茶葉籽油中角鯊烯的定性與定量分析

肖義坡 鄧丹雯 羅家星 單 艷 白 雪 張 彬

(南昌大學(xué)中德食品工程中心1，南昌 330047)(南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院2，南昌 330047)(金佳谷物股份有限公司樟樹(shù)油廠3，樟樹(shù) 331200)

茶葉籽油中角鯊烯的定性與定量分析

肖義坡1鄧丹雯1羅家星3單 艷2白 雪1張 彬1

(南昌大學(xué)中德食品工程中心1，南昌 330047)(南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院2，南昌 330047)(金佳谷物股份有限公司樟樹(shù)油廠3，樟樹(shù) 331200)

采用GC-MS分析茶葉籽油中不皂化物的成分，并采用高效液相色譜法對(duì)茶葉籽油中的角鯊烯進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明：茶葉籽油不皂化物的主要成分為角鯊烯、α-生育酚，另外還有合金歡醇、香葉里拉醇、羊毛甾醇、茉莉酮、D12齊墩果烯、2,4-二叔丁基苯酚及2,5-二叔丁基-1,4-苯醌等物質(zhì)。通過(guò)C18柱分離樣品中的角鯊烯，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇/乙腈(60+40，V/V)、檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm、流速2 mL/min、柱溫30 ℃時(shí)，能有效分離茶葉籽油樣品中的各組分，再經(jīng)HPLC測(cè)得茶葉籽油中角鯊烯含量為4.1 mg/kg。當(dāng)角鯊烯質(zhì)量濃度在20～500 mg/L之間時(shí)，峰面積和質(zhì)量濃度的線性關(guān)系較好，線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 0；平均加標(biāo)回收率為84.2%～90.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于6.98%(n=4)，此方法的測(cè)定低限( LOQ)為2.7 mg/kg。

茶葉籽油 不皂化物 GC-MS 角鯊烯 高效液相色譜法

角鯊烯又稱魚(yú)肝油萜、鯊烯[1]，是一種高度不飽和的脂肪族烴類化合物，化學(xué)名稱為2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，屬開(kāi)鏈三萜烯類，常溫狀態(tài)為無(wú)色油狀液體，最早是在黑鯊魚(yú)的肝油中發(fā)現(xiàn)的，于1914年被命名為Squalene。角鯊烯不僅具有促進(jìn)新陳代謝，抗疲勞、強(qiáng)化內(nèi)臟的作用，還具有極強(qiáng)的供氧能力，可抑制癌細(xì)胞生成，能有效地防止細(xì)胞的老化，提高機(jī)體免疫力。角鯊烯主要來(lái)自深海鯊魚(yú)肝油，占脂質(zhì)總量90%以上，同時(shí)還少量存在于植物油脂不皂化物中，尤其是在橄欖油、棕櫚油及其脫臭餾出物中含量較多，羅漢果種仁油、菜籽油、大豆油、米糠油、棉籽油等植物油也含有一定量角鯊烯[2]。

茶葉籽油屬于新資源食品，不飽和脂肪酸含量超過(guò)82%，其中亞油酸與亞麻酸的比例為10∶1，是人體所需要的比例，同時(shí)還含有維生素E、植物甾醇、胡蘿卜素、角鯊烯等多種強(qiáng)抗氧化成分，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。對(duì)茶葉籽油中角鯊烯進(jìn)行定性和定量分析，確定茶葉籽油中不皂化物成分及角鯊烯含量，對(duì)于茶葉籽油的研究、開(kāi)發(fā)及利用有實(shí)際意義。

近年來(lái)，關(guān)于油料油脂中角鯊烯的分析，國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，角鯊烯的分析方法主要有氣相色譜法[3-5]、液相色譜法[6]以及氣質(zhì)聯(lián)用法[7]等，其中以氣相色譜法居多，也有采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。陳全斌等[8]在對(duì)羅漢果種仁油中的角鯊烯進(jìn)行分析時(shí)，將樣品油用氯仿溶解后采用高效液相色譜分析，測(cè)出羅漢果種仁油含角鯊烯12. 5%。鐘冬蓮等[5]建立了油茶籽油中角鯊烯含量測(cè)定的氣相色譜檢測(cè)方法，樣品經(jīng)氫氧化鉀-乙醇溶液皂化，石油醚萃取凈化，經(jīng)HP-5色譜柱分離，氣相色譜儀( GC-FID) 檢測(cè)，外標(biāo)法定量，測(cè)定出油茶籽油中角鯊烯含量為2.083 g/kg。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于茶葉籽油中角鯊烯的定性與定量研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究先采用GC-MS分析茶葉籽油不皂化物成分，對(duì)角鯊烯進(jìn)行定性分析；然后采用高效液相色譜法對(duì)茶葉籽油中角鯊烯進(jìn)行定量分析，為茶葉籽油中角鯊烯的測(cè)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉籽：江西茗果產(chǎn)業(yè)農(nóng)業(yè)科技有限公司。

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，美國(guó)阿拉丁工業(yè)公司；95%乙醇、氫氧化鉀、石油醚：沸程35 ～ 60 ℃，天津市大茂化學(xué)試劑廠；N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺：美國(guó)阿拉丁工業(yè)公司；正己烷：色譜純、乙腈：色譜純、甲醇：色譜純，天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；水為超純水。

1.2 主要儀器

RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；氮?dú)獯祾邇x：杭州瑞城儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BS224S型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；6890N/5973i氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；超聲波清洗機(jī)：上海精密儀器公司；LC-6A 高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶葉籽油提取

將干燥后的茶葉籽進(jìn)行脫殼處理，然后用小型粉碎機(jī)將茶葉籽仁粉碎，得到籽仁粉。取100 g籽仁粉，按4∶1(V/W)的料液比加入石油醚，在室溫下攪拌浸提1 h，抽濾后的提取液經(jīng)過(guò)脫溶得到茶葉籽毛油，將毛油存放在冰箱中備用。

1.3.2 茶葉籽油不皂化物提取

取5 g茶葉籽油于250 mL圓底燒瓶中，加入沸石及1 mol/L的氫氧化鉀-乙醇水溶液50 mL，在沸騰條件下皂化1 h，然后加入50 mL蒸餾水；待皂化液冷卻后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用50 mL石油醚重復(fù)萃取不皂化物3次；合并3次提取液，用體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液洗滌石油醚提取液，每次25 mL，以洗滌液中加入酚酞，完全不變色為準(zhǔn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫溶得到不皂化物。

1.3.3 GC-MS分析茶葉籽油不皂化物成分

茶葉籽油不皂化物烷基化：取50 mg茶葉籽油不皂化物溶解于5 mL正己烷中，過(guò)無(wú)水硫酸鈉脫水后取600 μL于10 mL試管中，加入600 μL BSTFA-TMCS(三氟乙酰胺-三甲基硅烷)，在60 ℃水浴中加熱硅烷化1 h。吹氮脫溶，殘留物用500 μL正己烷溶解，并用濾頭過(guò)濾，取1 μL進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱為安捷倫122-3832毛細(xì)管柱(DB-35 ms，0.25 mm×30 m×0.25 μm)。升溫程序：初溫60 ℃，維持2 min，升溫至300 ℃，維持5 min；進(jìn)樣溫度320 ℃，壓力10.25 psi，載氣是氦氣(He)，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，分流比50∶1。

質(zhì)譜條件：接口溫度為280 ℃，離子源溫度220 ℃，MS四級(jí)桿溫度140 ℃，溶劑延遲：3 min；質(zhì)量掃描范圍35～540m/z。

1.3.4 高效液相色譜法分析茶葉籽油中角鯊烯

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取50 mg 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到1.0 mg/mL角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

樣品處理：稱取茶葉籽油樣品0.10 g于燒杯中(精確至0.001 g) ，加入甲醇溶解，倒入100 mL容量瓶中定容，混勻后超聲30 s，功率300 W。用注射針吸取1 mL樣品溶液，經(jīng)過(guò)濾后轉(zhuǎn)移到1mL進(jìn)樣小瓶中，待測(cè)。

液相色譜條件：色譜柱為Kromasil 100-5C18 柱( 4.6 mm×250 mm) ，甲醇/乙腈( 60+40，V/V) 作為流動(dòng)相，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30 ℃，流速2.0 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS測(cè)定茶葉籽油不皂化物成分

采用GC-MS測(cè)定茶葉籽油不皂化物成分，采用峰面積歸一法來(lái)計(jì)算各成分的相對(duì)含量。茶葉籽油不皂化物總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 茶葉籽油不皂化物總離子流(TIC)色譜圖

GC-MS聯(lián)用所得質(zhì)譜信息經(jīng)計(jì)算機(jī)用NIST02.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索對(duì)照分析，確認(rèn)了其中部分化學(xué)成分。茶葉籽油不皂化物化學(xué)成分分析結(jié)果見(jiàn)表1。

結(jié)果表明：茶葉籽油不皂化物成分中主要有羊毛甾醇、角鯊烯、2,4-二叔丁基苯酚、正十六烷、正十八烷、1,1-雙(嗎啉)乙烯、D12齊墩果烯、2,5-二叔丁基-1,4-苯醌、5-丁基-6-己基-八氫化-1H-茚、合金歡醇、ɑ-生育酚、香葉里拉醇，含量分別為5.91%、3.63%、2.77%、2.60%、2.41%、2.29%、2.15%、1.92%、1.68%、1.31%、1.12%、1.03%。從其他草本植物中得到的油脂，如油茶籽油與橄欖油，與二者的不皂化物相比較同樣是三萜醇含量較高[9]。茶葉籽油不皂化物中的α-生育酚含量相對(duì)較高，同時(shí)檢測(cè)到了少量的γ-生育酚。檢測(cè)出了D12齊墩果烯及1,1-雙(嗎啉)乙烯，但沒(méi)有檢測(cè)出湯富彬等[10]報(bào)導(dǎo)的β-谷甾醇以及朱晉萱等[11]報(bào)導(dǎo)的△7,22一麥角甾二烯醇。

表1 茶葉籽油不皂化物成分

另外，還檢測(cè)出了菲啶、香葉里拉醇、茉莉酮、羊毛甾醇[12]以及合金歡醇。菲啶存在于煤焦油高沸點(diǎn)餾分中，可用鄰氯苯亞甲基苯胺與氨基鉀在液氨中反應(yīng)制得；香葉里拉醇又名香葉基芳樟醇，是鏈狀二萜類藥物和天然產(chǎn)物的重要中間體、生物活性化合物和香料定香成分；茉莉酮是存在于茉莉花胡椒、留蘭香、長(zhǎng)壽花、香檸檬、薄荷、茶葉和多種花中的天然物質(zhì)；羊毛甾醇屬四環(huán)三萜類化合物，可從鏈狀的角鯊烯關(guān)環(huán)制備，羊毛甾醇是膽甾醇生物合成的中間體；合金歡醇是一種直鏈倍半萜物質(zhì)，又名法尼醇、麝子油醇，具有甜香、花香、青香，存在于巴西檀木、晚香玉、黃葵子、依蘭依蘭、金合歡、茉莉及橙花的香精油中，主要用作香料，用于加強(qiáng)類似丁香及仙來(lái)花香味。

2.2 高效液相色譜法分析茶葉籽油中角鯊烯的含量

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

選用反相色譜對(duì)角鯊烯進(jìn)行分離，選擇甲醇/乙腈作為流動(dòng)相，通過(guò)改變甲醇與乙腈的體積比來(lái)調(diào)整角鯊烯的分離效果，結(jié)果顯示，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇/乙腈(60+40，V/V)、檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm、流速2 mL/min、柱溫30 ℃時(shí)，茶葉籽油樣品中各組分間分離效果最好，色譜圖如圖2所示。

圖2 茶葉籽油樣品色譜圖

取標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

綜合圖2、圖3可知，樣品待測(cè)液與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的角鯊烯保留時(shí)間相同，為8.7 min，即選定的色譜條件能充分分離角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液和茶葉籽油樣品溶液中的角鯊烯。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取1.0 mg/mL 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.25、0.50 mg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在選定的色譜條件下，取20 μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積(y) 為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制出角鯊烯的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖4 )，結(jié)果表明在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為y=2.6×107x+2.0×105，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 0。

圖4 角鯊烯的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2.3 回收率、精密度和檢測(cè)限

茶葉籽油角鯊烯含量較少，加標(biāo)回收試驗(yàn)樣品中角鯊烯添加量分別為5.0、10、50和100 mg/kg，每一添加水平的試驗(yàn)次數(shù)為4次，樣品處理和測(cè)定按1.3.4進(jìn)行。先測(cè)定茶葉籽油樣品中角鯊烯的本底含量，之后分別測(cè)定加入角鯊烯后樣品中的角鯊烯含量，把樣品中角鯊烯的本底含量扣除后，計(jì)算所添加角鯊烯的回收率。加標(biāo)樣品中角鯊烯的回收率和精密度結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，平均添加回收率為84.2%～90.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<6.98%(n=4) 。以可以準(zhǔn)確測(cè)定的最低質(zhì)量濃度定性為測(cè)定低限(LOQ) ，依據(jù)GB/T 27404—2008中方法測(cè)定低限公式，此方法的LOQ為2.7 mg/kg。

表2 加標(biāo)樣品的回收率及精密度(n=4)

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，將本檢測(cè)方法的技術(shù)要求與相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 檢測(cè)方法的技術(shù)要求對(duì)比

查閱國(guó)標(biāo)GB/T 27404—2008，本研究中的回收率、精密度及檢測(cè)限均符合檢測(cè)方法的技術(shù)要求標(biāo)準(zhǔn)，再將本研究中檢測(cè)方法的技術(shù)要求與其他發(fā)表論文對(duì)比，綜合可得本研究方法可行。

2.2.4 實(shí)際樣品分析

準(zhǔn)確吸取樣品溶液20 μL進(jìn)樣，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中角鯊烯含量，結(jié)果表明茶葉籽油中角鯊烯含量為4.1 mg/kg。

3 結(jié)論

采用GC-MS分析茶葉籽油不皂化物成分，鑒定出主要成分，完成了茶葉籽油中角鯊烯的定性分析；采用HPLC法測(cè)定出茶葉籽油中角鯊烯含量為4.1 mg/kg，平均添加回收率為84.2%～90.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<6.98%(n=4) ，測(cè)定低限(LOQ)為2.7 mg/kg。

本測(cè)定方法靈敏度好，可靠，重復(fù)性好，可應(yīng)用于茶葉籽油中角鯊烯的檢測(cè)分析。

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Qualitative and Quantitative Analysis of Squalene in Tea Seed Oil

Xiao Yipo1Deng Danwen1Luo Jiaxing3Shan Yan2Bai Xue1Zhang Bin1

(Sino-German Food Engineering Center of Nanchang University1, Nanchang 330047)(Sino-German Joint Research Institute of Nanchang University2, Nanchang 330047)(Zhang shu Oil factory of Jiangxi Jinjia Grains Co.Ltd3, Zhangshu 331200)

The unsaponifiable matters of tea seed oil has been analyzed by GC-MS; squalene in tea seed oil has been determined by high performance liquid chromatography. The results showed that the main components of tea seed oil unsaponifiables were squalene and alpha tocopherol, In addition, there were small quantities of huisache alcohol, geranyl linalool, Lanosterin, cis-Jasmone, D12 oleanene, 2,4-Di-tert-butylphenol and 2,5-Di-tert-butyl-p-benzoquinone.The squalene in sample were separated from the other impurities by C18 column. On condition of that: the mobile phase of methanol/acetonitrile (60+40,V/V), the detection wavelength of 210 nm, the flow rate of 2 mL/min, the column temperature at 30 ℃, these should be chosed as determination conditions, the components in tea seed oil could be effectively separated.The squalene content in tea seed oil was 4.1 mg/kg measured by HPLC. The linear correlation between peak area and concentration of squalene was fine in concentration range of 20～500 mg/L with the linear correlation coefficient (R2) of 0.999 0. The average recoveries were 84.2%～90.1%, the relative standard deviation was less than 6.98% (n=4), and the Limit of Quantity (LOQ) was 2.7 mg/kg.

tea seed oil, unsaponifiables, GC-MS, squalene, high performance liquid chromatography

TS222+.1

A

1003-0174(2016)04-0108-05

2014-08-12

肖義坡，男，1990年出生，碩士，食品加工與保藏

張彬，男，1956年出生，教授，油脂加工