2010－2013年兒童呼吸道標(biāo)本肺炎衣原體DNA檢測(cè)分析

王漢斌 華春珍 李偉 尚世強(qiáng)

2010－2013年兒童呼吸道標(biāo)本肺炎衣原體DNA檢測(cè)分析

王漢斌 華春珍 李偉 尚世強(qiáng)

肺炎是我國5歲以下兒童死亡的主要原因之一[1]，而社區(qū)獲得性肺炎（CAP）中約有10%由肺炎衣原體（CP）感染所致[2]。近年來，CP感染率在人群中呈上升趨勢(shì)[3]，除肺炎外，還可引起咽炎、鼻竇炎和支氣管炎等疾病，由于其臨床表現(xiàn)呈多樣性和不典型性，單純依靠臨床癥狀或影像學(xué)檢查不能作出明確診斷，只有病原學(xué)檢查才對(duì)診斷具有重要意義。熒光定量PCR檢測(cè)具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、準(zhǔn)確性高和交叉污染少等優(yōu)點(diǎn)，CP-DNA陽性可作為CP感染早期診斷的特異性指標(biāo)。本研究通過檢測(cè)罹患呼吸道感染的住院患兒呼吸道標(biāo)本，分析CP-DNA陽性者的年齡、性別及季節(jié)分布和臨床特點(diǎn)，為臨床CP感染的診治提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月至2013年12月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院門診和住院疑似CP感染的患兒共35 662例，其中男22 624例，女13 038例，年齡1d～14歲，平均（1.96±2.96）歲。＜1歲18 326例，1～3歲8 403例，～6歲4 992例，＞6歲3 941例。入選標(biāo)準(zhǔn)[4]：年齡＜14歲；有流涕、鼻塞、咳嗽持續(xù)并逐漸加重、呼吸加快等臨床癥狀；病程遷延未愈；就診前均未經(jīng)抗生素治療。

1.2 檢測(cè)試劑和儀器 PCR熒光檢測(cè)試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：Cat#DA-006）由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)，抗CP抗體IgG檢測(cè)試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：YZB/GER 0379-2010）和抗CP抗體IgM檢測(cè)試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：YZB/GEM 1641-2010）由德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司生產(chǎn)。熒光定量PCR擴(kuò)增儀7500型和StepOnePlus型由美國AB公司生產(chǎn)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 患兒標(biāo)本均在入院后用藥前釆集。痰液：用無菌5ml玻璃管取受檢者肺深部咳出的痰液1～3ml（嬰幼兒經(jīng)鼻腔負(fù)壓抽吸深部合格痰液），密封送檢；肺及支氣管灌洗液：做纖維支氣管鏡檢查者，用無菌5ml玻璃管收集肺泡灌洗液1～3ml，密封送檢；咽拭子：用棉拭子取咽部分泌物，將棉拭子置入無菌玻璃管，密封送檢。本組患兒中有8例同時(shí)采集2種標(biāo)本。

1.3.2 CP-DNA檢測(cè) 采用熒光定量PCR技術(shù)，＞1.0×103copies/ml為陽性。具體步驟：（1）痰液：加入4倍體積的0.9%氯化鈉溶液，輕輕震蕩后置4℃冰箱過夜，用槍頭或吸管混勻后吸取1.0～1.5ml至離心管中，12 000r/min離心5min；肺及支氣管灌洗液：取灌洗液1.0～1.5ml至離心管中，12 000r/min離心5min，去上清液，沉淀加滅菌0.9%氯化鈉溶液1ml混勻，12 000r/min離心5min；咽拭子：向玻璃管中加入1ml滅菌0.9%氯化鈉溶液，充分震蕩搖勻，擠干棉拭子，吸取全部液體轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，120 000r/min離心5min。（2）去上清液，沉淀中加入50μlDNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理101min，120 000r/min離心5min。（3）取上清液進(jìn)行PCR反應(yīng)測(cè)定，每次操作均設(shè)陰性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì)控品和強(qiáng)陽性質(zhì)控品對(duì)照，操作過程嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行。

1.3.3 血清CP-IgM、CP-IgG及細(xì)胞檢測(cè) 血清CP-IgM檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法，患者樣本吸光度值/上標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值＞1.1為陽性；血清CP-IgG檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法，結(jié)果＞22RU/ml為陽性。細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類正常值參照諸福棠實(shí)用兒科學(xué)第7版[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CP-DNA檢測(cè)結(jié)果 所有送檢標(biāo)本CP-DNA陽性70例，總陽性率為0.20%。痰液標(biāo)本送檢31 241例，CP-DNA陽性55例（0.18%）；灌洗液標(biāo)本送檢888例，CP-DNA陽性16例（1.80%）；咽拭子標(biāo)本送檢2 371例，CP-DNA陽性7例（0.30%）。男性患兒CP-DNA陽性42例（0.19%）；女性患兒CP-DNA陽性28例（0.21%），男女患兒CP-DNA陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.358，P＞0.05）。2010年送檢7 633例，CP-DNA陽性5例（0.07%）；2011年送檢8 150例，CP-DNA陽性22例（0.27%），2012年送檢9 045例，CP-DNA陽性25例（0.28%）；2013年送檢10 834例，CP-DNA陽性18例（0.17%），不同年份CP-DNA陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.383，P＜0.01）。

2.2 CP-DNA陽性者在不同季節(jié)和月份的分布情況

2.2.1 不同季節(jié)CP-DNA陽性率比較 春季（3～5月份）送檢9 050例，CP-DNA陽性21例（0.23%）；夏季（6～8月份）送檢 7 734例，CP-DNA陽性 24例（0.31%）；秋季（9～11月份）送檢8 898例，CP-DNA陽性14例（0.16%）；冬季（12月～次年2月份）送檢9 980例，CP-DNA陽性11例（0.11%），春夏季節(jié)的陽性率（0.27%）高于秋冬季節(jié)（0.13%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.349，P＜0.01）。

2.2.2 不同月份CP-DNA陽性率比較 研究年限內(nèi)各月份CP-DNA陽性率范圍為0%～0.51%，5月份送檢2 731例，CP-DNA陽性14例（0.51%），12月份送檢3 476例，CP-DNA陽性0例，每月痰液、咽拭子及灌洗液的CP-DNA陽性率見圖1。

圖1 每月痰液、咽拭子及灌洗液的CP-DNA陽性率

2.3 CP-DNA陽性患兒的臨床特點(diǎn)

2.3.1 一般情況 痰液、咽拭子及灌洗液CP-DNA陽性的70例患兒中，男42例（60.00%），女28例（40.00%）。年齡1個(gè)月～13歲，平均（5.9±4.3）歲。＜1歲15例（21.43%），1～3歲10例（14.29%），～6歲8例（11.43%），＞6歲37例（52.86%）。

2.3.2 CP-DNA陽性患兒的臨床診斷 70例患兒中，合并其他病原體感染14例（20.00%）：同時(shí)存在1種其他病原體檢查陽性9例，包括軍團(tuán)菌、肺炎支原體、EB病毒各2例，沙眼衣原體、肺炎鏈球菌、巨細(xì)胞病毒各1例；2種其他病原體檢查陽性3例，其中肺炎支原體和肺炎軍團(tuán)菌1例，呼吸道合胞病毒和大腸埃希菌1例，巨細(xì)胞病毒和肺炎支原體1例；3種其他病原體陽性1例，包括呼吸道合胞病毒、肺炎軍團(tuán)菌及肺炎支原體；4種其他病原體陽性1例，包括肺炎軍團(tuán)菌、肺炎支原體、沙眼衣原體及EB病毒。56例CP單一感染患兒中，以呼吸道疾病為主54例（96.43%），其中肺炎41例，支氣管炎和毛細(xì)支氣管炎6例，急性上呼吸道感染7例。41例肺炎患兒中，合并胸腔積液5例，伴肺不張5例，伴支氣管異物1例，有支氣管哮喘3例，伴肺咯血、支氣管擴(kuò)張囊性變及呼吸功能不全1例；另2例患兒無明顯呼吸道癥狀，但罹患急性散播性腦脊髓炎和病毒性腦炎。

2.4 CP-DNA陽性患兒輔助檢查結(jié)果 血白細(xì)胞計(jì)數(shù)平均（9.6±4.2）×109/K，高于正常21例（30.00%）；中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)平均（5.1±3.9）×109/K，高于正常16例（22.86%）。超敏C反應(yīng)蛋白送檢70例，其中≥8mg/K28例（40.00%）。行血清學(xué)檢查54例，其中CP-IgM陽性33例（61.11%），CP-IgG陽性25例（46.30%），兩者均陽性17例（31.48%）。

2.5 治療情況 CP感染的住院患兒中治愈出院69例，因家長要求自行出院1例：下呼吸道感染患兒56例均予大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對(duì)癥治療，其中采用單一阿奇霉素治療50例（72.86%）；采用單一紅霉素治療4例（5.71%），采用單一克拉霉素治療1例，采用阿奇霉素治療1個(gè)療程后療效欠佳后改紅霉素1例；其余患兒予利邁欣（化學(xué)名：利巴韋林）、萘夫西林、頭孢西丁、苯唑西林等藥物，病情亦有所好轉(zhuǎn)。所有患兒住院2～29（8.6±5.8）d。2例無呼吸道癥狀的患兒使用阿奇霉素和羅氏芬（化學(xué)名：頭孢曲松鈉）治療后好轉(zhuǎn)出院。

3 討論

CP是1989年描述的衣原體，系革蘭染色陰性，嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的人類病原體[5]。本組資料顯示CP感染患兒在性別上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而年長兒的CP-DNA陽性率高于嬰幼兒，可能與學(xué)齡期兒童活動(dòng)范圍較廣，在校園內(nèi)易發(fā)生交叉感染有關(guān)。本組受檢患兒痰液、咽拭子及灌洗液CP-DNA總陽性率為0.20%，較國內(nèi)外同類研究低[6-9]。分析造成差異的原因，可能與不同地區(qū)的流行高峰、患兒的年齡范圍以及檢測(cè)手段不同有關(guān)。本研究結(jié)果顯示灌洗液標(biāo)本陽性率顯著高于痰液和咽拭子標(biāo)本，提示灌洗液標(biāo)本可作為臨床檢測(cè)首選方法。CP是公認(rèn)的5歲以上兒童常見的呼吸道病原體，而本研究納入的＜6歲患兒占88.95%，其感染率低于5歲以上患兒，致總陽性率較低。本組2010年陽性率處于低水平，2011和2012年度感染率顯著高于其他年度，春夏季節(jié)CP-DNA陽性率顯著高于秋冬季節(jié)，反映了本地區(qū)研究年限內(nèi)CP感染的流行病學(xué)特點(diǎn)。從CP-DNA陽性率各月份分布圖亦可知，自2011年4月，本地區(qū)CP-DNA陽性率已較前明顯增加。春夏季節(jié)晝夜溫差大，兒童抵抗力較差易受感染，學(xué)校等教育機(jī)構(gòu)應(yīng)注意適當(dāng)通風(fēng)避免交叉感染。

CP感染除可引發(fā)肺炎和上呼吸道感染外，還與哮喘有關(guān)，甚至與肥胖、腦炎、心肌炎等許多非呼吸道疾病相關(guān)[10-13]。肺炎衣原體也可合并其他病原體感染，包括肺炎鏈球菌、肺炎支原體、沙眼衣原體、EB病毒、巨細(xì)胞病毒和呼吸道合胞病毒等，給臨床醫(yī)師的診治帶來更大的困難，易造成不合理用藥，延誤病情。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的應(yīng)用，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，在封閉系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行操作，最大限度地減少了普通PCR導(dǎo)致的假陽性污染，并實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確定量,是CP感染的有效診斷方法[14]。但CP-DNA陽性也不能排除病原體定值可能，因此應(yīng)根據(jù)患兒的臨床特點(diǎn)和其他輔助檢查結(jié)果共同作出判斷。本組下呼吸道感染患兒均有相應(yīng)的X線胸片表現(xiàn)，血清CP-IgM陽性為61.11%，血清CP-IgG占46.30%，兩者均陽性占31.48%，符合CP感染的表現(xiàn)。由于初次感染時(shí)IgM大約在發(fā)病后3周左右出現(xiàn)，IgG在6～8周出現(xiàn)；再次感染時(shí)IgM可能不出現(xiàn)，IgG在1～2周出現(xiàn)[15]，因此早期檢測(cè)可出現(xiàn)假陰性，若能在恢復(fù)期復(fù)查CP抗體并與急性期比較，則更具有診斷價(jià)值。血常規(guī)和超敏C反應(yīng)蛋白是臨床常用的檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)鑒別細(xì)菌和病毒感染具有重要參考價(jià)值。本組CP感染患兒中，血白細(xì)胞計(jì)數(shù)正?；虻陀谡Ｕ?0.00%，中性粒細(xì)胞比例正?；虻陀谡Ｕ?7.14%，而超敏C反應(yīng)蛋白升高達(dá)40.00%，提示血常規(guī)正?；虻陀谡６鬋反應(yīng)蛋白升高有助于CP感染診斷。

一旦對(duì)CP感染明確診斷，可使用影響CP蛋白質(zhì)合成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進(jìn)行治療。Hammerschlag[16]報(bào)道，小兒CP肺炎用紅霉素或克拉霉素治療10d或阿奇霉素治療5d，其清除率可達(dá)79%～86%。本組資料顯示阿奇霉素是治療CP感染的有效藥物，可作為首選藥物。但也有十余例患兒好轉(zhuǎn)而未使用針對(duì)性抗生素，可能與在增強(qiáng)體質(zhì)和治療混合感染的情況下，CP感染有一定自限性有關(guān)[17]。

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2015-04-30）

（本文編輯：馬雯娜）

310003 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院感染科（王漢斌系杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院在讀本科生）

華春珍，E-mail：chunzhenhua@yahoo.com