響應(yīng)面法優(yōu)化板栗抗性淀粉制備工藝

姚 慧 呂 佼 歐陽杰 王建中 王豐俊

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

響應(yīng)面法優(yōu)化板栗抗性淀粉制備工藝

姚 慧 呂 佼 歐陽杰 王建中 王豐俊

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

為了提高板栗抗性淀粉含量，并獲得抗性淀粉制備方法的最適工藝參數(shù),本研究?jī)?yōu)化了壓熱—普魯蘭酶法制備板栗抗性淀粉的工藝，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法研究淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、普魯蘭酶添加量、酶解時(shí)間和冷凝時(shí)間對(duì)抗性淀粉得率的影響，建立各因素與抗性淀粉得率關(guān)系的數(shù)學(xué)回歸模型。最終根據(jù)實(shí)際工藝操作確定最佳的制備工藝條件為淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.00%，酶添加量9 PUN/g、酶解時(shí)間10 h、冷凝時(shí)間15 h。在該制備條件下，測(cè)得抗性淀粉得率為64.90%，基本符合理論預(yù)測(cè)值(65.70%)。試驗(yàn)證明，響應(yīng)面法能夠提高板栗抗性淀粉的制備率。

抗性淀粉 普魯蘭酶 板栗淀粉 響應(yīng)面

抗性淀粉(resistant starch，RS)，即不被健康人體小腸吸收的淀粉及其水解物的總稱[1]。根據(jù)抗性淀粉形態(tài)及物理化學(xué)性質(zhì)，可將其分為4 類：物理包埋淀粉(RS1)、抗性淀粉顆粒(RS2)、回生淀粉(RS3)和化學(xué)改性淀粉(RS4)。RS3類似于膳食纖維，但RS3具有更優(yōu)良的加工特性，最具研究?jī)r(jià)值。一般認(rèn)為其形成機(jī)理是：淀粉糊化后在冷卻過程中，短直鏈淀粉形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，雙螺旋之間聚合形成螺旋聚集體，在此基礎(chǔ)上形成抗酶晶體[2]。RS3的制備通常采用壓熱處理法和脫支法，或者二者相結(jié)合的方法[3]。壓熱處理過程中淀粉顆粒完全破裂，其中的直鏈淀粉完全游離出來，促進(jìn)直鏈分子之間相互結(jié)合形成氫鍵；酶水解淀粉分子中的α-1.6糖苷鍵，生成更多的游離直鏈淀粉，在淀粉冷卻回生過程中，促使直鏈淀粉雙螺旋的締合，形成抗性晶體[4-5]。所以選擇壓熱-酶法相結(jié)合來探究制備抗性淀粉的可能性。

關(guān)于抗性淀粉的研究，蹇華麗等[6]以玉米為原料，研究了抗性淀粉的結(jié)晶性質(zhì)；陳戀[7]以蕨根為原料，研究了抗性淀粉的糊化性質(zhì)；邵秀芝[8]以小麥為原料，研究了抗性淀粉的流變學(xué)特性及表觀結(jié)構(gòu)特性。然而，對(duì)板栗抗性淀粉的研究鮮見報(bào)道。本研究以板栗為原料，分離提取淀粉，通過淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶添加量、酶解時(shí)間和冷凝時(shí)間控制制備工藝，探究制備規(guī)律，進(jìn)而采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件，提高抗性淀粉得率，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1材料與試劑

新鮮板栗：河北栗源食品有限公司；普魯蘭酶(3 000 PUN/g)、耐高溫α-淀粉酶：丹麥諾維信公司；胃蛋白酶(3 000 U/g)、葡萄糖淀粉酶(10 000 U/g)：北京科百奧試劑公司。

1.2 主要儀器

SCIENTZ-12N冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉的提取

鮮板栗去殼切片，按料液比1：4與0.2%NaOH溶液混合后打漿，過80目和200目篩并擠壓殘?jiān)?，將濾液靜置12 h后，3 500 r/min離心10 min，沉淀物即為板栗淀粉，冷凍干燥后備用。

1.3.2 板栗抗性淀粉制備

取5.0 g板栗淀粉于150 mL三角瓶中，加一定量水，配制成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的淀粉懸浮液于80 ℃電熱恒溫水浴鍋中進(jìn)行糊化處理15 min。迅速移至高壓滅菌鍋中進(jìn)行121℃、15 min壓熱處理并自然冷卻降至55 ℃，用1 mol/L HCl溶液調(diào)整pH值到5.7，添加不同質(zhì)量的普魯蘭酶進(jìn)行脫支處理一定時(shí)間，之后向充分酶解后的樣品液中加入體積比為1倍樣品液體積：3倍80%的乙醇稀釋液，并放入4 ℃冰箱保存不同時(shí)間以使其充分老化，離心，棄去上清液，洗滌沉淀3次，并在冷凍干燥機(jī)中凍干，粉碎過200目篩，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 板栗抗性淀粉含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]并作適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)進(jìn)行板栗抗性淀粉的測(cè)定，稱取0.10 g樣品于150 mL錐形瓶中，加入10 mL HCl-KCl緩沖液，調(diào)pH至2.0，加入胃蛋白酶0.1 mL(1 g/100 mL)，40 ℃恒溫震蕩60 min，3 000 r/min離心15 min后棄上清液；向沉淀中加入10 mL磷酸緩沖液，調(diào)pH至6.0，加入耐高溫α-淀粉酶2 mL(1%)，95 ℃恒溫震蕩60 min，3 000 r/min離心后棄上清液；加入10 mL乙酸鈉緩沖液，調(diào)pH至4.5，加入葡萄糖淀粉酶1 mL(0.01%)，50 ℃恒溫震蕩60 min，3 000 r/min離心后棄上清液；反復(fù)3次，徹底洗掉葡萄糖；將沉淀完全溶于2 mol/L KOH，用6 mol/L HCl中和，加入過量的葡萄糖淀粉酶，50 ℃恒溫振蕩60 min，冷卻，離心，收集上清液，反復(fù)3次，合并上清液，用蒸餾水定容至50 mL。用3，5-二硝基水楊酸法(DNS)[10]測(cè)還原糖的含量，并根據(jù)公式計(jì)算出抗性淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：

抗性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)=還原糖含量×0.9/樣品重×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 生板栗中抗性淀粉的含量

取1.3.1的方法提取的淀粉5.0 g加一定體積蒸餾水配制為11.00%懸浮液，在1.3.3的方法下進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)處理重復(fù)3次，得到板栗原含有抗性淀粉為11.65%。

2.2 高壓-酶解復(fù)合法制備抗性淀粉的單因素試驗(yàn)

2.2.1 淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)抗性淀粉得率的影響

取5.0 g板栗淀粉加以不同體積蒸餾水配制為7.00%、9.00%、11.00%、13.00%、15.00%的懸浮液，預(yù)糊化后進(jìn)行高壓處理，添加普魯蘭酶(9 PUN/g)，脫支處理10 h，按操作1.3.3測(cè)定抗性淀粉得率，每組處理重復(fù)3 次，由圖1可知，抗性淀粉得率隨淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增高后降低，當(dāng)抗性淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到11.00%時(shí)，抗性淀粉得率最大(57.52%)，隨著淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步升高，抗性淀粉得率先下降迅速，接著下降速率逐漸減小。說明淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高或過低都不利于抗性淀粉的形成，淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低，大量水分子以氫鍵與淀粉分子結(jié)合，減少了直鏈淀粉分子間的接觸，影響了抗性淀粉的形成；淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，水分含量不能滿足淀粉粒的完全溶脹和糊化，導(dǎo)致淀粉糊的黏度變大，不利于直鏈淀粉分子相互靠近連接，影響抗性淀粉的形成[11]。

圖1 不同因素對(duì)板栗抗性淀粉得率的影響

2.2.2 普魯蘭酶添加量對(duì)抗性淀粉得率的影響

取5.0 g板栗淀粉加適當(dāng)體積蒸餾水配制為11.00%的懸浮液，預(yù)糊化后進(jìn)行高壓處理，添加普魯蘭酶7、8、9、10、11 PUN/g脫支處理10 h，4 ℃冷凝老化處理12 h，按操作1.3.3測(cè)定抗性淀粉得率，每組處理重復(fù)3 次，由圖1可知，普魯蘭酶添加量過多過少都不利于抗性淀粉的形成，當(dāng)普魯蘭酶加入量為9 PUN/g時(shí)，抗性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到44.20%。當(dāng)普魯蘭酶添加量較少時(shí)，分子被切斷程度不夠，游離的直鏈淀粉分子較少，且淀粉糊的黏度仍然很大，不利于直鏈淀粉分子相互接近而形成結(jié)晶；添加量太大，直鏈淀粉分子太短，黏度過低，直鏈淀粉分子相互接近的概率較低，也不利于抗性淀粉的形成?？剐缘矸鄣男纬尚枰辨湹矸鄯肿?，因?yàn)橹辨湹矸劭商峁┮欢ǖ娜S結(jié)構(gòu)空間，若直鏈分子太短則無法提供三維結(jié)構(gòu)，RS無法形成[12-13]。同時(shí)加酶量多少也會(huì)影響被切斷后分子鏈長(zhǎng)短比例以至于影響晶體形成的難易程度。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)板栗抗性淀粉得率的影響

取5.0 g板栗淀粉加適當(dāng)體積蒸餾水配制為11.00%的懸浮液，預(yù)糊化后進(jìn)行高壓處理，添加普魯蘭酶(9 PUN/g)脫支處理6、8、10、12、14 h，4 ℃冷凝老化處理12 h，按操作1.3.3測(cè)定抗性淀粉得率，每組處理重復(fù)3次，由圖1可知，普魯蘭酶作用時(shí)間過長(zhǎng)過短都不利于抗性淀粉的形成。普魯蘭酶作用時(shí)間從6 h到10 h，曲線有上升，當(dāng)普魯蘭酶作用時(shí)間為10 h時(shí)，曲線上升到最高點(diǎn)(59.5%)，抗性淀粉含量最高，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，曲線下降，抗性淀粉含量下降。普魯蘭酶作用時(shí)間過長(zhǎng)，直鏈分子過短，而分子量小的直鏈分子則運(yùn)動(dòng)較快，分子運(yùn)動(dòng)比較劇烈，因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)快的鏈碰撞在一起的幾率及穩(wěn)定的幾率相對(duì)小，因此較難聚集，所以直鏈分子過短(即分子量過小)反而不利于晶體的形成。當(dāng)普魯蘭酶作用時(shí)間過短，釋放的直鏈淀粉分子太少，不利于重新結(jié)晶，而且淀粉糊中直鏈分子的鏈過長(zhǎng)，分子間斥力增大，也難聚集。所以只有中等長(zhǎng)度的鏈才最有利于聚集，RS的聚合度大約為50～60[14-16]。

2.2.4 冷凝時(shí)間對(duì)抗性淀粉得率的影響

取5.0 g板栗淀粉加適當(dāng)體積蒸餾水配制為11.00%的懸浮液，預(yù)糊化后進(jìn)行高壓處理，添加普魯蘭酶(9 PUN/g)脫支處理10 h，4 ℃冷凝老化處理2、6、12、18、24 h按操作1.3.3測(cè)定抗性淀粉得率，每組處理重復(fù)3次，由圖1可知，抗性淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著冷凝時(shí)間的延長(zhǎng)增加，在12 h時(shí)達(dá)到最大值(56.00%)，繼續(xù)增加冷凝時(shí)間，抗性淀粉得率沒有明顯上升。RS的形成是直鏈淀粉分子的重新結(jié)晶過程，根據(jù)結(jié)晶理論，淀粉結(jié)晶分2個(gè)階段，即晶核形成和晶體生長(zhǎng)階段。晶核的形成是在較高的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的，當(dāng)冷卻到一定溫度時(shí)，晶體開始生長(zhǎng)，甚至在貯藏階段也在緩慢進(jìn)行。按結(jié)晶體成長(zhǎng)理論，隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)，RS的含量應(yīng)該增加，但淀粉乳在長(zhǎng)時(shí)間的低溫環(huán)境下，由于水分的析出和分子運(yùn)動(dòng)的減慢，這就使晶體的生長(zhǎng)受到了阻礙[17-18]，所以，過長(zhǎng)時(shí)間的靜置并沒有使得RS含量無限增加。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design Expert 7.0中的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法(response surface method，RSM)，對(duì)影響抗性淀粉得率的淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶添加量、酶解時(shí)間、冷凝時(shí)間進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化壓熱普魯蘭酶法生產(chǎn)抗性淀粉的工藝條件。因素水平編碼值見表1，結(jié)果見表2 。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 建立模型方程與顯著性檢驗(yàn)

應(yīng)用Design Expert 7.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析擬合，分別得到回歸方程模型方差分析(表3)及回歸方程系數(shù)估計(jì)值(表4)。

表3 回歸方程模型的方差分析

注：*差異顯著P<0.05，** 差異極顯著P<0.01，下同。

由表3可看出，模型P<0.000 1，說明該模型建立為高度顯著，具有合理性；失擬項(xiàng)(P=0.650 0)>0.05，說明模型失擬項(xiàng)不顯著；因此二次模型成立。應(yīng)用此模型可以預(yù)測(cè)抗性淀粉得率及優(yōu)化壓熱酶解生產(chǎn)抗性淀粉的工藝，并獲得四元二次多項(xiàng)回歸方程。

Y/%=58.33+2.74A+7.71B+6.40C-1.83D+0.52AB-1.62AC-6.84AD-3.28BC-0.87BD+2.21CD-8.91A2-4.98B2+2.21C2-6.67D2

方程的決定系數(shù)R2=0.983 7，說明該模型能解釋98.37%響應(yīng)值的變化，即該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合良好，試驗(yàn)誤差小。

由表4可知，影響抗性淀粉得率的因素主次為B>C>A>D，即普魯蘭酶加酶量>酶解時(shí)間>淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)>冷凝時(shí)間。其中普魯蘭酶加酶量、酶解時(shí)間、淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、冷凝時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響達(dá)到極顯著程度，四因素交互作用皆顯著，且淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與冷凝時(shí)間、普魯蘭酶添加量與酶解時(shí)間極顯著，淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與普魯蘭酶添加量、淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶解時(shí)間、普魯蘭酶添加量與冷凝時(shí)間、酶解時(shí)間與冷凝時(shí)間顯著。

表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 抗性淀粉得率響應(yīng)面分析與最優(yōu)工藝條件的確定

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y對(duì)應(yīng)于試驗(yàn)因素A、B、C、D所構(gòu)成的三維空間的曲面圖及其在二維平面上的等高線圖。響應(yīng)面圖形可以直觀地反映各因素及它們之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。將2個(gè)因素固定在零水平，可作出另外2因素交互作用的響應(yīng)曲面圖及等高線圖，結(jié)果見圖2。

由圖2a可知，隨著淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加與普魯蘭酶加酶量增大，抗性淀粉得率先升高后降低，等高線形狀橢圓形，淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶添加量的交互作用對(duì)反應(yīng)有顯著影響，由此可見，選擇合適的淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與普魯蘭酶添加量，可以一定程度提高抗性淀粉得率。由圖2b可知，隨著淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高與酶解時(shí)間延長(zhǎng)，抗性淀粉得率勻速升高然后緩慢下降，等高線形狀呈三角狀，說明淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶解時(shí)間的交互作用對(duì)反應(yīng)也有顯著影響。由圖2c可知，隨著淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加與冷凝時(shí)間的延長(zhǎng)，抗性淀粉的得率先勻速上升后迅速下降，等高線形狀為橢圓形，說明淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)和冷凝時(shí)間的交互作用對(duì)反應(yīng)的影響極顯著。由圖2d可知，隨著加酶量的增加和酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，抗性淀粉的得率先增加后趨于平穩(wěn)，等高線的形狀為線，說明加酶量和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)抗性淀粉的得率的影響極顯著。由圖2e可知，隨著加酶量的增加和冷凝時(shí)間的延長(zhǎng)，抗性淀粉的得率先增加后趨于平穩(wěn)，等高線的形狀為橢圓形，說明加酶量和冷凝時(shí)間的交互作用對(duì)抗性淀粉的得率有顯著的影響。由圖2f可知，隨著酶解時(shí)間和冷凝時(shí)間的延長(zhǎng)，抗性淀粉的得率先增加后下降，等高線的形狀為橢圓形，說明酶解時(shí)間和冷凝時(shí)間的交互作用對(duì)抗性淀粉的得率有顯著影響。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，可以通過控制淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶添加量、酶解時(shí)間和冷凝時(shí)間以獲得較高的抗性淀粉得率。

圖2 各因素交互影響抗性淀粉得率的響應(yīng)面及等高線圖

壓熱復(fù)合普魯蘭酶法生產(chǎn)抗性淀粉的最優(yōu)條件為淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.07%、酶添加量9.06 PUN/g、酶解時(shí)間9.99 h、冷凝時(shí)間14.80 h。在此條件下，抗性淀粉得率預(yù)測(cè)值為65.7%。而根據(jù)實(shí)際工藝條件，確定為淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.00%、酶添加量9 PUN/g、酶解時(shí)間10 h、冷凝時(shí)間15 h，做3組驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得抗性淀粉得率分別為64.6%、65.2%、64.9%，平均得率64.9%，與該條件下的理論預(yù)測(cè)值65.7%相比，相對(duì)誤差小于1%，說明采用RSM 法優(yōu)化得到的生產(chǎn)工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

影響普魯蘭酶法制備抗性淀粉的主要因素為淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、普魯蘭酶加酶量、酶解時(shí)間和冷凝時(shí)間，各因素對(duì)板栗抗性淀粉得率的影響大小不同，各因素的顯著性為普魯蘭酶加酶量>酶解時(shí)間>淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)>冷凝時(shí)間。這4個(gè)因素對(duì)反應(yīng)的影響都達(dá)到極顯著程度，且淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與普魯蘭酶添加量、淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶解時(shí)間、淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與冷凝時(shí)間、普魯蘭酶添加量與酶解時(shí)間、普魯蘭酶添加量與冷凝時(shí)間、酶解時(shí)間與冷凝時(shí)間有交互作用。

通過響應(yīng)面試驗(yàn)，確定了壓熱復(fù)合普魯蘭酶法生產(chǎn)抗性淀粉的最優(yōu)制備條件：淀粉懸浮液質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.00%、酶添加量9 PUN/g、酶解時(shí)間10 h、冷凝時(shí)間15 h。在該條件下，板栗抗性淀粉得率為64.9%，響應(yīng)面法的最優(yōu)工藝可以有效提高板栗抗性淀粉得率，說明響應(yīng)面法能更好反映各因素之間的相互作用。

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Response Surface Methodology for Optimization of Chestnut Resistant Starch PreparationTechnology

Yao Hui Lü Jiao Ouyang Jie Wang Jianzhong Wang Fengjun

(College of Biological Science and Technology, Beijing Forestry University Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety, Beijing 100083)

The present study aimed to improve the yield of chestnut resistant starch and optimize the processing parameters of resistant starch preparation method. The methods of autoclaving treatment and pullulanase hydrolysis were used. Based on the result of single factor experiment, response surface method was used to investigate the effect of starch suspension mass fraction, pullulanase adding amount, enzymatic hydrolysis time and cooling time on the yield of resistant starch. A mathematical regression model of the relationship between resistant starch yield and 4 factors was established. According to the actual processing conditions, the optimum preparation conditions were achieved as follows: starch suspension mass fraction of 11.00%, pullulanase adding amount of 9 PUN/g, enzymatic hydrolysis time of 10 h and cooling time of 15 h. Under above conditions, the yield of the chestnut resistant starch reached 64.90%, which was close to the predicted value (65.70%). Therefore, RSM could be used to design the experiments and increase the yield of chestnut resistant starch.

resistant starch, pullulanase, chestnut starch, response surface methodology (RSM)

TS201.2

A

1003-0174(2016)12-0132-07

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)重大項(xiàng)目(201204401)

2015-05-17

姚慧，女，1990年出生，碩士，天然產(chǎn)物與功能性食品

王豐俊，男，1975年出生，副教授，油脂與植物蛋白開發(fā)