玉米直鏈淀粉的分離與鑒定

鐘雨越 張旭東 石涵羽 劉林三 吳權(quán)明 張仁和 徐淑兔 薛吉全 郭東偉

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部西北旱區(qū)玉米生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，楊凌 712100)

玉米直鏈淀粉的分離與鑒定

鐘雨越 張旭東 石涵羽 劉林三 吳權(quán)明 張仁和 徐淑兔 薛吉全 郭東偉

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部西北旱區(qū)玉米生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，楊凌 712100)

以高直鏈玉米淀粉和普通玉米淀粉為原料，比較凝沉法等5種提取方法在直鏈淀粉提取效率及品質(zhì)上的差異。結(jié)果表明：在同一提取方法下，不同淀粉原料的直鏈淀粉平均提取率無明顯差異；利用同種淀粉原料，5種提取方法中以蒸餾分散法和DMSO鹽析法提取率最高，分別為33.22%和34.67%；高速凝沉法提取率最低，為16.36%。不同提取方法獲得的直鏈淀粉在藍值、吸收光譜、掃描電鏡(SEM)、X射線衍射(XRD)5個純度參數(shù)上存在差異；提取率高的方法獲得的直鏈淀粉往往純度偏低，提取率低的方法獲得的直鏈淀粉純度高。綜合考慮認為，高轉(zhuǎn)速凝沉法和二甲基亞砜(DMSO)分散法優(yōu)于其他3種方法。雖然提取率略低，但純度更高。

高直鏈玉米淀粉 直鏈淀粉 分離 純度 鑒定

直鏈淀粉是淀粉的重要組成部分，其含量對淀粉的分子結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)、加工特性有著重要影響。直鏈淀粉在食品加工過程中形成的抗性淀粉在小腸中難以被消化，使其具有了類似膳食纖維的生理功效[1]，能選擇性地促進腸內(nèi)有益菌(如雙歧桿菌)的生長繁殖，抑制結(jié)腸癌的發(fā)生[2]。另外，高直鏈淀粉(直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于50%的淀粉)食品能夠減少餐后血糖和胰島素響應(yīng)，降低血漿膽固醇和甘油三酯的濃度，因此，是糖尿病人的理想食品，被稱為“功能性食品”[3]。在食品工業(yè)領(lǐng)域，用高直鏈玉米淀粉制成的低脂食品具有很好的流變學(xué)特性及穩(wěn)定性，與全脂奶油產(chǎn)品具有相同的口感，因此可當(dāng)作冰淇淋及蛋糕中脂肪的代替物[4]。此外，直鏈淀粉具有較好的抗拉伸性能，可取代聚苯乙烯用來生產(chǎn)光降解塑料，從而應(yīng)用于包裝業(yè)和薄膜加工業(yè)，有助于解決目前日益嚴(yán)重的“白色污染”[5]。

目前，市場上的直鏈淀粉主要從普通淀粉中提取，提取率低，而真正商品化的高純直鏈淀粉仍鮮有出售，這極大限制了直鏈淀粉的加工和應(yīng)用。為此，本試驗以自育的高直鏈淀粉玉米為原料，采用凝沉法(低轉(zhuǎn)速、高轉(zhuǎn)速)、蒸餾法、DMSO法(分散、鹽析法)等5種常用方法來提取直鏈淀粉，并且從提取率、藍值、碘-淀粉復(fù)合物吸收光譜、掃描電子顯微鏡分析、晶體特性等方面比較5種方法的優(yōu)劣，以期為直鏈淀粉的規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 高直鏈玉米淀粉的提取

玉米籽粒去除胚芽及種皮，加水研磨成糊后，經(jīng)100 μm尼龍網(wǎng)過濾至50 mL離心管， 2 000 r/min離心15 min，棄上清，加0.5%的NaOH溶液20 mL靜置4 h，4 000 r/min離心10 min， NaOH溶液重復(fù)洗滌至上清無色，沉淀加5 mL丙酮4 000 r/min離心10 min，去上清，通風(fēng)櫥內(nèi)自然干燥后備用。

1.2.2 直鏈淀粉的提取

1.2.2.1 凝沉分離法

參考洪雁等的方法[6]，取原料淀粉5 g，依次加入2 mL無水乙醇和350 mL 0.5 moL/L的氫氧化鈉，沸水浴中攪拌10 min，冷卻至室溫后置于-20 ℃冷凍24 h，8 000 r/min高速離心15 min， HCl溶液中和至中性，加10 mL丁醇-異戊醇(3∶1)混合液，沸水浴攪拌10 min，冷卻至室溫，4 ℃靜置24 h，4 000 r/min離心10 min，沉淀移入丁醇飽和水溶液，加熱溶解至溶液透明，冷卻至室溫后4 ℃靜置24 h，分別以4 000r/min(低轉(zhuǎn)速)和8 000 r/min(高轉(zhuǎn)速)離心，沉淀同法純化6次后，再依次用70 %乙醇、95 %乙醇和無水乙醇各洗滌3次，沉淀于真空冷凍干燥儀中干燥24 h備用。

1.2.2.2 蒸餾分散法

參考Liu等[7]的方法，稱量淀粉5 g于燒杯中，加蒸餾水100 mL，沸水浴中攪拌至凝膠狀，冷卻到50 ℃時，用磷酸緩沖液調(diào) pH到6.5，于100 ℃蒸煮3 h后在沸水浴中攪拌樣品2 h。將樣品轉(zhuǎn)移到1 000 mL圓底燒瓶并加適量正丁醇回流1 h。當(dāng)樣品冷卻到50 ℃，將圓底燒瓶取出，自然冷卻過夜。溶液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管， 8 000 r/min離心30 min。棄上清，沉淀轉(zhuǎn)移到1 000 mL圓底燒瓶，加正丁醇80 mL回流1 h。重復(fù)離心和回流2次。去上清，沉淀在真空冷凍干燥機中干燥24 h備用。

1.2.2.3 DMSO分散法

參考楊澤敏等[8]的方法，5 g淀粉加入適量DMSO后置于全溫搖瓶柜中緩緩攪動24 h，2 000 r/min離心15 min。取上清液注入2倍體積正丁醇，靜止24 h，4 000 r/min離心10 min。正丁醇洗滌沉淀3次，轉(zhuǎn)入足量水中，加熱至完全溶解，自然冷卻至60 ℃時加8 g百里酚，室溫放置3 d，4 000 r/min離心15 min。沉淀轉(zhuǎn)入足量水中，加熱至完全溶解，冷卻后加入正丁醇10 mL，室內(nèi)靜置24 h，2 000 r/min離心10 min，無水乙醇洗滌3次，沉淀真空冷凍干燥機中干燥24 h獲得直鏈淀粉。

經(jīng)濟學(xué)家利用博弈模型比較獨立研發(fā)和合作研發(fā)的市場績效，從而揭示企業(yè)從事合作研發(fā)的條件和內(nèi)在機理。他們主要從三個維度展開比較：企業(yè)的研發(fā)投資量、產(chǎn)品市場勢力、利潤和社會福利。他們的基本觀點是，技術(shù)溢出(technology spillover)是減少企業(yè)研發(fā)投入的主要原因，而合作研發(fā)可以克服這一缺陷。1998年之前的早期研究模型抽象，假設(shè)條件苛刻。而之后的近期模型放松了假定條件同時拓展了研究對象，研究朝著更為具體和細致的方向發(fā)展，也更具應(yīng)用性。

1.2.2.4 DMSO鹽析法

5 g淀粉加入40 mL DMSO和10 mL去離子水，攪拌至乳液狀轉(zhuǎn)移至60 ℃恒溫水浴，持續(xù)攪拌30 min后, 移除水浴，加10 mL正丁醇，混勻后冷卻至室溫，待溶液中析出細針型沉淀，2 000 r/min離心30 min，去上清，沉淀加10 mL 2% NaCl，振蕩混勻，緩慢加入10 mL正丁醇，渦旋混勻后，2 000 r/min離心30 min，重復(fù)結(jié)晶過程6次，真空冷凍干燥機中干燥24 h備用。

1.3 直鏈淀粉質(zhì)量測定

直鏈淀粉提取率=直鏈淀粉質(zhì)量/原淀粉質(zhì)量(干基)。

藍值(mg/100 mL)測定：配制直鏈淀粉、支鏈淀粉和CK標(biāo)準(zhǔn)對照后，進行測定[9-11]。

藍值=A×4/樣品的濃度

碘-淀粉復(fù)合物吸收光譜：以藍值測定所用的標(biāo)準(zhǔn)溶液于500～800 nm進行連續(xù)光譜掃描分析。

晶體特性的測定：X-衍射條件：Cuka輻射，管壓40 kV，管流40 mA，掃描速度4 (°)/min。淀粉樣品粉碎后通過60目篩。

掃描電子顯微鏡(SEM)分析：將干燥樣品充分混合，均勻黏附于樣品臺表面，離子濺射儀噴金固定8 min，掃描電子顯微鏡(HITACHI SN3500)檢測成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料及方法對提取率的影響

結(jié)果如表1所示，不同方法的提取率存在顯著差異。以DMSO鹽析法和蒸餾分散法最高，當(dāng)分別用普通玉米淀粉和高直鏈淀粉為原料時，提取率依次為22.67%、22.70%和46.67%、43.73%，顯著高于其他3種方法。以高速凝沉法提取率最低，平均提取率僅16.36%。以從普通淀粉(相對直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%)和高直鏈淀粉(相對直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)53%)實際抽提直鏈淀粉的量占這2種淀粉中總直鏈淀粉量(分別為1.25、2.65 g)的百分比計算直鏈淀粉提取率時，普通淀粉5種方法的平均提取率為63.46%，高直鏈淀粉為64.88%，二者在提取率上沒有明顯差異。這說明高直鏈淀粉中，直鏈淀粉在淀粉粒中的分布方式可能與普通淀粉類似，這種直鏈淀粉含量的差異并未對直鏈淀粉的提取率帶來明顯影響。

表1 普通玉米淀粉和高直鏈玉米淀粉的直鏈淀粉提取率

注：所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同提取方法對直鏈淀粉藍值的影響

藍值是表征直鏈淀粉純度的重要指標(biāo)之一，它體現(xiàn)了淀粉與碘的結(jié)合能力。通常線性聚合度越高，藍值越高。理論上直鏈淀粉藍值在0.8～1.2之間，本研究中，不同方法提取的直鏈淀粉藍值在0.78～1.11間，LRP法的藍值為0.78，HRP的藍值為0.84，DD的藍值為0.83，DMD的藍值為1.11，DMS的藍值為0.91，均低于對照馬鈴薯直鏈淀粉1.19的藍值。其中以DMSO分散法提取的直鏈淀粉藍值與馬鈴薯標(biāo)準(zhǔn)直鏈淀粉的藍值最相近，表明此法獲得的直鏈淀粉純度較高，以高轉(zhuǎn)速凝沉法和DMSO鹽析法提取的直鏈淀粉藍值次之，分別達到0.94和0.91。低轉(zhuǎn)速凝沉法的藍值最低為0.78，表明此法獲得的直鏈淀粉純度低于其他方法。

圖1 不同方法提取直鏈淀粉的藍值

2.3 不同提取方法對直鏈淀粉吸收光譜的影響

利用直鏈淀粉和支鏈淀粉與碘形成的復(fù)合物在紫外分光光度計掃描下形成的最大吸收波長差異也可進行直鏈淀粉純度判定。研究表明，直鏈淀粉-碘復(fù)合物吸收峰通常在600～680 nm之間，而直鏈淀粉的最大吸收波長為630 nm[12-14]。圖2展示了5種方法提取玉米直鏈淀粉及對照馬鈴薯直鏈淀粉的全波長掃描光譜圖。其中對照馬鈴薯直鏈淀粉的吸收波長峰值為628 nm，最接近630 nm的標(biāo)準(zhǔn)值；其次為高轉(zhuǎn)速凝沉法和DMSO分散法提取直鏈淀粉的吸收波長峰值，約為623 nm，表明這2種方法提取的直鏈淀粉純度較高；其余3種方法獲得的直鏈淀粉吸收波長峰值在600 nm左右，這可能是由于這3種方法提取的直鏈淀粉中摻雜有支鏈淀粉、蛋白等雜質(zhì)。

注：1低轉(zhuǎn)速凝沉法，2 高轉(zhuǎn)速凝沉法，3 蒸餾分散法，4 DMSO分散法，5 DMSO鹽析法。

圖2 不同方法提取直鏈淀粉的吸收光譜

2.4 不同提取方法對直鏈淀粉晶體特性的影響

X射線衍射(XRD)是分析晶體結(jié)構(gòu)的有效方法之一。淀粉顆粒的X晶體衍射圖譜上在多處衍射角存在吸收峰，代表了淀粉的結(jié)晶區(qū)域，根據(jù)2θ角衍射峰的分布可將原淀粉的晶體結(jié)構(gòu)劃分為A、B和C型。當(dāng)?shù)矸劢?jīng)過變性處理時，原有晶體結(jié)構(gòu)被破壞并發(fā)生重結(jié)晶，晶體結(jié)構(gòu)會變?yōu)閂型[15]。圖3的檢測結(jié)果表明，提取方法及材料來源對淀粉粒的晶體類型存在顯著影響，自提直鏈淀粉與對照馬鈴薯直鏈淀粉結(jié)晶構(gòu)型均不同于原淀粉普通淀粉的A構(gòu)型和高直鏈淀粉的B構(gòu)型，屬于重結(jié)晶的V構(gòu)型，它們均在21°、23°、27°左右出現(xiàn)明顯的衍射峰，而2種沉降法、蒸餾分散法和DMSO分散法4種方法提取的直鏈淀粉還在7°、13°附近出現(xiàn)明顯的衍射峰，這與Bail等[16]報道的熱熔淀粉的重結(jié)晶構(gòu)型一致，屬于Vh型晶體。

圖3 5種方法提取直鏈淀粉的X射線衍射圖譜

只有DMSO鹽析法得到的淀粉構(gòu)型與對照馬鈴薯直鏈淀粉的構(gòu)型最接近，沒有7°、13°附近的衍射峰，這說明對照馬鈴薯淀粉可能也是通過相同方法提取。X射線衍射圖譜中衍射峰峰下區(qū)域的面積代表了晶體內(nèi)非結(jié)晶區(qū)部分的比例，而峰面積代表了結(jié)晶區(qū)，因此晶體的結(jié)晶度隨衍射峰的數(shù)量、寬度和高度的增高而增高[17]。根據(jù)表2的統(tǒng)計數(shù)據(jù)可以看出，在原淀粉中高直鏈淀粉的結(jié)晶度為15.48%明顯低于普通淀粉的18.6%，這說明直鏈淀粉含量的增加和支鏈淀粉的減少改變了淀粉粒的構(gòu)架組成，使淀粉的結(jié)晶度降低，這一結(jié)果與前人報道一致[16-17]。自提直鏈淀粉中以DMS法的結(jié)晶度最低僅為1.88%，也低于對照馬鈴薯淀粉2.34%的結(jié)晶度，其他4種方法提取的直鏈淀粉結(jié)晶度在18.60%～22.66%之間。

表2 不同方法提取直鏈淀粉的X晶體衍射參數(shù)

注：NCS 普通玉米淀粉；HACS 高直鏈玉米淀粉；PA 馬鈴薯直鏈淀粉。

2.5 不同來源直鏈淀粉SEM表觀特征分析

SEM圖是表征顆粒表面形貌的有效手段，以掃描電鏡觀察原淀粉及提取直鏈淀粉顆粒的表面形貌如圖4所示，原淀粉和提取直鏈淀粉顆粒的表面形貌存在很大差異，普通玉米原淀粉多呈球狀(B型顆粒直徑<10 μm)或多面體狀(A型顆粒直徑>10 μm)，飽滿，表面有蠟質(zhì)光澤(圖4a)。高直鏈原淀粉顆粒則扭曲呈不規(guī)則形狀，存在一定程度的皺縮，且在A型顆粒上發(fā)生的皺縮和扭曲程度似乎高于B型顆粒，淀粉粒表面也存在蠟質(zhì)光澤(圖4b)，這與前人的研究結(jié)果一致[18-19]。理論上直鏈淀粉以線性大分子形式沉積于支鏈淀粉形成的骨架之間，當(dāng)直鏈淀粉被析出或分散到提取體系中后，原有的淀粉顆粒結(jié)構(gòu)被完全破壞，這些直鏈淀粉在正丁醇等凝沉劑的作用下，相互纏繞沉積成無固定形狀的沉積物，經(jīng)過脫水干燥等處理后，外觀呈現(xiàn)白色的片層狀顆粒，其SEM圖片如圖4c～圖4g所示，顆粒呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，有明顯的層狀沉積痕跡，不同提取方法來源的直鏈淀粉顆粒仍然呈現(xiàn)一定程度的蠟質(zhì)質(zhì)感，不同提取方法間無可見差異。其結(jié)構(gòu)特征均與對照馬鈴薯直鏈淀粉相似(圖4h)。

圖4 提取直鏈淀粉SEM圖

3 討論

目前實驗室中常用的直鏈淀粉的提取方法主要有凝沉法、分散法和鹽析法，提取過程中的離心時間和速度對直鏈淀粉的提取質(zhì)量均有較大影響。李德海等[20]以玉米淀粉為材料，用凝沉法提取直鏈淀粉時發(fā)現(xiàn)： 8 000～8 500 r/min是提取直鏈淀粉的最適轉(zhuǎn)速，在4 000 r/min條件下得到的直鏈淀粉的藍值僅為0.8，遠低于8 000 r/min的藍值，這與本研究結(jié)果一致。蒸餾、DMSO試劑都可以使淀粉分散。蒸餾法多適用與馬鈴薯直鏈淀粉提取，曾凡逵等[21]就以馬鈴薯為材料，使用蒸餾分散法得到吸收光譜峰值為630 nm的標(biāo)準(zhǔn)直鏈淀粉。楊澤敏等[8]曾用DMSO分散法提取水稻直鏈淀粉，卻少見于玉米直鏈淀粉的提取。試驗證明，DMSO分散法適用于提取玉米直鏈淀粉，對藍值、吸收光譜以及結(jié)晶度等的分析表明該方法得到的玉米直鏈淀粉具有很高純度。

XRD衍射法是檢測顆粒晶體類型的常規(guī)方法，根據(jù)前人的研究原淀粉的晶體類型可分為A、B、C 3種，影響淀粉晶體結(jié)構(gòu)的因素很多，如來源、淀粉組成、加工方式等。禾谷類作物淀粉通常為A型，馬鈴薯等塊根類淀粉多為B型晶體，而豌豆、荸薺等淀粉為C型晶體；直鏈淀粉含量也影響淀粉的晶體結(jié)構(gòu)，Norman等[14]研究了不同直鏈淀粉含量的玉米淀粉的X射線晶體衍射圖譜，結(jié)果表明：隨著直鏈淀粉含量的增加，玉米淀粉的晶體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為一個由A型經(jīng)C型轉(zhuǎn)變?yōu)锽型晶體的過程，當(dāng)直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于40%時，玉米淀粉為典型的A型晶體，直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過50%，淀粉的晶體結(jié)構(gòu)為典型的B型。當(dāng)直鏈淀粉被析出凝沉?xí)r，會發(fā)生重結(jié)晶，重結(jié)晶后的直鏈淀粉晶體結(jié)構(gòu)完全不同于原淀粉的晶體結(jié)構(gòu)。熊善柏等[25]測量了水稻直鏈淀粉的晶體特征，發(fā)現(xiàn)水稻直鏈淀粉在2θ角13°和20°左右存在明顯衍射峰，結(jié)晶度在24.99%～23.10%之間，而支鏈淀粉只在20°處有明顯吸收峰。這與研究結(jié)果存在一定差異，除13°和20°外，在7°和23°亦出現(xiàn)了吸收峰。但杜先鋒等[26]的研究中，葛根的直鏈淀粉在7°和23°也存在吸收峰，說明直鏈淀粉來源對晶體特征也存在影響。

4 結(jié)論

不同直鏈淀粉含量的淀粉原料不影響直鏈淀粉的提取率。在5種提取方法中，高轉(zhuǎn)速凝沉分離法和二甲基亞砜(DMSO)分散法雖然提取率略低，但在藍值、吸收波峰、電鏡圖像、結(jié)晶度等參數(shù)上優(yōu)于其他3種方法。

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The Isolation and Identification of Maize Amylose

Zhong Yuyue Zhang Xudong Shi Hanyu Liu Linsan Wu Quanming Zhang Renhe Xu Shutu Xue Jiquan Guo Dongwei

(The Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Maize in Arid Area of Northwest Region, Ministry of Agriculture,College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100)

In this paper, five methods including precipitation separation, etc. were employed to isolate amylose from maize high-amylose starch and normal starch. Differences in extraction efficiency and quality were compared. The results showed that there is no obvious difference in the average extraction rate of five extraction methods between maize high-amylose starch and normal starch. Distillation dispersion method and DMSO salting out method had the highest extraction rate (33.22% and 34.67%), while high-rpm precipitation seperation method had the lowest extraction rate of 16.36%. In addition, there were obvious differences in five Purity parameters: blue value, absorption spectrum, SEM and XRD of amylose derived from different isolation method. In conclusion, despite of low extraction rates by precipitation separation method and DMSO dispersion method, the purity of amylose extracted by them is higher than the purity by using remaining three methods.

high-amylose maize starch，amylose，isolation，purity，identification

TS201

A

1003-0174(2016)10-0039-06

時間：2016-09-30 10:48:27

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2864.TS.20160930.1048.002.html

楊凌示范區(qū)科技計劃(2014NY-01)，陜西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)專項(K33202135)，陜西省科技統(tǒng)籌專項(2015KT ZDNY01-01-01)

2015-06-30

鐘雨越，男，1993年出生，碩士，作物遺傳育種

郭東偉，男，1973年出生，副教授，高直鏈淀粉玉米育種