8 mol/L尿酸溶液(pH 7.6)作為空白，讀數(shù)，然后在空白管中加入200 μL的待測樣品溶液，再次讀數(shù)。熒光檢測在室溫下進行。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

取3 mL含0.1 mol/L硼酸鈉的8 mol/L尿酸溶液(pH 7.6)讀數(shù)，作為空白，依次加入10、 20、30、40、50 μL的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別讀數(shù)，每個標(biāo)準(zhǔn)液分析10次，求平均值，制定工作曲線。 所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=68 202x+4 077.2 (R2=0.999)，具有良好的線性關(guān)系，色氨酸含量在0～5 μg/mL范圍內(nèi)檢測效果最佳。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量檢測

稱取約100 mg左右的新鮮燕麥粉， 利用全自動蛋白質(zhì)分析儀檢測籽粒中總氮的含量，粗蛋白含量與氮含量之間的轉(zhuǎn)化系數(shù)為6.25。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)處理， 用StatSoft軟件進行ANOVA顯著性分析和相關(guān)性分析 。測定樣品重復(fù)次數(shù)為n=3。

2 結(jié)果和分析

2.1 脫脂對熒光檢測色氨酸含量的影響

在預(yù)試驗中選取皮燕麥品種Belinda進行了脫脂和脫殼處理，對脫脂和脫殼前后樣品的色氨酸含量做了比較，結(jié)果見表1， 脫脂后色氨酸含量大于未脫脂籽粒的含量，差異顯著(P<0.05)，結(jié)果與文獻[14]報道一致 ，因此，如果只是對大量樣品的色氨酸含量進行初步篩選，或者幾個樣品之間做平行比較，可以省去脫脂這一步。另外， 脫殼后的籽粒色氨酸含量要高于未脫殼籽粒，但差異不顯著(P>0.05)，表明蛋白質(zhì)和氨基酸主要儲存在胚乳中，殼里相對含量很少。

表1 脫脂和脫殼對氨基酸含量的影響/mg/g

注：*差異顯著水平為0.05。

2.2 不同燕麥品種的蛋白質(zhì)和色氨酸含量的差異

表2和表3列出了9個品種分別在不同產(chǎn)區(qū)種植的蛋白質(zhì)和色氨酸的含量。由表2可以看出，對于9個品種而言，在不同地方的蛋白質(zhì)平均含量值在14.99%～18.18% 之間，其中壩莜1號最高，晉燕14號最低 。 對于不同地區(qū)，各品種的蛋白質(zhì)的平均含量范圍在16.53%～17.50%之間，山西較高，甘肅次之，其次是內(nèi)蒙古，吉林最低，地區(qū)間的差異不顯著。同一品種的蛋白質(zhì)含量在不同地區(qū)間無顯著差異， 不同品種之間的蛋白質(zhì)含量有顯著差異，晉燕14號的蛋白質(zhì)含量顯著低于其它8個品種，差異水平在0.05，結(jié)果見表2 。

表2 不同燕麥品種在不同產(chǎn)區(qū)的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)和變異系數(shù)

表2(續(xù))

注：不同字母代表具有顯著性差異 (P<0.05,n=3)； —表示未收獲，無數(shù)據(jù)。余同。

表3 不同燕麥品種在不同產(chǎn)區(qū)的色氨酸含量及變異系數(shù)/mg/g

從表3可知， 不同品種在地區(qū)間的變異較廣，其中定莜1號最大，為15.42%；白燕2號最小，為0.4%。對于4個產(chǎn)區(qū)來說，各品種的平均色氨酸含量范圍在2.20 mg/g(吉林)到2.55 mg/g(山西)之間， 同一品種的色氨酸含量在不同地區(qū)間的差異顯著，山西最高，內(nèi)蒙古次之，二者都顯著高于甘肅和吉林地區(qū)，吉林種植的品種色氨酸含量表現(xiàn)為最低。

9個燕麥品種分別在山西，內(nèi)蒙古，甘肅和吉林4個地方種植的色氨酸含量的變異分析見表4，相對而言，地區(qū)對色氨酸含量變異的貢獻大于品種以及兩者互作的貢獻，且地區(qū)間差異極顯著，品種間也存在顯著差異，顯著水平為0.05，品種和地區(qū)的互作引起的差異也極顯著。

表4 9個品種在4個產(chǎn)區(qū)色氨酸含量的變異分析

注：*顯著相關(guān)水平為0.05。

2.3 色氨酸含量和蛋白質(zhì)含量之間的相關(guān)關(guān)系

從結(jié)果可以看出，蛋白質(zhì)含量僅在品種間有顯著差異，地區(qū)間無顯著差異；而色氨酸含量在品種間無顯著差異，在地區(qū)間有顯著差異， 種植在內(nèi)蒙古的壩莜1號蛋白質(zhì)含量最高，高達19.11%，其色氨酸的含量也最高，達2.83 mg/g，顯著高于在甘肅和吉林兩地種植的壩莜1號。 對所有34個樣品的蛋白質(zhì)和色氨酸含量進行Pearson相關(guān)性分析， 結(jié)果表明，色氨酸含量和蛋白質(zhì)含量之間有顯著的負(fù)的線性相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.353，公式為y=-0.147x+16.905(R2=0.000 53)。

3 討論

燕麥蛋白質(zhì)含量高且氨基酸含量均衡，而且是谷物中唯一含有結(jié)晶球蛋白的作物，這種球蛋白作為近80%的儲存蛋白存在于燕麥籽粒中[15]。 Landry等[16]曾經(jīng)對不同谷物如小麥、玉米和大麥籽粒中的色氨酸含量與含氮水平的關(guān)系進行了分析，得出色氨酸含量與籽粒中含氮水平呈一定的線性關(guān)系的結(jié)論，但色氨酸含量與蛋白質(zhì)含量的水平卻不一致。究其原因可能是色氨酸含量的變異主要來源于富含色氨酸的某種蛋白質(zhì)，而與總蛋白質(zhì)的含量并不存在線性關(guān)系。但本研究發(fā)現(xiàn)，在燕麥籽粒中，色氨酸的含量與總蛋白質(zhì)的含量水平有一定的顯著性線性關(guān)系。燕麥比其他作物含有較高的色氨酸，如小麥1.70 mg/g，玉米0.68 mg/g，大麥1.40 mg/g，豌豆0.70 mg/g[17-19]。Wieser[20]曾報道， 色氨酸主要集中在白蛋白和谷蛋白中，而在醇溶谷蛋白中則含量極少。燕麥與小麥等其他谷物不同， 醇溶蛋白的含量相對較低，約4%～15%[21]，而白蛋白和谷蛋白含量相對較高，這可能是造成燕麥色氨酸含量與其總蛋白質(zhì)含量有一定相關(guān)性的原因。

4 結(jié)論

本試驗對我國主要裸燕麥栽培品種的色氨酸含量水平進行了評價，9個主要栽培品種的色氨酸含量有顯著差異， 平均為2.39 mg/g， 高于國外報道的皮燕麥的色氨酸平均含量1.70 mg/g，其中花早2號平均含量最高，達2.50 mg/g，比國外報道的皮燕麥色氨酸含量高出近47.05%。說明我國裸燕麥資源的色氨酸含量可能高于國外皮燕麥品種，具有一定的加工利用優(yōu)勢。而且色氨酸含量隨環(huán)境因素變化會有一定差異，差異的來源與燕麥不同蛋白質(zhì)組分之間的關(guān)系還有待進一步研究。這將對燕麥品質(zhì)育種和加工利用提供一定的信息。

[1]Sainio E L, Pulkki K, and Young S N. L-Tryptophan: Biochemical, nutritional and pharmacological aspects[J]. Amino Acids,1996,10:21-47

[2]Fukuwatari T and Shibata K. Nutritional Aspect of Tryptophan Metabolism[J]. International Journal of Tryptophan Research, 2013,6(supp1):3-8

[3]Shaw K, Turner J, Mar D C. Tryptophan and 5-Hydroxy-tryptophan for depression[EB/OL].Wiley online library,2002,http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14651858.CD003198/abstract;jsessionid=93E6D52E442B4782CF0E E8C6686F8896.f03t03

[4]Bravo R, Matito S, Cμbero J, et al. Tryptophan-enriched cereal intake improves nocturnal sleep, melatonin, serotonin, and total antioxidant capacity levels and mood in elderly humans[J]. Age, 2013, 35: 1277-1285

[5]Landry J，Delhaye S. The tryptophan content of pearl millet grains as a function of nitrogen content[J].Phytochemistry,1995,38(1):5-8

[6]Rutherfurd S M and Gilani S G. Amino acid Analysis, Current Protocols in Protein Science[EB/OL]. Wiley online library,2009, http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-ps1109.html

[7]Patrick P. Fluorescence of Proteins in 6-M Guanidine Hydrochloride. A Method for the Quantitative Determination of Tryptophan[J]. European Journal of Biochemistry, 1976, 63:263-269

[8]?ste R, Nair B M, and Dahlqvist A. A Simple Method for Determination of Tryptophan in Food Samples[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1976, 24(6):1141-1144

[9]Reynolds D M. Rapid and direct determination of tryptophan in water using synchronous fluorescence spectroscopy[J]. Water Research, 2003,37:3055-3060

[10]Cervantes-Pahm S K, Liu Y,etal. Digestible indispensable amino acid score and digestible amino acids in eight cereal grains[J]. British Journal of Nutrition, 2014, 111: 1663-1672

[11]Christina K And Elke K A. Proteins in Oats; their Synthesis and Changes during Germination: A Review [J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2012, 52(7):629-639

[12]林偉靜,吳廣楓,李春紅,等. 品種和環(huán)境對我國裸燕麥營養(yǎng)品質(zhì)的影響[J].作物學(xué)報, 2011, 37(6): 1087-1092

[13]Hahn J D, Chung T K, Baker D H. Nutritive value of oat flour and oat bran [J]. Journal of Animal Science,1990,68:4253-4260

[14]吳顯榮,梁鴻秋.木瓜蛋白酶在谷物色氨酸測定上的應(yīng)用[J]. 生物化學(xué)與生物物理進展, 1988, 15(6):460-462

[15]Brinegar A C and Peterson D M. Separation and characterization of oat globulin polypeptides [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1982, 219:71-79

[16]Landry J and Delhaye S. The tryptophan contents of wheat, maize and barley grains as a function of nitrogen content[J]. Journal of Cereal Science, 1993, 18:259-266

[17]George, S. Amino acid composition of Oat Groats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1971,19(3):536-539

[18]Panthee D R, Pantalone V R, Saxton A M, et al. Genomic regions associated with amino acid composition in soybean [J]. Molecular Breeding,2006,17:79-89

[19]Holt N W, Sosulski F W. Amino acid composition and protein quality of field peas [J]. Canada Journal of Plant Science, 1979, 59: 653-660

[20]Wieser H, Seilmeier W, Eggert M, et al. Tryptophan content of protein fractions from different cereals [J]. Zeitschrift fur Lebensmittel Untersuchung und Forschung, 1983,177: 457-460

[21]Klose C, Arendt E K. Proteins in Oats; their Synthesis and Changes during Germination: A Review[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2012, 52(7):629-639.

Fluorescence Detection and Assessment on Tryptophan Content of Naked Oat Varieties in China

Ren Yi1Wu Jiao1Olof Olsson2

(Shanxi Agricultural University1, Taigu 030801)(Lund University2, Sweden 22100)

The experiment aims to assess the tryptophan content of main cultivars of naked oat in China, and analyze the correlation between contents of tryptophan and protein. Oat flour was hydrolysed with papain, the fluorescence intensity of hydrolysate was detected at excitation wavelength of 288 nm and emission wavelength of 352 nm, and finally the tryptophan content was quantitated according to standard curve. The protein was quantitated by using the automatic protein analyzer to test the total nitrogen content of grain, meanwhile the contents of protein and tryptophan were tested respectively for 9 naked oat cultivars growing in 4 different habitats in China, and significant difference and correlation were analyzed. The result showed the average tryptophan content of naked oat varieties in China (2.39 mg/g) was higher than that of hulled oat varieties (1.70 mg/g) reported abroad. There was significant difference in tryptophan content of oat caused by varieties, habitats and interaction, and there was a correlation with the correlation coefficient being 0.353 between contents of tryptophan and protein. Compared with the hulled oat, Chinese naked oat has an advantage in tryptophan content, which would provide a certain amount of information in oat breeding and processing and utilization.

oat, tryptophan, fluorescence

TS235.3

A

1003-0174(2016)03-0129-05

國家自然科學(xué)基金(31201265),國家燕麥產(chǎn)業(yè)體系(CARS-08-A-1)，國家科技支撐計劃 (2012BAD 34B05-18),山西省基礎(chǔ)研究(2012011031-2)

2014-07-08

任祎，女，1972年出生，副教授，谷物資源與營養(yǎng)