miR-21對肺癌干細胞增殖、侵襲和化療敏感性的影響

(廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院ICU，廣東 廣州510095)

·基礎(chǔ)醫(yī)學·

miR-21對肺癌干細胞增殖、侵襲和化療敏感性的影響

田艷

(廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院ICU，廣東 廣州510095)

目的探討miR-21對肺癌干細胞增殖、侵襲能力，以及對化療藥物敏感性的影響。方法采用流式細胞邊緣群分選技術(shù)從人肺癌細胞系A(chǔ)549中分離出肺癌干細胞。應用脂質(zhì)體分別介導成熟miR-21的阻遏物(inhibitors)和模擬物(mimics)來抑制和增強肺癌干細胞miR-21的表達；實時熒光定量PCR檢測肺癌干細胞中miR-21表達水平的變化；噻唑藍(MTT)法檢測轉(zhuǎn)染干預前后肺癌干細胞的增殖情況和對化療藥物的敏感性；Transwell小室檢測肺癌干細胞遷移能力。結(jié)果抑制組肺癌干細胞miR-21表達水平明顯低于非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組，而增強組肺癌干細胞miR-21表達水平則顯著高于非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組(P<0.05)；抑制組肺癌干細胞轉(zhuǎn)染后各時間點增殖率較非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組明顯降低，而增強組肺癌干細胞轉(zhuǎn)染后各時間點增殖率較非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組顯著升高(P<0.05)；Transwell實驗顯示抑制組轉(zhuǎn)染后48 h穿過人工基底膜的細胞數(shù)為(29.55±5.48)個，明顯少于非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組，而增強組轉(zhuǎn)染后48 h穿過人工基底膜的細胞數(shù)為(74.47±8.63)個，明顯多于非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組(P<0.05)；順鉑(DDP)和吉西他濱(GEM)對抑制組轉(zhuǎn)染后48 h肺癌干細胞的IC50值明顯低于非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組(P<0.05)；DDP和GEM對增強組轉(zhuǎn)染后48 h肺癌干細胞的IC50值則明顯高于非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組(P<0.05)。結(jié)論下調(diào)miR-21的表達可以抑制肺癌干細胞的增殖和侵襲能力，增強其對化療藥物的敏感性。

肺癌干細胞； miR-21； 細胞增殖； 化療； 耐藥性

隨著空氣環(huán)境質(zhì)量的不斷惡化，我國肺癌的發(fā)病率居高不下，甚至呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。據(jù)國家癌癥中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國肺癌發(fā)病率每年增長達26.9%，已代替肝癌成為我國首位惡性腫瘤死亡原因[1]。盡管目前針對肺癌的診療技術(shù)上已經(jīng)取得長足的進展，但由于肺癌患者就診時多為中晚期，易發(fā)生腫瘤擴散/轉(zhuǎn)移，以及腫瘤細胞對化療不敏感這些不利因素，因此導致肺癌患者總體預后較差。隨著對腫瘤發(fā)生機制研究的不斷深入，科學家們發(fā)現(xiàn)干細胞樣腫瘤細胞——即腫瘤干細胞，在腫瘤的發(fā)生、復發(fā)/轉(zhuǎn)移和化療耐藥中起著至關(guān)重要的作用[2]。因此，將腫瘤干細胞作為腫瘤治療的靶細胞進行研究是目前腫瘤學領(lǐng)域的研究熱點。microRNA-21 (miR-21) 是近年來發(fā)現(xiàn)的一個在惡性腫瘤中高表達的小RNA分子。研究顯示miR-21與腫瘤細胞的增殖、凋亡和化療敏感性有關(guān)[3]。本次實驗采用肺癌干細胞作為研究對象。研究調(diào)控肺癌干細胞中miR-21的表達對細胞增殖、侵襲能力，以及對化療藥物敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1主要材料與試劑人肺癌細胞系A(chǔ)549購自中國科學院上海生命科學院細胞庫； DMEM F12培養(yǎng)基、小牛血清購于Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)和熒光染料Hoechst33342購自Sigma公司；Trizol、miRNA SYBR Green PCR Kit 和miScript Reverse Transcription Kit購自天根生化科技(北京)有限公司；miR-21、U6引物序、miR-21 inhibitors和miR-21 mimics購自美國Applera公司；Nanodrop?ND-1000購自美國NanoDrop公司；Prism?7300實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) A549細胞系接種于含10%小牛血清，100 u/mL青霉素，100 u/mL鏈霉素的DMEM F12 培養(yǎng)基中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2飽和濕度條件)。0.25%胰蛋白酶消化液消化、傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 肺癌干細胞分選[4-5]將培養(yǎng)的A549細胞消化并制成單細胞懸液。將單細胞懸液分為兩組，分別加入熒光染料Hoechst33342和維拉帕米至終濃度分別為6 mg/L和50 mmol/L。采用Advantage II型流式細胞儀進行肺癌干細胞分選，選擇355nmUV激光發(fā)射源進行檢測，根據(jù)細胞二維散點圖形態(tài)及參數(shù)分選出邊緣群細胞，即為肺癌干細胞。

1.2.3 細胞分組及轉(zhuǎn)染 制備Lipofectamine2000-miR-21 inhibitor和mimics的復合物,并將其轉(zhuǎn)染分選后的肺癌干細胞，并接種于六孔板中培養(yǎng)24 h，即為抑制組(inhibitor)和增強組(mimics)。轉(zhuǎn)染48 h后采用實時熒光定量RT-PCR檢測細胞miR-21表達水平。同時將未經(jīng)轉(zhuǎn)染處理肺癌干細胞作為非轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的肺癌干細胞作為陰性對照組。miR-21inhibitor[6]：5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′，5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′；miR-21 mimics：5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′，5′-AACAUCAG UCUGAUAAGCUAUU-3′。

1.2.4 實時熒光定量PCR(real-time PCR) ①Total RNA抽提：采用Trizol試劑對細胞總RNA進行提取。每5×107細胞數(shù)加入1 mL Trizol試劑裂解。經(jīng)過RNA沉淀、洗滌、溶解后。在分光光度計Nanodrop?ND-1000上測定RNA濃度。RNA電泳檢測RNA分子完整性。②逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應：按照miScript Reverse Transcription Kit的說明進行操作。反應體系：RNA 3 μL，mirVana RT Buffer(5×)2 μL，1×mirVana RT Primer 1 μL，Array script Enzyme Mix 0.4 μL，加RNase-free water至總體積10 μL。反應條件：37 ℃，60 min；95 ℃，5 min。③PCR反應：5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，PCR Forward Primer(20×) 1 μL，PCR Reverse Primer(20×) 1 μL，1×cDNA模板 1～2.5 μL，加入ddH2O 至總體積20 μL。 反應條件：95 ℃ 15 min； (95 ℃，5 s；60 ℃，30 s) 40個PCR循環(huán)。反應結(jié)束后分析PCR反應曲線，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法對miR-21表達相對值進行分析。引物序列：miR-21 F：5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCA G-3′，R：5′-CAACTGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCAC GAATTTGCGT-3′。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽(MTT)實驗 ①細胞增殖檢測：將四組肺癌干細胞接種于96孔板(平均5×104個/孔)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下孵育4 h。終止反應后棄上清液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min。在全自動酶標儀上以490 nm波長檢測各孔的吸光度(OD)，計算腫瘤細胞增殖情況并繪制細胞生長曲線圖。②細胞對化療藥物敏感性檢測：將四組肺癌干細胞按5×104/孔接種于96 孔板中培養(yǎng)24 h后，設(shè)置DDP組、GEM組和空白對照組。配制不同濃度的含DDP (DDP濃度分別為1、4、8、12、16、18、22、26、30、34、38、40 mg/L)和GEM藥物(GEM濃度分別為10、50、100、150、200、250、300、350、400、450 mg/L)的細胞培養(yǎng)基，然后分別加入相應培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每個藥物不同濃度分別設(shè)置6個復孔；同時設(shè)置無藥物干預的細胞對照組和無細胞的空白對照組。干預培養(yǎng)細胞24 h 后，加入20 μL MTT(5 g/L)孵育4 h，去除培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，振蕩10 min。在全自動酶標儀上以490 nm波長檢測各孔的吸光度(OD)，計算半數(shù)抑制劑量(IC50)。

1.2.6 Transwell小室實驗 采用孔徑為8μm的聚碳酸酯膜Transwell小室，在濾膜的上下表面分別鋪以Matrigel和纖維粘連蛋白，上室加1×108/L腫瘤細胞懸液200 μL，下室加入400 μL含10%肽牛血清的條件培養(yǎng)液，置于37 ℃,50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后棉簽擦去微孔膜上室面的細胞，HE染色后，倒置顯微鏡下隨機選擇5個視野，統(tǒng)計視野中細胞數(shù)，以細胞的相對數(shù)表示腫瘤細胞的侵襲能力。每組重復試驗3次。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染干預前后肺癌干細胞miR-21表達水平改變情況利用流式邊緣群細胞分選技術(shù)分離所得肺癌干細胞約占所有肺癌細胞的1.57%(圖1)。real- time PCR檢測各組細胞miR-21表達水平。結(jié)果顯示：非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組肺癌干細胞miR-21表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；抑制組肺癌干細胞miR-21表達水平明顯低于非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組，而增強組肺癌干細胞miR-21表達水平則顯著高于非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組，差異比較均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

圖1 肺癌干細胞流式分選圖

圖2 不同干預組肺癌干細胞miR-21表達水平比較 與非轉(zhuǎn)染組或陰性對照組比較，*:P<0.05

2.2轉(zhuǎn)染干預miR-21表達對肺癌干細胞增殖的影響MTT細胞生長曲線圖顯示：非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組增殖生長曲線比較的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；抑制組肺癌干細胞轉(zhuǎn)染后各時間點增殖率明顯降低，同非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而增強組肺癌干細胞轉(zhuǎn)染后各時間點增殖率則顯著升高，同非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。

2.3轉(zhuǎn)染干預miR-21表達對肺癌干細胞侵襲能力的影響非轉(zhuǎn)染組穿過人工基底膜的細胞數(shù)為(59.47±7.40)個，陰性對照組穿過人工基底膜的細胞數(shù)為(57.72 ±7.28)個，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；抑制組轉(zhuǎn)染后48 h穿過人工基底膜的細胞數(shù)為(29.55 ±5.48)個，明顯少于非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組(P<0.05)；增強組轉(zhuǎn)染后48 h穿過人工基底膜的細胞數(shù)為(74.47 ±8.63)個，明顯多于非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組(P<0.05) (圖4、5)。

圖3 不同干預組肺癌干細胞增殖情況比較

圖4 不同干預組肺癌干細胞侵襲能力比較 與非轉(zhuǎn)染組或陰性對照組比較，*：P<0.05

圖5 不同干預組肺癌干細胞Transwell結(jié)果比較(200×) A:非轉(zhuǎn)染組;B:陰性對照組;C:抑制組;D:增強組

2.4轉(zhuǎn)染干預miR-21前后肺癌干細胞耐藥性檢測

DDP和GEM對非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組肺癌干細胞的IC50值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；DDP和GEM對抑制組轉(zhuǎn)染后48 h肺癌干細胞的IC50值明顯低于非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組(P<0.05)；DDP和GEM對增強組轉(zhuǎn)染后48 h肺癌干細胞的IC50值則明顯升高，同非轉(zhuǎn)染組和陰性對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05) (表1)。

表1不同干預組肺癌干細胞藥物IC50(mg/L)

化療藥物非轉(zhuǎn)染組陰性對照組抑制組增強組DDP22.45±3.1722.18±2.9714.38±2.41a27.39±2.82aGEM289.53±24.61288.35±26.25219.04±33.76a329.27±35.47a

與非轉(zhuǎn)染組比較，a:P<0.05

3 討 論

腫瘤干細胞理論認為：惡性腫瘤是一種干細胞疾病。目前已在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞的存在[7-8]。大量的研究表明：腫瘤干細胞所具有的無限增殖、高侵襲/轉(zhuǎn)移特性，以及對化療藥物的天然耐藥性是導致目前腫瘤治療失敗的罪魁禍首。因此，本次實驗選擇肺癌干細胞作為研究對象。目前確認的鑒別和分離肺癌干細胞的方法有多種[9]。本次研究利用腫瘤干細胞普遍表達轉(zhuǎn)運蛋白ABCG2而具有外排熒光染料Hoechst33342的特性來從肺癌細胞系A(chǔ)549 中鑒別和獲取肺癌干細胞[4]。結(jié)果顯示利用流式邊緣群細胞分選技術(shù)分離所得肺癌干細胞約占所有肺癌細胞的1.57%。

miRNA是目前已知在腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的內(nèi)源性非編碼小RNA分子[10]。隨著對腫瘤干細胞相關(guān)miRNAs的研究，發(fā)現(xiàn)miRNA在維持腫瘤干細胞的干細胞特性中起重要調(diào)控作用[11]。miR-21為目前已知的腫瘤相關(guān)miRNA。在多種惡性腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)miR-21的表達明顯高于正常同類組織。通過功能學研究表明，miR-21能夠調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移。在膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等多種腫瘤中的研究均表明，通過人為抑制腫瘤細胞中miR-21的表達，可以抑制腫瘤細胞的增殖和成瘤能力，促進其凋亡。進一步對其下游靶基因的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21能夠調(diào)控腫瘤相關(guān)基因PDCD4、maspin、Bcl-2、HNRPK、TAp63、TGF-β等的表達，從而改變腫瘤細胞的增殖和侵襲能力[12-13]。本次研究我們通過人工合成miR-21 inhibitors和mimics并成功轉(zhuǎn)染肺癌干細胞后能抑制或增強細胞中miR-21的表達。MTT和Transwell小室檢測結(jié)果顯示，抑制miR-21的表達后肺癌干細胞的增殖和侵襲能力明顯減弱，而上調(diào)miR-21的表達則能夠增強肺癌干細胞增殖和侵襲性。這一研究表明miR-21具有調(diào)控肺癌干細胞在體外的增殖和侵襲能力。

腫瘤干細胞具有的天然耐藥性導致化療藥物無法完全消滅腫瘤干細胞，因而是化療治療失敗的關(guān)鍵所在。目前證實的腫瘤干細胞耐藥性與其細胞膜表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白、DNA修復能力增強、抗凋亡基因表達增強等機制有關(guān)[14-15]。本次選用DDP和GEM這兩種臨床上肺癌患者最常用的化療藥物來研究miR-21對肺癌干細胞耐藥性的影響。結(jié)果顯示，抑制肺癌干細胞中miR-21的表達能夠顯著降低DDP和GEM的IC50值，反之增強肺癌干細胞中miR-21的表達則會導致DDP和GEM的IC50值明顯升高。說明miR-21能夠逆轉(zhuǎn)肺癌干細胞對化療藥物的敏感性。已有的證據(jù)顯示，miR-21在腫瘤耐藥性中的作用可能通過對hMSH2、PTEN等腫瘤耐藥相關(guān)基因的調(diào)控，進而影響肺癌干細胞對化療藥物的敏感性[16-17]。

綜上，本次研究結(jié)果顯示miR-21在肺癌干細胞的增殖、侵襲和化療耐藥性中起著重要的調(diào)控作用。然而其具體的相關(guān)機制還有待進一步研究。隨著未來結(jié)合miRNA與腫瘤干細胞而進行的靶向性研究，有望在腫瘤治療取得新的進展和突破。

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EffectofmiR-21ontheCapacityofProliferation,InvasionandChemo-SensitivityinLungCancerStemCells

TIAN Yan

(DepartmentofICU,AffiliatedCancerHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510095,China)

ObjectiveTo investigatet the effect of miR-21 on the capacity of proliferation,invasion and chemo-sensitivity in lung cancer stem cells.MethodsLung cancer stem cells were isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS) from human lung adenocarcinoma cell line A549.The miR-21 inhibitors and mimics were transfected into Lung cancer stem cells by liposome.The expression levels of miR-21 in Lung cancer stem cells was measured by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).MTT method was used to evaluate the capability of cell proliferation and chemoresistance.The invasive capability of cells was evaluated by using transwell chamber model.ResultsThe expression of miR-21 in inhibition group was obviously lower than non-transfection group and negative control group,and in enhanced group it was obviously higher than non-transfection group and negative control group (P<0.05).The proliferation rate at each time point in inhibition group was down-regulated compared with non-transfection group and negative control group,and in enhanced group it was up-regulated compared with non-transfection group and negative control group (P<0.05).Transwell chamber assay demonstrated the cell penetrating number was 29.55 ±5.48 in inhibition group at 48 h post-transfection,which was obviously less than non-transfection group and negative control group(P<0.05).In enhanced group,the cell penetrating number was 74.47 ±8.63,which was obviously more than non-transfection group and negative control group (P<0.05).The half inhibition concentration (IC50) of Cisplatin (DDP) and Gemcitabine (GEM) in inhibition group was obviously lower than non-transfection group and negative control group.And in enhanced group it was obviously higher than non-transfection group and negative control group (P<0.05).ConclusionDown-regulation of miR-21 expression in lung cancer stem cells would inhibit their ability of proliferation and invasion,enhance the sensitivity to chemotherapy.

lung cancer stem cell; miR-21; cell proliferation; chemoresistance

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.06.009

2016-03-08；

2016-09-17

R735.6

A

秦旭平)