Wx基因對小麥淀粉合成關鍵酶活性的影響

覃 鵬 孔治有 劉葉菊 唐永生 楊俊華

(云南農業(yè)大學農學與生物技術學院1, 昆明 650201) (保山學院資環(huán)學院2, 保山 678000) (云南農業(yè)大學研究生處3, 昆明 650201) (曲靖市農業(yè)科學院4, 曲靖 655000) (德宏州農業(yè)科學研究所5, 芒市 678400)

Wx基因對小麥淀粉合成關鍵酶活性的影響

覃 鵬1孔治有2劉葉菊3唐永生4楊俊華5

(云南農業(yè)大學農學與生物技術學院1, 昆明 650201) (保山學院資環(huán)學院2, 保山 678000) (云南農業(yè)大學研究生處3, 昆明 650201) (曲靖市農業(yè)科學院4, 曲靖 655000) (德宏州農業(yè)科學研究所5, 芒市 678400)

為研究Wx基因的缺失對小麥淀粉合成關鍵酶活性的影響，本試驗以8個Wx小麥近等基因系為材料，在灌漿期的10、20、30和40 d取籽粒對ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、可溶性淀粉合成酶(SSS)、顆粒結合型淀粉合成酶(GBSS)和淀粉分支酶(SBE)活性進行了測定。結果表明：野生型的AGPase、SSS、GBSS和SBE活性在花后所有時期均最高(GBSS花后40 d除外，處于中間水平)，而WxABD型4種淀粉合成相關酶活性幾乎在整個灌漿期均低于其余基因型，尤其是WxABD型的GBSS活性盡管也呈現(xiàn)先升高后降低、20 d左右達到高峰的趨勢，但其升高或降低的幅度很小，其活性相對較為穩(wěn)定。研究證明小麥Wx基因缺失對淀粉合成關鍵酶活性影響較大，依次為Wx-D1>Wx-A1>Wx-B1；淀粉合成關鍵酶活性在花后逐漸增加，以花后20 d最大，此后逐漸降低，到40 d達最低值；WxABD型缺失所有Wx基因，淀粉合成酶活性在花后各時期最低，其中GBSS活性遠低于其余基因型且在花后各時期變化較小。

小麥 淀粉合成關鍵酶活性Wx近等基因系 灌漿期

淀粉是小麥籽粒的重要組成部分，是由小麥葉、鞘等綠色器官制造的光合同化物以蔗糖的形式運輸?shù)阶蚜０?、再在一系列酶的催化作用下轉化為腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)或葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)、最后轉運至淀粉質體中合成籽粒淀粉[1-2]。蔗糖合成酶(SS)催化籽粒中的蔗糖降解為尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和果糖，為淀粉的生物合成提供原料[3]；磷酸蔗糖合成酶(SPS)主要是將6-磷酸果糖(F-6-P)轉變合成為6-磷酸蔗糖[4-6]；腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是ADP-葡萄糖，即形成直鏈淀粉和支鏈淀粉的骨架的合成酶，因此是淀粉生物合成的限速酶[7]；顆粒結合性淀粉合成酶(GBSS)作用于α-1,4-糖苷鍵，只負責直鏈淀粉的合成；可溶性淀粉合成酶(SSS)催化將葡萄糖分子轉移到淀粉引物上，使淀粉鏈延長[8]；淀粉分支酶(SBE)催化α-1,4-糖苷鍵水解，形成α-1,6-糖苷鍵而在淀粉鏈上形成分支[9-11]；脫分支酶(DBE)水解α-1,6-糖苷鍵以調節(jié)分支和支鏈淀粉結晶度[12-14]。所有酶活性在灌漿期均呈單峰曲線，在花后10～25 d達到峰值[15-17]。

由Waxy基因(Wxgene)編碼的顆粒結合型淀粉合成酶(Granule bound starch synthase，GBSS)是合成直鏈淀粉的關鍵酶。六倍體小麥的Waxy蛋白受3個不同的Wx基因編碼，其缺失、突變或遺傳表達障礙會使胚乳中直鏈淀粉含量減少和支鏈淀粉含量增加[18-21]。Wx基因的缺失在很大程度上會影響小麥的淀粉含量，但是對于作為淀粉合成關鍵酶活性的影響鮮見報道，而此前有關小麥淀粉合成的研究因受到遺傳背景的限制會有很大程度的局限性。本研究將Wx基因轉入寧麥14并不斷回交獲得的8個近等基因系具有相同遺傳背景，而以其研究Wx基因對小麥淀粉合成關鍵酶活性的影響，可以排除其他因素對研究結果所造成的影響，真實反映Wx基因對小麥淀粉合成關鍵酶的作用，對進一步研究Wx基因對小麥淀粉品質和農藝性狀的影響具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

以普通非糯小麥品種寧麥14與糯小麥品系Wx揚繁9進行雜交，以后每代均選取與母本農藝性狀接近且基因型為Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1 3個位點均雜合的單株作父本進行連續(xù)回交，雜合單株的判斷方法為用0.07%I2-KI溶液對雜交和回交后代花粉染色并用顯微鏡檢查，淘汰全部呈現(xiàn)黑色(深藍色)的單株，而約1/8花粉呈黃色、7/8花粉呈黑色的單株予以保留并掛牌作為父本。到BC7F1自交獲得BC7F2群體，分子標記選擇最終獲得8個Wx近等基因系(表1)。

8個小麥Wx近等基因系于2013年11月種植于保山學院基地，花后每隔10 d取樣測定籽淀粉合成關鍵酶活性。

表1 8個小麥Wx近等基因系

注：+表示顯性，-表示隱性。

1.2 方法

從開花起標記同一天開花的8個基因型的穗子，在花后10、20、30、40 d取樣，每個基因型每次取5穗(即5次重復)；剝取中部的4個小穗籽粒用于淀粉合成關鍵酶活性的測定和分析。

AGPase、SSS、GBSS和SBE的測定參照譚彩霞等[22]的方法略作改進。測定儀器為DR6000紫外分光光度計：美國哈希(HACH)公司。

1.3 統(tǒng)計分析

每個基因型重復5次，以SAS9.0進行統(tǒng)計分析，顯著性標記為P<0.05和P<0.01。

2 結果與分析

在8種基因型之間以及花后不同時間之間，AGPase、SSS、GBSS和SBE等4種酶的活性均達到極顯著差異(表2)。

表2 淀粉合成關鍵酶活性方差分析(F值)

注：*表示0.05顯著水平，**表示0.01顯著水平。

野生型的AGPase、SSS、GBSS和SBE活性均最高、而WxABD的均最低，其他基因型介于二者之間(表3)；Wx-D1基因的缺失對4種淀粉合成關鍵酶活性的影響最大、Wx-A1次之而Wx-B1最小，但差異均未達顯著水平。

表3 各Wx基因型之間淀粉合成相關酶活性差異顯著性/nmol/(1 000粒·min)

注：表中每列相同字母表示無顯著差異。大寫字母表示0.01顯著水平，小寫字母表示0.05顯著水平。下同。

隨花后時間推移，AGPase、SSS、GBSS和SBE活性均呈先升高、花后20 d達最大值、此后急劇降低的變化，到花后40 d、即籽?；境墒鞎r酶活性最低(表4)。

表4 花后不同時間淀粉合成關鍵酶活性差異顯著性/nmol/(1 000 ?！in)

所有基因型的AGPase、SSS、GBSS和SBE(圖1)活性在花后隨灌漿時間的延長而逐漸增加、20 d左右達到峰值、隨后急劇降低。其中野生型的AGPase、SSS、GBSS和SBE活性在花后所有時期均最高(GBSS花后40 d除外，處于中間水平)；在灌漿10 d時，WxAB的AGPase活性最高、GBSS活性也僅次于野生型，而其SBE活性最低；WxABD型4種淀粉合成相關酶活性幾乎在整個灌漿期均低于其余基因型，尤其是WxABD型的GBSS活性盡管也呈現(xiàn)先升高后降低、20 d左右達到高峰的趨勢，但其升高或降低的幅度很小，其活性相對較為穩(wěn)定。

圖1 灌漿期小麥Wx近等基因系AGPase、SSS、GBSS和SBE活性

3 討論

作為淀粉合成關鍵酶之一，顆粒結合型淀粉合成酶(GBSS)由Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1等3個基因位點控制，控制這小麥籽粒中直鏈淀粉的合成。淀粉合成的機理非常復雜，遺傳因素和環(huán)境因素都會對淀粉的合成產(chǎn)生影響，此前的一些研究由于對遺傳和環(huán)境影響很難嚴格控制，難免引起最終結果與實際情況產(chǎn)生偏離。本研究采用遺傳背景一致、僅3個Wx基因位點存在差異的8個近等基因系作為材料，另外種植環(huán)境和栽培管理措施完全一樣，從而排除遺傳和環(huán)境因素的干擾，可以真實體現(xiàn)3個Wx基因的缺失與否對淀粉合成關鍵酶產(chǎn)生的影響，可豐富淀粉合成機理相關理論，為將來小麥Wx基因的進一步研究及利用突進提供參考。

本研究中，野生型的AGPase、SSS、GBSS和SBE活性均最高，而WxABD的均最低，其他基因型介于二者之間，表明任何Wx基因的缺失都會導致淀粉合成關鍵酶活性的降低，并可能最終導致淀粉合成速度的減緩及最終籽粒內淀粉含量的減少。其中Wx-D1基因的缺失影響最大，降低淀粉合成酶活性的效果最為顯著。隨開花時間的延長和灌漿的進行，AGPase、SSS、GBSS和SBE活性均急劇增加，反映了小麥籽粒從花后逐漸開始灌漿，隨時間延長灌漿進程加快的趨勢；在花后20 d達最大值，表明此時灌漿速率最快，因淀粉合成關鍵酶活性的增強而產(chǎn)生更多的淀粉，是淀粉合成的關鍵時期，因此對水分和營養(yǎng)的需求也必然到達頂點；隨后又急劇降低、到花后40 d籽?；境墒鞎r酶活性降到最低，表明灌漿和淀粉合成經(jīng)過一段時間的高速階段后自然減緩，也與小麥植株的生育時期密切相關，此時葉片逐漸衰老、種子由乳熟趨于完熟即將收獲。3個Wx基因對淀粉合成關鍵酶活性的影響也不相同，依次為Wx-D1>Wx-A1>Wx-B1，但是WxBD型缺失了Wx-D1和Wx-B1基因后其GBSS和AGPase活性反而異常高于除野生型外的其他基因型，這可能與其SSS和SBE活性相對于其他基因型較低有關，也就是淀粉合成酶和淀粉分支酶活性的降低導致與直鏈淀粉合成相關的GBSS活性的相對增加，但缺失Wx-D1和Wx-B1基因引起的這種變化與淀粉合成動態(tài)不盡一致，可能是相互作用導致的，但仍需深入研究酶活性與淀粉合成，尤其是直鏈淀粉合成之間直接相關性，以及酶活性大小與淀粉合成不完全一致的內在因素。WxABD型由于缺失了全部Wx基因，因此各種淀粉合成酶的活性在花后各時期不僅低于野生型、也低于缺失1個或2個Wx基因的其他型，尤其是由這3個Wx基因直接控制的GBSS活性，盡管隨花后時間的延長也呈現(xiàn)先升高后降低、20 d左右達到峰值的趨勢，但其升高或降低的幅度都很小，其活性相對較為穩(wěn)定，這也反映了直鏈淀粉的合成情況，導致最終該類型小麥籽粒中直鏈淀粉的含量極低(<2%)或完全喪失。

目前鮮見Wx基因對淀粉合成關鍵酶的作用方式及作用機理的相關研究結果，而以小麥Wx近等基因系來研究小麥淀粉合成關鍵酶也鮮見報道，今后仍須進行深入研究，發(fā)掘其必然聯(lián)系才能最終明確Wx基因在小麥淀粉合成過程中所起作用及其影響因素。

4 結論

4.1 小麥Wx基因缺失對淀粉合成關鍵酶活性影響較大，依次為Wx-D1>Wx-A1>Wx-B1。

4.2 淀粉合成關鍵酶活性在花后逐漸增加，以花后20 d最大，此后逐漸降低，到花后40 d達最低值。

4.3WxABD型缺失所有Wx基因，淀粉合成酶活性在花后各時期最低，其中GBSS活性遠低于其余基因型且在花后各時期變化較小。

[1]彭佶松, 鄭志仁, 劉滌,等. 淀粉的生物合成及其關鍵酶[J]. 植物生理學通訊, 1997, 33(4): 297-303

Peng J S, Zheng Z R, Liu D,et al. Starch biosynthesis and its key enzymes[J]. Plant Physiology Communications, 1997, 33(4): 297-303

[2]Okita T W. Is there an alternative pathway for starch synthesis?[J]. Plant Physiology, 1992, 100(2): 560-564

[3]Sturm A，Tang G Q. The sucrose-cleaving enzymes of plants are crucial for development，growth and carbon partitioning[J]. Trends in Plant Science, 1999(4): 401-407

[4]李永庚, 于振文, 姜東，等. 冬小麥旗葉蔗糖和籽粒淀粉合成動態(tài)及與其有關的酶活性的研究[J]. 作物學報, 2001, 27(5): 658-664

Li Y G, Yu Z W, Jiang D, et al. Studies on the dynamic changes of the synthesis of sucrose in the flag leaf and starch in the grain and related enzymes of high-yieding wheat[J]. ACTA Agrionomica Sinica, 2001, 27(5): 658-664

[5]Huber S C,Huber J I. Role and regulation of sucrose-phosphate synthase in higher plants[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 1996(47): 431-444

[6]黃東亮, 李雙喜, 廖青，等. 植物蔗糖磷酸合成酶研究進展[J]. 中國生物工程雜志, 2012, 32(6): 109-119

Huang D L, Li S X, Liao Q, et al. Advances on sucrose phosphate synthase in plants[J]. China Biotechnology, 2012, 32(6): 109-119

[7]Kang G Z, Wang Y H, Liu C, et a1. Difference in AGPase subunits could be associated with starch accumulation in grains between two wheat cultivars[J]. Plant Growth Regulation, 2010，61(1): 61-66

[8]Shimbata T, Ai Y F, Fujita M, et a1. Effects of homoeologous wheat starch synthase IIa genes on starch properties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(48): 12004-12010

[9]Regina A, Kosar-Hashemi B, Li Z, et a1. Starch branching enzyme IIb in wheat is expressed at low levels in the endosperm compared to other cereals and encoded at a non-syntenic locus[J]. Planta, 2005, 222: 899-909

[10]Han Y, Sun F J, Rosales M S，et a1．Three orthologs in rice, Arabidopsis, and Populus encoding starch branching enzymes (SBEs) are different from other SBE gene families in plants[J]. Gene, 2007, 401: 123-130

[11]Peng M, Hucl P, Chibbar R N. Isolation, characterization and expression analysis of starch synthase I from wheat (TriticumaestivumL.)[J]. Plant Science, 2001, 161: 1055-1062

[12]Jeon J S, Ryoo N, Hahn T R, et a1. Starch biosynthesis in cereal endosperm[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2010, 48: 383-392

[13]Zeeman S C, Smith S M, Smith A M. The diurnal metabolism of leaf starch[J]. The Biochemical Journal, 2007, 401 (1): 13-28

[14]Utsumi Y, Utsumi C, Sawada T, et a1. Functional diversity of isoamylase oligomers: the ISA1 homo-oligomer is essential for amylopectin biosynthesis in rice endosperm[J]. Plant Physiology, 2011, 156(1): 61-77

[15]Thitisaksakul M,Jimnez R C, Arias M C, et a1. Effects of environmental factors on cereal starch biosynthesis and composition[J]. Journal of Cereal Science, 2012, 56(1):67-80

[16]李建敏, 王振林, 高榮岐，等. 強、弱筋小麥籽粒形成期蔗糖、淀粉合成相關酶活性及其與氮代謝的關系[J]. 作物學報, 2008, 34(6): 1019-1026

Li J M, Wang Z L, Gao R Q, et al. Activities of enzymes involved in sucrose and starch synthesis during grain filling and the relation to nitrogen metabolism in strong-and wak-gluten wheat cultivars[J]. ACTA Agrionomica Sinica, 2008, 34(6): 1019-1026

[17]曹穎妮. 小麥籽粒灌漿期淀粉合成酶學機制及基因表達模式的研究[D]. 楊凌: 西北農林科技大學, 2012

Cao Yingni. Study on the mechanism of starch synthesis and gene expression pattern during grain filling stage in wheat[D]. Yangling: North West Agriculture and Forestry University. 2012

[18]Anisworth C, Tarvis M, Clark J. Isolation and analysis of cDNA clone encoding the small subunit of ADP-glucose pyrophosphorylase from wheat[J]. Plant Molecular Biology, 1993, 23: 23-33

[19]Nakamura T, Yamamori M, Hirano H, et al. Identification of three waxy proteins in wheat (TriticumaestivumL.) [J]. Biochemical Genetics, 1993, 31(1-2): 75-86

[20]Yamamori M, Endo T R. Variation of starch granule proteins and chromosome mapping of their coding genes in common wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics, 1996, 93(1-2): 275-281

[21]Sun C, Puthigae S, Staffan A, et al. The two genes encoding starch-branching enzymes Ⅱa and Ⅱb are differentially expressed in barley[J]. Plant Physiology, 1998, 118: 37-49

[22]譚彩霞, 郭靜, 陳靜，等. 弱筋小麥籽粒淀粉合成特性與酶基因表達的關系[J]. 揚州大學學報(農業(yè)與生命科學版), 2009, 30(1): 84-89

Tan C X, Guo J, Chen J, et al. Relationship between grain starch synthesis and starch synthase gene expression in weak gluten wheat[J]. Journal of Yangzhou University (Agricultural and Life Science Edition), 2009, 30(1): 84-89.

Effect of Wx Genes on Key Enzyme Activities of Starch Biosynthesis in Wheat

Qin Peng1Kong Zhiyou2Liu Yeju3Tang Yongsheng4Yang Junhua5

(College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University1, Kunming 650201) (College of Resources and Environment,Baoshan University2, Baoshan 678000)(Postgraduate Administration Offices, Yunnan Agricultural University3, Kunming 650201)(Qujing Agricultural Science Academy4, Qujing 655000) (Dehong Agricultural Science Institution5, Mangshi 678400)

In order to investigate the effect of absence ofWx gene on key enzymes activity of starch biosynthesis in wheat, 8 near-isogenicWx wheat genes were used. The activities of ADP-glucose pyrophosphorylase polypeptide (AGPase), soluble starch synthase (SSS), granule-bound starch synthase (GBSS) and starch branch-ingenzyme (SBE) were determined during the grain filling period at 10, 20, 30 and 40 d in this study. The results showed that the AGPase, SSS, GBSS and SBE activity of wild type were the highest at all times after anthesis (excepted for GBSS activity at 40 d after anthesis which was at an intermediate level). However, related enzymes activity of 4 kinds of starch synthesis inWxABD was lower than all other genotypes in the whole grain filling stage, especially the GBSS activity of which, although increased first and then decreased, and reached to the peak trend at about 20 d after anthesis, but the increasing or decreasing of the amplitude was very small, and the activity was relatively stable. This study Showed that the greater impact of lack ofWx genes in wheat on the key enzyme activities of starch biosynthesis was observed, and the effect of threeWx genes wasWx-D1>Wx-B1>Wx-B1; the activities of key enzyme of starch biosynthesis were gradually increased at the end of anthesis, which reached to the maximum value 20 d after anthesis, and then decreased gradually, which reached the minimum value 40 d after anthesis; for allWxWxABD type-free genes, synthetase activities of starch biosynthesis ofWxABD were the lowest in all stages at the end of anthesis, of which GBSS activity was much lower than the otherWx-genotypes and had little changes in all stages after anthesis.

wheat, key enzyme activity of starch biosynthesis,Wx near-isogenic lines, filling stage

S512.01

A

1003-0174(2016)10-0006-05

國家自然科學基金(31000712)

2015-02-02

覃鵬，男，1977年出生，副教授，小麥遺傳育種與品質改良