響應(yīng)面法優(yōu)化堿解聚玉米秸稈條件的研究

馬玉龍 王鳳芝 常 璇

(寧夏大學(xué)能源化工國家重點實驗室培育基地1，銀川 750021)(寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院2，銀川 750021)

響應(yīng)面法優(yōu)化堿解聚玉米秸稈條件的研究

馬玉龍1,2王鳳芝1,2常 璇2

(寧夏大學(xué)能源化工國家重點實驗室培育基地1，銀川 750021)(寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院2，銀川 750021)

以玉米秸稈為研究對象，氫氧化鈉為解聚劑，通過單因素試驗、中心組合設(shè)計和響應(yīng)面法分析，優(yōu)化堿解聚玉米秸稈的條件。結(jié)果表明：堿解聚玉米秸稈的適宜條件為NaOH質(zhì)量濃度2%，溫度80 ℃，時間4 h。在此基礎(chǔ)上，建立了酶解試驗的二次多項式數(shù)學(xué)模型，發(fā)現(xiàn)影響堿解聚玉米秸稈酶解葡萄糖產(chǎn)量的大小順序依次為堿濃度>時間>溫度。用響應(yīng)面法優(yōu)化的堿解聚玉米秸稈的條件為NaOH質(zhì)量濃度2.24%、溫度81 ℃、時間4.30 h，并對此解聚條件進行了試驗驗證，發(fā)現(xiàn)葡萄糖的預(yù)測產(chǎn)量與試驗值有較高的吻合度，說明此條件是堿解聚玉米秸稈的適宜條件。

玉米秸稈 堿解聚 響應(yīng)面法 條件優(yōu)化

秸稈高聚物因結(jié)構(gòu)復(fù)雜使得其無法直接酶解，因此，酶解前對秸稈結(jié)構(gòu)實施解聚處理是非常有必要的。秸稈解聚目的是破環(huán)其超分子結(jié)構(gòu)，暴露纖維素，從而提高秸稈纖維的酶解糖化率[1]。堿法解聚常用的試劑有NaOH、Ca(OH)2、NH3等[2-4]，其目的是脫除木質(zhì)素和部分半纖維素[5-6]，有效增加酶分子結(jié)合位點對纖維素糖苷鍵間的識別與結(jié)合，從而提高酶解糖化率。

本研究以玉米秸稈為研究對象，NaOH為解聚劑，從解聚后產(chǎn)物酶解葡萄糖得率的角度評價堿解聚秸稈的效果，并以解聚溫度，堿濃度，解聚時間作為變量因子，通過中心組合試驗設(shè)計和響應(yīng)面法分析，優(yōu)化堿解聚玉米秸稈的條件，旨為可發(fā)酵糖產(chǎn)率高的秸稈解聚方案設(shè)計提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米秸稈來源于寧夏銀川市西夏區(qū)農(nóng)田。經(jīng)自來水洗凈，風(fēng)干，過80目標準篩，用苯-乙醇(2∶1，V/V)索式提取6 h，得到脫蠟玉米秸稈，在105 ℃下烘干備用。

1.2 方法

1.2.1 NaOH解聚樣品制備

取1.0 g 脫蠟玉米秸稈，加入不同質(zhì)量分數(shù)的NaOH(分析純)溶液20 mL，在一定反應(yīng)溫度下處理不同時間后，固液分離，固體殘渣用蒸餾水洗滌至中性，105 ℃烘干。

1.2.2 單因素試驗設(shè)計

試驗中單因素考察項及梯度分別是：NaOH濃度(質(zhì)量分數(shù))1%、2%、3%、5%、7%和10%；解聚溫度60、80、100和120 ℃；解聚時間0.5、2、4和6 h。分析堿濃度、溫度和時間對秸稈解聚后組分及其酶解葡萄糖產(chǎn)量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法試驗設(shè)計

通過單因素試驗研究NaOH濃度、解聚溫度和時間對處理后秸稈酶解效率的影響，確定響應(yīng)曲面法中各因子的適宜范圍。按照公式(1)對因子進行編碼：

xi=(XI-X0)/ΔXi

(1)

式中：xi為自變量編碼值；XI為自變量真實值；X0為試驗中心點自變量真實值；ΔXi為自變量變化的步長。

以溫度(X1)、NaOH濃度(X2)和時間(X3)為自變量，每個因素取5個水平，以-1.682，-1，0，1，1.682編碼，葡萄糖濃度為響應(yīng)值，如方程(2)所示，試驗因素編碼和水平見表1。

根據(jù)試驗設(shè)計，試驗數(shù)據(jù)假設(shè)由最小二乘法擬合的二次多項式為：

(2)

當n=3，則方程(2)可變?yōu)椋?/p>

Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b11X12+b22X22+b33X32+b12X1X2+b13X1X3+b23X2X3

(3)

式中：Y是響應(yīng)值(葡萄糖含量，mg/mL)；b0是截距項；b1，b2及b3是線性系數(shù)；b12，b13及b23是交互項系數(shù)；b11，b22及b33是二次項系數(shù)。試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理由Design Expert 8.0.6軟件完成。

表1 試驗設(shè)計因素及編碼水平

1.2.4 酶解樣品的制備

取上述1.2.1中NaOH解聚烘干后的玉米秸稈0.150 g，放入50 mL錐形瓶內(nèi)，加入10 mL檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=4.8)、0.1 g β-葡萄糖苷酶(154 CBU/g，諾維信188，)和0.1 mL纖維素酶(74 FPU/mL，諾維信1.5 L)。將錐形瓶置于50 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min水浴搖床中酶解36 h。取酶解后上清液0.1 mL，放入沸水中煮沸5 min使酶失活，然后3倍稀釋，過0.22 μm濾膜，待測。同步實施未加酶的對照試驗。

1.2.5 樣品測定

解聚后秸稈主要成分分析采用美國國家再生能源實驗室(NREL)推薦的方法[7]。酶解后樣品中葡萄糖含量用高效液相色譜儀(LC-20AT，日本島津)測定。色譜條件為：色譜柱：Aminex HPX-87H (300 mm × 7.8 mm，美國 Bio-Rad公司)；檢測器：示差折光檢測器(日本島津)；流動相：0.005 mol/L H2SO4溶液；流速0.6 mL/min；進樣量20 μL；柱溫65 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對秸稈堿解聚及酶解效果的影響

在前期研究的基礎(chǔ)上，將NaOH的質(zhì)量濃度固定為2.0%，解聚時間4 h，固液比1∶20，改變解聚溫度(60、80、100和120 ℃)，研究了溫度對玉米秸稈解聚及其后續(xù)酶解效果的影響，結(jié)果見表2和圖1a所示。由表2可見，解聚過程中秸稈解聚率隨溫度的升高而升高，其主要原因，可能是由于隨著溫度的升高，解聚程度加劇，物料質(zhì)量減少，并且伴隨解聚的進行，秸稈結(jié)構(gòu)被破壞，三大組分間的連接鍵斷裂，形成低聚糖、單糖和小分子物質(zhì)。NaOH解聚對玉米秸稈中木質(zhì)素的脫除程度最為明顯，而半纖維素部分被解聚，纖維素則被保留。這與Chen等[8]和Castro等[9]用酸解聚處理秸稈的結(jié)果異同，發(fā)現(xiàn)酸能解聚秸稈中大部分半纖維素，而木質(zhì)素只有部分被解聚，提示H+和OH-解聚秸稈的機制是不同的。表2顯示：當溫度在60 ℃時酸不溶性木質(zhì)素含量從初始15.83%減少到7.77%，而酸溶性木質(zhì)素含量無明顯變化。但隨著溫度的提升，酸不溶性木質(zhì)素含量減少的幅度下降，說明解聚溫度的繼續(xù)升高對酸不溶性木質(zhì)素的降解無明顯影響。相反隨溫度升高，纖維素的保留值下降明顯，說明溫度過高，堿液溶脹纖維素的速度增加，使纖維素發(fā)生解聚，導(dǎo)致纖維素的損失，不利于后續(xù)的酶解。

不同溫度解聚后的樣品再經(jīng)酶解，發(fā)現(xiàn)葡萄糖產(chǎn)量隨解聚溫度的升高，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(圖1a)，當溫度在80 ℃時，解聚后秸稈再經(jīng)酶解的葡萄糖產(chǎn)量達到最大值24.13 mg/mL。這與表2中纖維素含量/木質(zhì)素含量的比值的變化趨勢相一致，說明木質(zhì)素脫出程度和纖維素的保留對酶解葡萄糖產(chǎn)量的影響較大。根據(jù)秸稈解聚后組分含量和酶解葡萄糖得率的共同結(jié)果，認為NaOH解聚玉米秸稈的適宜溫度為80 ℃。

表2 秸稈組分隨解聚溫度的變化

注：aAIL代表酸不溶性木質(zhì)素;bASL代表酸溶性木質(zhì)素。下同。

圖1 不同單因子條件下堿解聚秸稈后再經(jīng)酶解的葡萄糖產(chǎn)量

2.2 NaOH濃度對秸稈解聚及酶解效果的影響

解聚劑濃度是影響解聚效果的因素之一，不同解聚劑和不同濃度亦會有不同的效果[10]。在溫度80 ℃，解聚時間4 h，固液比1∶20條件下，不同NaOH濃度對玉米秸稈解聚及其后續(xù)酶解的測定結(jié)果見表3和圖1b所示。從表3可以看出，秸稈解聚率隨NaOH濃度升高而升高。NaOH濃度為1%時，酸不溶性木質(zhì)素的質(zhì)量分數(shù)從15.83%下降到2.60%，繼續(xù)增加堿濃度，酸不溶性木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)值保持在2.4%左右，變化不明顯。但質(zhì)量濃度在2%之后，纖維素的保留值急劇下降，減少了15.70%。由此可見，一定的堿濃度對解聚是有利的，但堿濃度過高，會導(dǎo)致纖維素的損失。圖1b是不同NaOH濃度解聚秸稈后再經(jīng)酶解的葡萄糖產(chǎn)量變化曲線。NaOH質(zhì)量濃度為2%時秸稈酶解葡萄糖產(chǎn)量達到最大值24.57 mg/mL。堿質(zhì)量分數(shù)在3%～10%時，葡萄糖產(chǎn)量保持在17%左右，酶解糖得率低的原因可能是解聚劑濃度過高，纖維素被降解，從而導(dǎo)致酶解糖得率下降。因此，適宜的堿濃度應(yīng)該在2%左右。

表3 秸稈組分隨NaOH濃度的變化

2.3 時間對秸稈解聚及酶解效果的影響

解聚時間的選擇亦是秸稈解聚強度的關(guān)鍵因素。時間過短，解聚強度低，達不到解聚效果。相反，解聚時間過長又會造成纖維素組分流失和一定程度的成本浪費。當溫度80 ℃，NaOH質(zhì)量濃度2%，固液比1∶20條件下，不同反應(yīng)時間對秸稈前后各組分含量變化及酶解效果的影響見表4和圖1c所示。解聚初期纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，解聚速率慢，但隨時間的延長及各個單元之間鍵的斷裂，秸稈的解聚率逐漸增加，但4 h后酸溶性木質(zhì)素的含量變化不明顯。由圖1c可知，葡萄糖產(chǎn)量隨解聚時間的增加而增多。堿解聚秸稈初期，酸不溶性木質(zhì)素的脫除和纖維素的溶出速率小，葡萄糖產(chǎn)量保持在17.95～19.31 mg/mL之間，而當時間增加到4 h時，葡萄糖產(chǎn)量增加到25.54 mg/mL，6 h時葡萄糖產(chǎn)量相對4 h時僅增加了1.24 mg/mL，這是由于解聚達到最大程度，增加解聚時間，對酶解糖產(chǎn)率無明顯影響。因此，適宜的解聚時間應(yīng)為4 h。

表4 秸稈組分隨反應(yīng)時間的變化

2.4 模型建立與顯著性檢驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計了20組試驗點，其中14組析因點，6組零點試驗以估計誤差。試驗設(shè)計及結(jié)果見表5所示。利用Design Expert 軟件對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得響應(yīng)值[葡萄糖含量(Y)]對關(guān)鍵因子[溫度(X1)、NaOH濃度(X2)和時間(X3)]的二次多項式回歸模型方程：

Y=25.67+0.67X1+1.10X2+0.81X3-0.66X1X2-0.13X1X3-0.044X2X3-3.59X12-2.17X22-1.32X32

(4)

表5 試驗設(shè)計及結(jié)果

對回歸方程進行方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗，由表6可見，模型P<0.01，表明極顯著；而失擬項0.141 9，說明不顯著。模型方程的擬合程度可以通過相關(guān)系數(shù)R2來驗證[11-12]。本試驗?zāi)Ｐ蚏2=0.889 1，說明有88.91%的葡萄糖變異分布在試驗研究的三因素中，其模型方程有較好的擬合度，試驗誤差較小，可以用該回歸方程代替真實結(jié)果進行分析。模型中的一次項X2(NaOH濃度)(P=0.054 1)雖然從統(tǒng)計學(xué)上不顯著，但其P值接近0.05，而X1(溫度)(P=0.214 3)與X3(時間)(P=0.136 8)不顯著；交互項X1X2、X2X3和X1X3不顯著；二次項X12、X22和X32顯著。此結(jié)果表明堿濃度對玉米秸稈解聚及其酶解葡萄糖產(chǎn)量的影響相對較大。通過F值可以判斷考察因素中對秸稈堿解聚后酶解葡萄糖產(chǎn)量的影響程度，其值越大，表明影響程度越大。依據(jù)F值X1=1.76、X2=4.76和X3=2.62，可知影響因子的大小依次為堿濃度>解聚時間>解聚溫度。

表6 堿解聚玉米秸稈的響應(yīng)面分析結(jié)果

圖2是解聚溫度、NaOH濃度和解聚時間三因素的交互作用對解聚后秸稈酶解葡萄糖產(chǎn)量的影響情況。由圖2a可見，當解聚時間不變，酶解葡萄糖的產(chǎn)量隨解聚溫度和NaOH濃度的增加，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，達到最大值后有所降低。溫度81.10 ℃，NaOH質(zhì)量濃度2.21%時，響應(yīng)面有中心點，葡萄糖產(chǎn)量達最大值25.82 mg/mL，說明適當?shù)脑黾咏饩蹨囟群蛪A濃度會提高后續(xù)酶解的效果。圖2b表明，在堿濃度不變時，隨解聚時間的延長，葡萄糖產(chǎn)量先增加而后又有所下降。相對解聚時間，解聚溫度對酶解葡萄糖產(chǎn)量的影響較大，其產(chǎn)量的變化速率快，當溫度81.30 ℃、時間4.30 h時，葡萄糖產(chǎn)量達到區(qū)間最大值。圖2c顯示，在解聚溫度不變的情況下，隨解聚時間和堿濃度的增加，葡萄糖產(chǎn)量呈現(xiàn)增加的趨勢。在NaOH質(zhì)量濃度2.25%、時間4.30 h條件下，葡萄糖產(chǎn)量達最大值25.93 mg/mL。

圖2 顯著因素交互影響葡萄糖含量的曲面

2.5 模型驗證

利用Design Expert 軟件對堿解聚條件進行優(yōu)化，當溫度81 ℃，NaOH質(zhì)量濃度2.24%，時間4.30 h時，酶解葡萄糖產(chǎn)量最大預(yù)測值為25.94 mg/mL。為了驗證模型的準確性，依據(jù)上述模型所獲得的適宜解聚條件，進行了3組堿解聚玉米秸稈酶解驗證試驗，其結(jié)果見表7所示。試驗值與軟件優(yōu)化預(yù)測值相一致，表明用此模型可以較好地優(yōu)化堿解聚玉米秸稈的條件。

表7 回歸模型驗證結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 通過單因子試驗，堿解聚玉米秸稈的適宜條件為：NaOH質(zhì)量濃度2%，解聚溫度80 ℃，解聚時間4 h。

3.2 通過模型優(yōu)化，獲得堿解聚玉米秸稈的理論適宜條件：NaOH質(zhì)量濃度2.24%、溫度81 ℃、解聚時間4.30 h，此條件下酶解葡萄糖產(chǎn)量的預(yù)測值與實測值相一致。

3.3 建立了酶解試驗的二次多項式數(shù)學(xué)模型，模型中的一次項對玉米秸稈解聚后酶解葡萄糖產(chǎn)量影響的大小順序依次為：堿濃度>解聚時間>解聚溫度。

[1]王鳳芝，常璇，馬玉龍，等．酸解聚玉米秸稈的產(chǎn)物及其形成機制研究[J]．中國糧油學(xué)報，2015, 30(3):1-5,11

[2]Rabelo S C, Filho R M, Costa A C. Lime pretreatment of sugarcane bagasse for bioethanol production [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2009, 153:139-150

[3]Salvida A, Aita G M, Robert D. Ethanol production from sorghum by a dilute ammonia pretreatment [J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2010, 37: 27-34

[4]McIntosh S, Vancov T. Optimisation of dilute alkaline pretreatment for enzymatic saccharification of wheat straw [J]. Biomass & Bioenergy, 2011, 35: 3094-3103

[5]孫永剛, 馬玉龍, 麻曉霞，等. 汽爆酸堿耦合解聚玉米秸稈分子結(jié)構(gòu)的研究[J]. 中國糧油學(xué)報，2013, 28(3):29-35

[6]Sun Y G, Ma Y L, Wang Z, et al. Evaluating and optimizing pretreatment technique for catalytic hydrogenolysis conversion of corn stalk into polyol [J]. Bioresource Technology, 2014, 158: 307-312

[7]NREL, Biomass Analysis Technology Team, National Renewable Energy. USA, 2005. http：//www.nrel.gov/biomass/analytical_procedures.html

[8]Chen Y F, Dong B Y, Qin W J. Xylose and cellulose fractionation from corncob with three different strategies and separate fermentation of them to bioethanol [J]. Bioresource Technology, 2010, 101: 6994-6999

[9]Castro E, Diaz M J, Cara C, et al. Dilute acid pretreatment of rapeseed straw for fermentable sugar generation [J]. Bioresource Technology, 2011, 102: 1270-1276

[10]Pedersena M, Viks?-Nielsenb A, Meyera A S. Monosaccharide yields and lignin removal from wheat straw in response to catalyst type and pH during mild thermal pretreatment [J]. Process Biochemistry, 2010, 45:1181-1186

[11]Sunitha K, Lee J K, Oh T K. Optimization of medium components for phytase production by Ecoli using response surface methodology [J]．Bioprocess Engineering, 1999, 21: 477-481

[12]Osório N M, Ferreira D S, Gusmao J H, et al．Response surface modeling of the production of ω-3-polyunsaturated fatty acids-enriched fats by a commercial immobilized lipase [J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2001, 11:677-686.

Optimal Condition of Depolymerization Corn Stalk with Alkali Using Response Surface Method

Ma Yulong1,2Wang Fengzhi1,2Chang Xuan2

(State Key Laboratory Cultivation Base of Energy Sources and Chemical Engineering, Ningxia University1,Yinchuan 750021)(College of Chemistry & Chemical Engineering, Ningxia University2, Yinchuan 750021)

The objective of this study was to optimize the conditions of depolymerization corn stalk with NaOH through single-factor experiment, central composite design, and response surface method. The results obtained from single-factor experiment showed that the optimal conditions for corn stalk depolymerization were NaOH concentration 2%, temperature 80 ℃, and time 4 h. Based on this result, the quadratic polynomial mathematical model was established and found that the influence factor on glucose yield during enzymolysis of corn stalk after alkali depolymerization decreased in the order of alkali concentration>time>temperature. The conditions from response surface method for corn stalk depolymerization were NaOH concentration 2.24%, temperature 81 ℃, and time 4.30 h. Under these conditions, the predicted yield of glucose exhibited a high congruency with the data obtained from experiment, suggesting that they are the optimal conditions for corn stalk depolymerization with alkali.

corn stalk, alkali depolymerization, response surface method, optimal condition

TQ353.1+4

A

1003-0174(2016)04-0128-05

國家自然科學(xué)基金(21266023)

2014-08-15

馬玉龍，男，1966年出生，教授，生物質(zhì)能源