體外震波對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞間黏附因子-1表達(dá)的影響

馬一銘,李麗,蔡紅雁,胡釗,郭濤

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

體外震波對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞間黏附因子-1表達(dá)的影響

馬一銘,李麗,蔡紅雁,胡釗,郭濤

目的:觀察體外震波治療對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)表達(dá)的影響。

方法:將體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分組,實(shí)驗(yàn)部分分別給予0.03、0.09、0.18、0.24 mJ/mm2能量震波500擊處理(分別設(shè)定為0.03、0.09、0.18、0.24 mJ/mm2能量組),對照組不給予震波處理。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)比色法檢測細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及蛋白質(zhì)印跡方法(Westen blot)分別檢測低能量震波處理后ICAM-1信使核糖核酸( mRNA) 和蛋白的表達(dá)水平。

結(jié)果:CCK 比色法檢測結(jié)果顯示:只有0.09 mJ /mm2能量組與對照組比能促進(jìn)HUVECs增殖,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而其他能量組與對照組比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同能量組與對照組比較,0.09 mJ/mm2能量組G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.05),S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05),0.03 mJ/mm2能量組僅增加G2/M期細(xì)胞比例(P<0.05),而其他能量組與對照組比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測顯示:0.09 mJ/mm2能量組ICAM-1 mRNA表達(dá)均較對照組明顯增高(9.27±0.95 vs 1.02±0.27,P<0.001),0.03 mJ/mm2能量組ICAM-1 mRNA表達(dá)均較對照組亦增高(7.08±0.60 vs 1.02±0.27,P<0.01)。Westen blot檢測顯示:0.09 mJ/mm2能量組ICAM-1蛋白表達(dá)較對照組明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

結(jié)論:體外震波治療,特別是0.09 mJ/mm2能量的體外震波能加速HUVECs細(xì)胞周期由G0期/G1期向S期和G2/M期的轉(zhuǎn)換,促進(jìn)細(xì)胞增殖,并且提高ICAM-1的表達(dá),這在體外震波促進(jìn)血管新生機(jī)制中起重要作用。

體外震波治療;臍靜脈;內(nèi)皮細(xì)胞;細(xì)胞周期

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:1013.)

體外震波作為物理療法,已成功運(yùn)用于泌尿系結(jié)石、膽道結(jié)石、骨骼肌肉系統(tǒng)疾病、肩周炎、糖尿病足等多年,近年來發(fā)現(xiàn)體外震波能促進(jìn)血管新生用于冠心病治療,改善心肌缺血。目前國內(nèi)外已在細(xì)胞水平、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床水平證實(shí)了其促血管新生的確切療效,且有效能量級別為0.09 mJ /mm2(相當(dāng)于體外震波碎石能量的1/10)[1-4],但其顯效機(jī)制目前尚不明確。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管形成的基礎(chǔ),在血管形成的過程中起最重要作用[5-7],可以說內(nèi)皮細(xì)胞增殖是血管形成的先決條件,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能提高血管新生。但血管新生過程復(fù)雜,還需要多種細(xì)胞因子的參與,細(xì)胞間粘附因子-1(ICAM-1)可在增生的內(nèi)皮細(xì)胞高度表達(dá),介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合從而加速血管新生[8]。體外震波能否促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和ICAM-1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)血管新生,值得我們進(jìn)一步研究,故本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平探討體外震波促進(jìn)血管新生的有效能量,觀察其對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及ICAM-1表達(dá)的影響,探討低能量體外震波促血管新生的可能機(jī)制,進(jìn)一步尋找體外震波促血管新生的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

胎牛血清白蛋白(美國Hyclone公司), HUVECs(中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所),DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone 公司),0.25% 胰蛋白酶(美國Gibco公司),青鏈霉素(美國Sigma公司),細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK,日本Dojindo公司),細(xì)胞周期檢測試劑盒(美國Beckmam Coulter公司),二喹林甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(杭州碧云天公司),鼠抗人ICAM-1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司),山羊抗鼠HRP標(biāo)記IgG抗體(美國Santa Cruz公司),核糖核酸(RNA)抽提試劑盒(德國Qiagen公司), cDNA合成試劑(德國Promege公司),聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)定量反應(yīng)試劑盒(德國Qiagen公司),引物(上海生物工程公司),10XLoading Buffer(DNA)(日本TaKaRa公司),ELX800酶標(biāo)儀(美國Chernicon公司),SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司),PCR擴(kuò)增儀(7300型,美國ABI公司),流式細(xì)胞儀(美國Becman Coulter公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

將購于中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所的HUVECs培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)3 d,用磷酸緩沖鹽溶液(PBS,濃度0.01 mol/L,pH=7.4,含NaCl、Na2HPO4、KCl、KH2PO4) 洗掉非貼壁細(xì)胞,按1:3的比例傳代。

1.3HUVECs分組與震波處理

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化,用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1X105/ml,分別置于5支2 ml試管中,培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞同步化并隨機(jī)分組處理。采用瑞士STORZMEDICAL公司生產(chǎn)的震波儀(MODULITHSLC)進(jìn)行震波處理,實(shí)驗(yàn)部分分別給予0.03、0.09、0.18、0.24 mJ/ mm2能量震波500擊處理(分別設(shè)定為0.03、0.09、0.18、0.24 mJ/mm2能量組),對照組置于震波儀器中但不進(jìn)行震波處理,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h,進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.4CCK檢測HUVECs增殖情況

各組細(xì)胞懸液加入96孔板中( 100 μl/孔),再向每孔加入10 μl的CCK溶液,將培養(yǎng)板在(37℃, 5%CO2) 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h,用酶標(biāo)儀測定在波長450 nm 處的吸光度值(A450),用吸光度值表示細(xì)胞增殖能力[9]。

1.5 流式細(xì)胞儀術(shù)檢測HUVECs細(xì)胞周期的分布情況

將各細(xì)胞懸液收集于15 ml試管中,以626 g離心5 min,加少量DMEM培養(yǎng)液,計(jì)數(shù),各組細(xì)胞量約1X105,收集沉淀重懸于200 μl的PBS中,再次離心收集沉淀,75%冰凍乙醇4℃固定細(xì)胞,離心棄固定液,再加PBS離心洗滌1次,沉淀重懸于200～500 μl的PBS,加入RnaseA 37℃水浴l h,加入碘化丙啶(PI)染色,終濃度50 ng/ml,4℃避光30 min,過300目篩網(wǎng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期[10]。

1.6 蛋白質(zhì)印跡方法(Westen blot)檢測

提取震波后各組細(xì)胞總蛋白,用BCA法[11]測定總蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品上樣,聚丙稀銑胺凝膠電泳(SDSPAGE),電轉(zhuǎn)移90 min至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,5%脫脂奶粉封閉2 h后與ICAM-1(1:6 000)一抗4 ℃孵育過夜。與山羊抗鼠辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記IgG抗體(1:10 000)二抗室溫孵育1 h后,再與化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)室溫作用3 min,后曝光、顯影和定影。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測

提取并純化震波后各組HUVECs細(xì)胞RNA,按照MBI公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作明合成cDNA,利用primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物,引物(上海生物工程公司合成):ICAM-1 (正義鏈) 5'-tccagacatgaccgctgagt-3',(反義鏈) 5'-ctcattggccaacctgcctt-3',擴(kuò)增片段長度為210 bp; GAPDH( 正義鏈) 5'-caaggtcatccatgacaactttg-3',(反義鏈) 5'-gtccaccaccctgttgctgtag-3',擴(kuò)增片段長度為496 bp,設(shè)定反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像、掃描,紫外燈下觀察結(jié)果并拍照記錄。用GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參基因,ICAM-1樣品目的基因的相對表達(dá)率(RQ) 參照文獻(xiàn)[12]方法采用2-ΔΔCt法計(jì)算,公式如下:RQ = 2-ΔΔCt;ΔΔCt =待測樣本目的基因ΔCt-對照組目的基因ΔCt;ΔCt =目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外震波治療對HUMVCs增殖的影響(圖1)

不同能量組與對照組比較,0.09 mJ /mm2能量組增殖能力較對照組升高(吸光度值升高),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而0.03、0.18、0.24 mJ /mm2能量組的增殖能力( 0.60 ± 0.06、0.62 ± 0.06、0.58 ±0.04) 與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 不同震波能量級別對HUVECs增殖的影響

2.2 體外震波治療對HUMVCs細(xì)胞周期分布的影響(表1)

0.09 mJ/mm2能量組與對照組相比,G0 /G1期細(xì)胞比例降低[(53.16±5.89)% vs (71.30±4.95)%, P<0.05],S期及G2/M期細(xì)胞比例明顯升高[(39.05±5.25)% vs (25.01±5.39)%、(8.21 ±1.44)% vs (4.03±0.73)%],且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。0.03 mJ/mm2能量組僅G2/M期細(xì)胞比例高于對照組[(5.69±0.93)% vs (4.03±0.73)%, P<0.05]。其余各組細(xì)胞周期比例較對照組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組HUVECs的細(xì)胞周期分布比例(n= 6,)

表1 各組HUVECs的細(xì)胞周期分布比例(n= 6,)

注: HUVECs:人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。與對照組相比*P<0.05

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2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測ICAM-1 mRNA的表達(dá)(圖2)

瓊脂糖凝膠電泳顯示,ICAM-1 PCR反應(yīng)所得的產(chǎn)物條帶均與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物的長度一致,無明顯雜帶,擴(kuò)增曲線以"S"型為擴(kuò)增成功。與對 照 組 相 比,0.09 mJ/mm2能 量 組HUVECs ICAM-1mRNA的表達(dá)明顯增加[(9.27±0.95) vs (1.02±0.27),P<0.001];0.03 mJ/mm2能 量組亦能增加ICAM-1 mRNA的表達(dá)(7.08±0.60 vs 1.02±0.27,P<0.01),但不如0.09 mJ/mm2能量組明顯。

圖2 體外震波對HUVECs ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響

2.4 Western blot檢測ICAM-1蛋白的變化(圖3)

與 對 照 組 相 比,0.09 mJ/mm2能 量 組 處理HUVECs時(shí)ICAM-1蛋 白 表 達(dá) 明 顯 增 加[(132.32±14.43) vs (100.00±0.00),P<0.05], 其余能量組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 體外震波對HUVECs ICAM-1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

目前,冠心病已經(jīng)成為人類疾病死亡的主要原因,嚴(yán)重危害人類健康,當(dāng)心肌發(fā)生缺血、壞死時(shí),機(jī)體可代償性的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移,從而促進(jìn)梗死周圍區(qū)側(cè)枝循環(huán)的建立,但這種微循環(huán)的重建代償不足以滿足機(jī)體改善心肌供血的需要[13]。尋找新的無創(chuàng)方法通過人為因素來促進(jìn)缺血區(qū)血管新生,從而改善缺血組織的血液供應(yīng),已經(jīng)成為近年來心血管疾病治療研究的熱點(diǎn)方向。近年來發(fā)現(xiàn)體外震波作為一種新型的血管再生療法,通過低能量脈沖波對心肌及血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生剪切力和空穴效應(yīng),能夠刺激新生血管形成,提高局部心肌血流和毛細(xì)血管密度[1,2]。體外震波能夠增加缺血心肌供血,減輕冠心病患者心絞痛癥狀,減少硝酸酯類用量,改善心功能,期間未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng),初步證實(shí)其安全有效[3,14],但其具體機(jī)制仍然不清楚,仍需我們不斷研究。

本研究采用能夠近似反映人類血管內(nèi)皮細(xì)胞真實(shí)情況的HUVECs進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.09 mJ / mm2500擊低能量震波能加速HUVECs細(xì)胞周期由G0/G1期向G2/M期和S期的轉(zhuǎn)換,增加S期及G2/ M期細(xì)胞數(shù),從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。0.09 mJ /mm2能量被認(rèn)為最佳能量,這與國外報(bào)道類似[1,2,14],但對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響至今少見報(bào)道。而內(nèi)皮細(xì)胞增殖同遷移、成熟和毛細(xì)血管形成一樣,是血管新生中極為重要的一環(huán)[15],因此認(rèn)為體外震波可以通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖來促進(jìn)血管新生。

研究發(fā)現(xiàn)人為地增加心肌局部細(xì)胞生長因子的濃度,對緩解以致解除心肌缺血有潛在的可行性[16]。血管內(nèi)皮生長因子( VEGF) 是促血管生成的重要調(diào)節(jié)因子,低能量體外震波能促進(jìn)受損心肌組織高表達(dá)VEGF、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)等血管相關(guān)細(xì)胞因子,參與促進(jìn)缺血心肌組織新生毛細(xì)血管的形成和側(cè)枝循環(huán)的建立[1,17,18]。研究還發(fā)現(xiàn)體外震波能促進(jìn)具有分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞(MSCs)的增殖、分化和旁分泌活動(dòng),參與血管新生[19-21]。ICAM-1屬于黏附因子中免疫球蛋白超家族(IGSF)中的成員,是介導(dǎo)黏附反應(yīng)重要的一個(gè)黏附因子,ICAM-1廣泛分布于內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表面,內(nèi)皮細(xì)胞上的細(xì)胞間黏附因子介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合,從而參與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化、細(xì)胞組織生長及分化、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移等生理病理過程。

血管形成是一個(gè)復(fù)雜的過程,血管生成過程中需要血管內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間、血管內(nèi)皮細(xì)胞相互間及血管內(nèi)皮細(xì)胞與其他周圍細(xì)胞間的相互作用,這種作用是黏附因子完成的,研究證明ICAM-1通過影響機(jī)體免疫抑制活性,有助于異位組織逃避機(jī)體免疫系統(tǒng),促進(jìn)異位組織侵入后的血管生成[22]。亦有研究發(fā)現(xiàn)ICAM-1介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,促發(fā)炎性反應(yīng),一方面聚集的白細(xì)胞釋放大量炎性介質(zhì)和化學(xué)物質(zhì),可引起血管內(nèi)皮損傷,另一方面也可以促進(jìn)缺血組織炎癥血管新生[23],炎癥反應(yīng)對缺血組織的這種雙重作用以哪種為主與缺血的程度和時(shí)間相關(guān)。我們的研究結(jié)果顯示,體外震波處理HUVECs在0.03～0.09 mJ/mm2能量時(shí)促進(jìn)ICAM-1mRNA的表達(dá),而Western blot檢測發(fā)現(xiàn)只有0.09 mJ/mm2能量時(shí)才表達(dá)ICAM-1蛋白,出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能與較低的能量使細(xì)胞出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)低,只出現(xiàn)基因水平的變化,而適宜的能量不僅出現(xiàn)基因水平的變化,而且出現(xiàn)蛋白質(zhì)水平的變化,認(rèn)為體外震波促進(jìn)ICAM-1的表達(dá)在促進(jìn)血管新生中起到重要作用,此時(shí)作為炎性因子正面作用更大。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,體外震波能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,提高黏附因子ICAM-1的表達(dá)而參與血管新生,且0.09 mJ/mm2為最佳能量。但本實(shí)驗(yàn)僅檢測了具有代表性的黏附因子ICAM-1,震波作用后與血管新生相關(guān)的其他細(xì)胞因子、酶、基因等也有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Extracorporeal Shock Wave on Proliferation, Cell Cycle and Intercellular Adhesion Molecule-1 Expression in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

MA Yi-ming, LI Li, CAI Hong-yan, HU Zhao, GUO Tao。
Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming (650000), Yunnan, China Corresponding Author: CAI Hong-yan, Email: hyflykm@sina.com。

Objective: To observe the effect of extracorporeal shock wave therapy (ESWT) on proliferation, cell cycle and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)。Methods: HUVECs were cultured in vitro at the concentration of (1X105/ml) and the cells were divided into 2 sets of groups: CSWT group, the cells were treated by different energy of (0.03, 0.09, 0.18, 0.24) mJ/mm2respectively and corresponding Control group, in which the cells had no CSWT。 HUVEC proliferation was detected by CCK colorimetric method, cell cycle was measured by flow cytometry, mRNA and protein expressions of ICAM-1 were examined by RT-PCR and Western blot analysis respectively。Results: Compared with Control group, (0.09 mJ/mm2) CSWT group had promoted HUVECs proliferation, P<0.05 and the other CSWT groups were similar to corresponding Control groups, P>0.05; (0.09 mJ/mm2) CSWT group showed decreasedproportion of G0/G1 stage and increased S and G2/M stages, all P<0.05; while (0.03 mJ/mm2) CSWT group only increased the proportion of G2/M stage, P<0.05 and the other CSWT groups were similar to corresponding Control group, P>0.05. Compared with Control group, (0.09 mJ/mm2) and (0.03mJ/mm2) CSWT groups showed increased mRNA expression of ICAM-1 (9.27±0.95) vs (1.02±0.27), P<0.001 and (7.08±0.60) vs (1.02±0.27), P<0.01; (0.09 mJ /mm2) CSWT group had elevated protein expression of ICAM-1, P<0.05.Conclusion: ESWT especially at (0.09 mJ/mm2) may accelerate cell cycle transition from G0/G1 stage to S and G2/M stages, promote HUVECs proliferation and increase ICAM-1 expression which may play important roles in ESWT facilitated angiogenesis in vitro。

Extracorporeal shock wave therapy; Human umbilical vein; Endothelial cells; Cell cycle;

2016-01-24)

(編輯:王寶茹)

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260027);云南省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012WS005);云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014FZ023);云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)基金(2013FB128)

650000 云南省昆明市,昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心內(nèi)科

馬一銘 碩士研究生 主要從事冠心病介入治療研究 Email:mymkm@sina.com 通訊作者:蔡紅雁 Email:hyflykm@sina.com

R54

A

1000-3614(2016)10-1013-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2016.10.016