過氧化物酶體增殖物激活受體-γ2基因多態(tài)性與冠心病易感性及血脂水平的關(guān)系研究

蔣健剛 蘭景良 杜曉馬

過氧化物酶體增殖物激活受體-γ2基因多態(tài)性與冠心病易感性及血脂水平的關(guān)系研究

蔣健剛 蘭景良 杜曉馬

目的 探討過氧化物酶體增殖物激活受體-γ2（PPAR-γ2）基因Pro12Ala及C161T位點單核苷酸多態(tài)性與金華市漢族人群冠心病易感性及血脂水平的關(guān)系。方法采用聚合酶連反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法對263例冠心病患者和207例健康體檢者進行PPAR-γ2基因Pro12Ala及C161T位點單核苷酸多態(tài)性檢測，并探討基因多態(tài)性對冠心病發(fā)生及血脂水平的影響。結(jié)果Pro12Ala位點多態(tài)性檢測顯示，兩組間基因型分布及等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0．05），在冠心病組中Ala等位基因攜帶者TC和LDL-C水平均高于非攜帶者（均P＜0．05）。C161T位點多態(tài)性檢測結(jié)果顯示，基因型和等位基因頻率在兩組間分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0．05）；兩組T等位基因攜帶者TG水平低于非攜帶者（P＜0．05）。結(jié)論PPAR-γ2基因Pro12Ala及C161T位點基因多態(tài)性可能與金華地區(qū)漢族人群冠心病發(fā)生無關(guān)，但Pro12Ala位點的Ala等位基因可能影響冠心病患者TC和LDL-C水平，C161T位點的T等位基因可能影響人群TG水平。

冠心病 血脂 過氧化物酶體增殖物激活受體-γ2 基因多態(tài)性

冠心病嚴重危害人類健康，其病因和發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚不完全清楚，但普遍認為是由遺傳和環(huán)境等多種因素共同作用所致[1]。研究證實，過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR-γ）具有很強的血脂調(diào)節(jié)能力，可能與代謝綜合征、2型糖尿病及動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1-4]。盡管有研究表明PPAR-γ2基因Pro12Ala及C161T位點多態(tài)性與冠心病發(fā)生及血脂水平有相關(guān)性，但在不同研究中所得出的結(jié)果也不盡一致[1-4]。本研究擬采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法（PCR-RFKP）檢測金華地區(qū)漢族人群PPAR-γ2基因Pro12Ala及C161T位點多態(tài)性，探討其與本地區(qū)漢族人群冠心病遺傳易感性及血脂水平的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2013年8月至2015年8月在金華市中醫(yī)醫(yī)院就診和住院的冠心病患者263例為冠心病組，其中男179例，女84例，年齡47～73（61.32±7.54）歲。入選同期性別、年齡等臨床資料相匹配的體檢者207例為對照組，其中男124例，女83例，年齡45～76（60.18±8.71）歲。兩組性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。冠心病診斷參考WHO制定的缺血性心臟病診斷標準[5]。所有入選者在入選時均詳細詢問病史和體格檢查，完善各項檢查項目，并排除神經(jīng)精神類疾病、腫瘤、感染性疾病、肝腎功能不全、風(fēng)濕免疫性疾病、婦科疾病及不愿參加者。所有入選人員均無血緣關(guān)系且在本地區(qū)居住3代以上，均知情同意，并簽署志愿同意書。

1.2 方法

1.2.1 血壓及生化指標檢測 采用電子血壓計測量所有入選者在安靜狀態(tài)下上臂的血壓，取3次的平均值。所有入選者均在清晨禁食8h以上后抽取外周靜脈血10ml：5ml置于EDTA抗凝管中，用于提取基因組DNA；另外5ml用于測定血漿TG、TC、HDK-C及KDK-C等生化指標。

1.2.2 基因組DNA提取 于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镌O(shè)計參考文獻[6-7]：Pro12Ala位點所用引物序列為：P1：5＇-GCC AAT TCA AGC CCA GTC-3＇；P2：5＇-GAT ATG TTT GCA GAC ATG GTA TCA GTG AAG GAA TCG CTT TCC G-3＇。C161T位點所用引物序列為：P1∶5＇-CAA GAC ACC CTG CTA CAA GC-3＇；P2：5＇-TCC TTG TAG ATC TCC TGC AG-3＇。PCR反應(yīng)體系為50μl，10× buffer 5μl，上下游引物各1μl，dNTPs（10mmol/K）2μl，基因組DNA 2μl，Taq plus DNA聚合酶2μl，ddH2O 37μl。Pro12Ala位點PCR反應(yīng)條件為95℃ 4min；95℃45s，55℃45s，72℃30s，進行35個循環(huán)；72℃5min。C161T位點反應(yīng)條件為 95℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 45s，72℃60s，進行35個循環(huán)；72℃7min。反應(yīng)結(jié)束后取2μl反應(yīng)產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行EB電泳檢測。PCR擴增產(chǎn)物分別用HpaⅡ和EcoR72Ⅰ限制性內(nèi)切酶消化。產(chǎn)物用2.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳（100V，30min），電泳后在紫外凝膠成像儀下拍照，根據(jù)酶切產(chǎn)物片段的組合型來判斷基因型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗；研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度，基因型和等位基因的組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組對象血壓及生化指標比較 見表1。

表1 兩組對象血壓及生化指標比較

由表1可見，兩組對象的舒張壓和TG差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），冠心病組的收縮壓、TC及KDK-C高于對照組，HDK-C低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.2 PPAR-γ2基因Pro12Ala位點基因型檢測結(jié)果 Pro-12Ala位點目標基因片段長267bp，根據(jù)酶切后片段長度不同分為3種基因型：PP型，包含224bp和43bp兩個片段；PA型，包含267bp、224bp和43bp 3個片段，43bp未顯示；AA型，只含267bp 1個片段，詳見圖1。

2.3 PPAR-γ2基因C161T位點基因型檢測結(jié)果 C161-T位點目標基因片段長200bp，根據(jù)酶切后片段長度不同分為3種基因型：CC型，包含120bp和80bp兩個片段；TC型，包含200bp、120bp和80bp 3個片段；TT型，只含200bp1個片段，詳見圖2。

圖1 PPAR-γ2基因Pro12Ala位點基因型檢測結(jié)果

2.4 兩組Pro12Ala及C161T位點基因型及等位基因頻率分布比較 對照組PPAR-γ2基因Pro12Ala及C161T位點的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律，說明對照組具有良好的群體代表性。各組間基因型及等位基因頻率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），詳見表2。

圖2 PPAR-γ2基因Pro12Ala位點基因型檢測結(jié)果

表2 兩組對象Pro12Ala及C161T位點基因型及等位基因頻率分布[例（%）]

2.5 兩組對象PPAR-γ2基因Pro12Ala位點基因型與血脂的關(guān)系 由于AA基因型較少，因此將PA型和AA型合并成Ala等位基因型攜帶者進行分析，見表3。

表3 兩組對象PPAR-γ2基因Pro12Ala位點基因型與血脂的關(guān)系（mmol/K）

由表3可見，冠心病組的Ala等位基因攜帶者TC及KDK-C水平高于非攜帶者（均P＜0.05），但在對照組中兩亞組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。兩組TG及HDKC水平在兩亞組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.6 兩組對象PPAR-γ2基因C161T位點基因型的血脂比較 由于TT基因型較少，所以將CT型和TT型合并為T等位基因攜帶者進行分析，見表4。

表4 兩組對象PPAR-γ2基因C161T位點基因型的血脂比較（mmol/K）

由表4可見，兩組對象的T等位基因攜帶者TG水平均低于非攜帶者（均P＜0.05），而TC、HDK-C、KDK-C水平在兩亞組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

PPAR-γ是一種主要由脂肪細胞分泌的蛋白質(zhì)，其主要生理作用為促進脂肪細胞合成并抑制脂肪細胞分解，對血脂代謝有很強的調(diào)節(jié)作用。PPAR-γ基因主要由脂肪細胞表達，可以對脂肪的存貯和釋放進行調(diào)控，維持人體的能量代謝平衡，對血糖和胰島素抵抗有調(diào)節(jié)作用，還參與血管的炎性反應(yīng)和動脈的粥樣硬化過程[1-4]。人類的PPAR-γ基因位于染色體3p25上，含有9個外顯子和3個啟動子，根據(jù)5＇端的剪切方式不同分為3種亞型：γ1、γ2、γ3[6]。其中γ2有兩種常見的單核苷酸基因位點突變，分別是B外顯子Pro12Ala的替換和第6個外顯子C161T的突變[8]。

PPAR-γ2基因Pro12Ala基因型與冠心病及血脂的關(guān)系在不同的研究中結(jié)果也不盡相同。Ki等[9]研究發(fā)現(xiàn)Pro12Ala基因型與冠心病發(fā)病有相關(guān)性，其多態(tài)性對冠心病發(fā)生可能有保護作用，但與血脂變化無明顯相關(guān)性；而Rhee等[10]研究認為PPAR-γ2基因Pro12Ala基因型與冠心病發(fā)生不存在相關(guān)性，而與血脂變化有關(guān)。在本研究中我們針對浙江省金華市漢族人群中PPAR-γ2基因Pro12Ala位點基因型進行了研究，結(jié)果顯示在對照組中PP型占72.95%、PA型占23.19%、AA型占3.86%，此結(jié)果與陳娟等[10]研究結(jié)果相似。在冠心病組與對照組中PP、PA、AA3種基因型及等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示Ala等位基因可能不是金華地區(qū)漢族人群冠心病發(fā)生的易感基因。在本研究中冠心病組的PA+AA型患者血漿TC及KDK-C水平較PP型患者高，而在對照組未觀察到類似的改變?？赡艿脑蚴荹11]：Pro12Ala基因可能與體內(nèi)脂蛋白脂酶（KPK）的活性相關(guān)，PPAR-γ2基因作為轉(zhuǎn)錄因子主要參與脂質(zhì)儲存和代謝的基因調(diào)控，Ala等位基因攜帶使得PPAR-γ2轉(zhuǎn)錄因子活性降低，相應(yīng)的KPK活性也下降，TC的清除量也減少，致使患者血漿TC和KDK-C水平升高；而對于健康攜帶者而言，Ala等位基因攜帶者血脂也有與冠心病患者相似的變化趨勢，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是Ala等位基因的攜帶僅僅使KPK活性降低，對血脂的影響較小而未表現(xiàn)出明顯的差異。Wang等[12]對647例澳大利亞冠心病人群研究結(jié)果表明，PPAR-γ2基因C161T位點的T等位基因攜帶者冠心病發(fā)生率低于CC基因型者；而Wan等[2]研究得出相反結(jié)論，認為PPAR-γ2基因C161T位點基因型與冠心病遺傳易感性無明顯相關(guān)性，但可能對冠心病患者的血脂有影響。本研究發(fā)現(xiàn)，金華地區(qū)漢族人群中C161T位點在冠心病組和對照組間基因型和等位基因頻率分布均無明顯差異，提示T等位基因可能不是金華地區(qū)漢族人群冠心病發(fā)生的易感基因，這與Wan等[2]的研究結(jié)果相似。在本研究中觀察到，無論是冠心病組還是對照組，C161T位點的T等位基因攜帶者血漿TG水平均明顯低于非攜帶者，提示T等位基因攜帶可能可以降低血漿TG水平，這與Tavares等[13]研究結(jié)果相似。

本研究結(jié)果顯示，PPAR-2γ基因 Pro12Ala及C161T位點的不同基因型均未發(fā)現(xiàn)與冠心病的發(fā)生有相關(guān)性，但均在一定程度上影響血脂水平。因本研究只是個局部區(qū)域的小樣本隊列研究，尚不能說明PPAR-γ2基因是否是冠心病發(fā)病的獨立影響因素以及對血脂的影響，尚需要更大規(guī)模更多區(qū)域的相關(guān)性研究進行證實。

（致謝：感謝金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院提供的技術(shù)支持?。?/p>

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（本文編輯：馬雯娜）

《浙江醫(yī)學(xué)》對計量單位的要求

本刊執(zhí)行GB 3100～3102-1993《量和單位》中有關(guān)量、單位和符號的規(guī)定及其書寫規(guī)則，具體執(zhí)行可參照中華醫(yī)學(xué)會雜志社編寫的《法定計量單位在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用》。注意單位名稱與單位符號不可混用。組合單位符號中表示相除的斜線多于1條時應(yīng)采用負數(shù)冪的形式表示，組合單位中斜線和負數(shù)冪亦不可混用，如ng/kg/min應(yīng)采用ng·kg-1·min-1的形式，不宜采用ng/kg-1·min-1的形式。在敘述中應(yīng)先列出法定計量單位數(shù)值，括號內(nèi)寫舊制單位數(shù)值；如果同一計量單位反復(fù)出現(xiàn)，可在首次出現(xiàn)時注出法定與舊制單位換算系數(shù)，然后只列法定計量單位數(shù)值。血壓仍以mmHg表示。

本刊編輯部

Association of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma 2 variants with coronary heart disease

JIANG Jiangang. LAN Jingliang. DU Xiaoma. Department of Cardiology. Jinhua TCM Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medicat University. Jinhua 321017. China

ObjectiveTo explore the association between peroxisome proliferator activated receptor-gamma 2 (PPAR-γ2)variants and risk of coronary heart disease(CHD)in Jinhua Han populations．MethodsA total of 263 patients with CHD and 207 healthy controls were recruited．The Pro12Ala and C161T polymorphisms of PPAR-γ2 gene were detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)．The association of Pro12Ala and C161T polymorphisms of PPAR-γ2 gene with CHD and plasma lipid levels was analyzed．ResultsNeither the frequencies of genotypes nor frequencies of alleles of Pro12Ala polymorphisms of PPAR-γ2 gene was statistically different between CHD group and control group(P＞0．05),but subjects with PA/AA genotypes had a higher plasma mean concentration of TC and LDL-C compared with those with the PP genotype in the CHD group(P＜0．05)．There were also no significant differences in the distribution of C161T genotypes and alleles between CHD and control groups(P＞0．05),but subjects with CT/TT genotypes had a lower plasma mean TG concentration than those with CC genotype(P＜0．05)．ConclusionThere may be no association between PPAR-γ2 gene Pro12Ala and C161T polymorphisms with CHD in Jinhua Han population,but the CHD patients who had PA/AA genotypes of Pro12Ala polymorphisms may have higher plasma levels of TC and LDL-C,and people who had CT/TT genotypes of C161T polymorphisms may have lower plasma level of TG．

Coronary heart disease Plasma lipid Peroxisome proliferator-activated receptors-gamma 2 Genepolymorphism

2015-09-24）

321000 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬金華中醫(yī)院心內(nèi)科

蔣健剛，E-mail：jjg2009768@163.com