纖維素酶基因克隆與表達(dá)研究進(jìn)展

徐俏冉 楊欣欣 張 珊 王 瑤 陳建軍* / 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

纖維素酶基因克隆與表達(dá)研究進(jìn)展

徐俏冉 楊欣欣 張 珊 王 瑤 陳建軍* / 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

纖維素是廣泛存在于自然界的多糖類物質(zhì)，纖維素酶能有效地將纖維素分解成單糖加以利用，其在能源、紡織、飼料、食品和造紙等行業(yè)具有重要的應(yīng)用。

由于纖維素酶熱穩(wěn)定性較低、酶活力不高而不能滿足生產(chǎn)需要，纖維素酶基因的克隆及表達(dá)日益被人們重視起來。結(jié)合纖維素酶在生產(chǎn)中的應(yīng)用及市場化的需求，本文概括了近年來國內(nèi)外對纖維素酶基因克隆與表達(dá)的研究進(jìn)展。

纖維素 纖維素酶 基因克隆 工程菌 表達(dá)載體

引言

纖維素在人們賴以生存的地球上無處不在，是人們可以利用的可再生資源，但纖維素本身是不可以直接被人們利用的，要先把它降解為可被人利用的物質(zhì)。目前，在降解纖維素的多種方法中，生物法還是較為有效的[1],它是利用微生物代謝的產(chǎn)物纖維素酶來降解和轉(zhuǎn)化纖維素，但是在實際應(yīng)用方面存在產(chǎn)酶活性較低、轉(zhuǎn)化率不高、設(shè)備耗材超出預(yù)算等問題，因此構(gòu)建出產(chǎn)酶量多，產(chǎn)酶活性高的纖維素酶基因工程菌對纖維素資源的有效利用和社會生產(chǎn)具有重要意義。近年來，隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，對纖維素酶基因的克隆及表達(dá)研究發(fā)展迅速，纖維素酶的應(yīng)用已滲透到人們生產(chǎn)、生活的各個領(lǐng)域。

1 .纖維素

纖維素是一種多糖，它的化學(xué)簡寫分子式為(C6H10O5) n,它的熱穩(wěn)定性很好，在室溫條件下，不易降解，不易分解，一般條件下，并不發(fā)生顯著的變化[2]。以150℃為界限，溫度高到一定程度時，也會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。纖維素與無機(jī)酸，苛性堿溶液以及強(qiáng)氧化劑均可以發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[3]。

2 . 纖維素酶

2.1纖維素酶的組成

纖維素酶由三部分組成，分別是：外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，它是靠這三種酶共同作用，來發(fā)揮自己的功效的[4]。纖維素酶的最適pH一般在4.5-6.5,過酸或者過堿都可以使酶失活。纖維素酶活力還算比較穩(wěn)定，但是，目前人們發(fā)現(xiàn)了一些抑制劑，可以抑制酶的活力，比如銅離子和汞離子，而相對應(yīng)的，還有些物質(zhì)可以解除這種抑制，它就是半胱氨酸[5]，我們可以有效的利用它，來最大程度的發(fā)揮酶的活力。

2.2纖維素酶的來源

纖維素酶無處不在，真菌，細(xì)菌，放線菌中都有產(chǎn)纖維素酶的菌[6]。目前，報道過的產(chǎn)纖維素酶的菌株主要集中在真菌方面，如黑曲霉Aspergillus Niger、綠色木霉Green trichoderma viride、里氏木霉Magnitude of trichoderma viride、康氏木霉Kang Shimu mildew和嗜熱毛殼菌 QM9381Bacteria QM9381, thermophilic MAO shells 等[7]；細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)的并不多，如芽孢桿菌Bacillus、瘤胃細(xì)菌Rumen bacteria（黃化瘤胃球菌、白色瘤胃球菌等）和熱纖梭菌Thermal fiber clostridium等。

2.3纖維素酶的作用機(jī)理

纖維素酶降解纖維素的過程中，首先纖維素酶要結(jié)合到底物上，形成酶-纖維素二元復(fù)合物，完成纖維素酶降解纖維素的第一步，即吸附[8]。由于吸附的條件不同，吸附的效果也不同。內(nèi)切葡聚糖酶先發(fā)揮作用后，外切葡聚糖酶再發(fā)揮作用，β-葡萄糖苷酶與其二者協(xié)同作用，共同將纖維素分解為葡萄糖。內(nèi)切葡聚糖酶先作用于微纖維的非結(jié)晶區(qū)，將其分解成大小不等的短鏈，外切葡聚糖酶作用于這些短鏈，生成纖維二糖，最后β-葡萄糖苷酶作用于纖維二糖等，生成葡萄糖。

2.4纖維素酶的應(yīng)用

纖維素酶在食品發(fā)酵工業(yè)、動物飼料行業(yè)、紡織和造紙行業(yè)中都有廣泛的應(yīng)用，在石油勘探、中藥成分的提取等領(lǐng)域中也有所涉及。在酒精生產(chǎn)中，添加纖維素酶不僅可以提高啤酒的純度和啤酒生產(chǎn)的速度，而且可以保證啤酒的質(zhì)量及提高啤酒的口感[9]。在飼料中，添加纖維素酶不僅可以促進(jìn)消化，還有利于提高家畜的體重[10]。在紡織行業(yè)中，采用纖維素酶對織物進(jìn)行洗滌時，其可以對纖維表層進(jìn)行有效的控制,從而使織物均勻褪色[11]。

3 .纖維素酶基因克隆及表達(dá)的研究

隨著分子生物學(xué)、遺傳工程的迅猛發(fā)展,國內(nèi)外均在嘗試應(yīng)用基因工程技術(shù)來改造和構(gòu)建高效纖維素降解菌,而且對特殊環(huán)境中的纖維素酶產(chǎn)生菌也產(chǎn)生了濃厚的興趣。這些菌具有獨特的酶學(xué)性質(zhì),擴(kuò)大了纖維素酶的應(yīng)用范圍[12]。

在20 世紀(jì)70 年代，纖維素酶基因的克隆開始興起并蓬勃發(fā)展起來。到目前為止，人們克隆到纖維素酶的基因并不是單一的，在成千上萬個物種中都有發(fā)現(xiàn)與收獲，其中在細(xì)菌和真菌中尤其廣泛[13]。同時，克隆到的酶基因能否成功的表達(dá)也十分重要，已有文獻(xiàn)證明纖維素酶在大腸桿菌中表達(dá)是比較普遍而且高效的[14]，另外，人們還在逐步尋找其他的表達(dá)載體。但是與國外相比，國內(nèi)對纖維素酶的研究還很緩慢，很多菌株因為產(chǎn)酶能力低或者熱穩(wěn)定性差而不能被很好的應(yīng)用。

如今，很多學(xué)者已克隆出不少的纖維素酶基因，而且其中一大部分都在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)[15]。

寧玉潔等[16]從約氏梭菌屬CJ-1菌株中克隆出基因片段Cel9C，大小為1943 bp,編碼647個氨基酸，將該基因構(gòu)建于大腸桿菌表達(dá)載體pET28a(+)中，獲得重組表達(dá)載體pET28a-Cel9C，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株BL21（DE3)中進(jìn)行表達(dá)。

Kim等[17]將耐熱菌Aqu ifex aeolicus VF5中編碼耐熱內(nèi)切葡聚糖酶的基因（Cel8Y）克隆并且轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌XL1-Blue中，通過表達(dá)和檢測，發(fā)現(xiàn)內(nèi)切葡聚糖酶在80℃時酶活最大。

李春華等[18]以CpoI and NotI限制性內(nèi)切酶雙酶切衍生于質(zhì)粒pGEX的大腸桿菌表達(dá)載體pHBM625,然后將經(jīng)T4 DNA polymerase處理后的β-1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶基因克隆至載體pHBM625中得到重組質(zhì)粒pHBM625中,最后通過平板檢測及SDS-PAGE凝膠電泳,均檢測到該基因在大腸桿菌XL10-Glod中的表達(dá)。

雖然纖維素酶克隆與表達(dá)的研究在現(xiàn)階段已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但表達(dá)、分泌均較弱，并沒有在真正意義上得到高效分解纖維素的工程菌，不能大規(guī)模的應(yīng)用于生產(chǎn)[19]。由此觀之，雖然纖維素酶具有廣闊的應(yīng)用前景和良好的發(fā)展前途，但人們對纖維素的世界了解的還不夠深入透徹，有很多未知的領(lǐng)域等待我們探索和突破，另外，纖維素酶還有良好的商業(yè)價值，人們在生產(chǎn)的各個領(lǐng)域，如果能使纖維素酶發(fā)揮出應(yīng)有的功效，那將是酶工程的一項重大突破[20]。

4 . 展望

迄今為止，很多纖維素的潛在資源沒有被人們利用，既造成了環(huán)境污染，也浪費了資源，并對物質(zhì)資源造成了很大的壓力[21]。有研究報道顯示，我國是農(nóng)業(yè)大國，很多玉米等谷物的麥稈都被焚燒，世界的麥稈每年產(chǎn)量約40億噸，光被我國燃燒掉的就占了八分之一，如果我們可以把這些資源利用起來，變廢為寶，不僅可以緩解環(huán)境的壓力，也可以很好的解決資源浪費的問題。很多發(fā)達(dá)國家的纖維素的利用率比我國高出了五分之一，所以，我們應(yīng)該學(xué)習(xí)他們的先進(jìn)技術(shù)，努力構(gòu)建高產(chǎn)纖維素酶的基因工程菌，并把它用于生產(chǎn)實踐，解決我國纖維素資源浪費的問題。相信在不久的將來，纖維素酶會在我們生活的各個領(lǐng)域發(fā)展壯大，將會給人們帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，會給商品化社會帶來推動作用，會更加便于人類的生活。

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陳建軍