DADS上調(diào)RORα抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖與遷移侵襲

，， ，， ， ， ， *

(1.南華大學(xué)藥學(xué)與藥理學(xué)研究所，湖南省高校藥物蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)腫瘤研究所,湖南省胃癌研究中心，湖南省高校腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.南華大學(xué)附屬懷化醫(yī)院，懷化市第一人民醫(yī)院；4.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科；5.海南省婦幼保健院)

·消化系統(tǒng)疾病專(zhuān)題·

欄目主持人——許翠萍博士

許翠萍 博士

論文點(diǎn)評(píng)：消化系統(tǒng)疾病是人類(lèi)的多發(fā)病和常見(jiàn)病，包括消化道腫瘤、潰瘍、胃炎、慢性肝病等。本期蘇波等發(fā)表的二烯丙基二硫(DADS)通過(guò)上調(diào)維甲酸相關(guān)孤核受體α(RORα)表達(dá)抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期與遷移侵襲，為探索和開(kāi)發(fā)研究抑制胃癌新藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。陳敏等觀察到替吉奧單藥聯(lián)合熱療技術(shù)能顯著增強(qiáng)老年晚期胃癌患者的臨床治療效果，且治療過(guò)程中不良反應(yīng)較少，值得借鑒。在消化性潰瘍方面，朱友等臨床觀察到注射用奧美拉唑聯(lián)合康復(fù)新液治療消化性潰瘍并出血的臨床效果較好，復(fù)發(fā)率低，為該類(lèi)疾病的治療提供了有價(jià)值的依據(jù)。乙型肝炎治療也是醫(yī)學(xué)難題之一，滕丹華及其同行發(fā)現(xiàn)e抗原陽(yáng)性乙型肝炎病毒(HBV)患者應(yīng)用干擾素聯(lián)合拉米夫定治療可以改善血清ALT、HBV DNA水平、提高HBeAb/HBeAg轉(zhuǎn)換率、HBsAg及HBV DNA陰轉(zhuǎn)率，治療過(guò)程中不良反應(yīng)少、應(yīng)予推廣。在本期鮑樂(lè)及其同事還探討兩種不同化療方案聯(lián)合經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞(TACE)治療不可切除肝癌的臨床療效和安全性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷替曲塞與奧沙利鉑聯(lián)合TACE治療不可切除肝癌的臨床療效較好，不良反應(yīng)較少、值得臨床參考。

DADS上調(diào)RORα抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖與遷移侵襲

蘇波1,2，向姝霖2,3，蘇堅(jiān)2,4，趙曉紅2,5，夏紅2，劉芳2，凌暉2，蘇琦2*

(1.南華大學(xué)藥學(xué)與藥理學(xué)研究所，湖南省高校藥物蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)腫瘤研究所,湖南省胃癌研究中心，湖南省高校腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.南華大學(xué)附屬懷化醫(yī)院，懷化市第一人民醫(yī)院；4.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科；5.海南省婦幼保健院)

目的研究二烯丙基二硫(DADS)是否通過(guò)上調(diào)維甲酸相關(guān)孤核受體α(RORα)表達(dá)抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期與遷移侵襲。方法實(shí)驗(yàn)組分為6組，對(duì)照組，空載體組，RORα干擾組(miR-RORα)，DADS組，空載體聯(lián)合DADS組，miR-RORα聯(lián)合DADS組。Western blot檢測(cè)RORα、MMP-9與TIMP3蛋白表達(dá)。MTT、流式細(xì)胞術(shù)、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期與遷移侵襲的改變。結(jié)果DADS處理細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組和空載體組比較，DADS上調(diào)RORα和TIMP3、下調(diào)MMP-9蛋白表達(dá)。干擾組較對(duì)照組與空載體組RORα表達(dá)明顯下調(diào)。與DADS處理組比較，干擾RORα表達(dá)上調(diào)MMP-9、下調(diào)TIMP3蛋白表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，DADS抑制MGC803細(xì)胞增殖，而干擾RORα表達(dá)促進(jìn)增殖。流式細(xì)胞術(shù)顯示，DADS誘導(dǎo)G2/M期阻滯，下調(diào)RORα削弱其作用。遷移實(shí)驗(yàn)顯示，DADS處理組遷移距離明顯減少。RORα干擾組遷移距離明顯高于對(duì)照組和空載體組。侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，DADS處理組較對(duì)照組和空載體組穿膜細(xì)胞明顯減少。干擾組穿膜細(xì)胞明顯多于對(duì)照組和空載體組。干擾RORα表達(dá)降低DADS對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用。結(jié)論DADS上調(diào)TIMP3表達(dá)，下調(diào)MMP-9表達(dá)，抑制MGC803細(xì)胞增殖與遷移侵襲，其作用機(jī)制與上調(diào)RORα表達(dá)有關(guān)。

二烯丙基二硫； RORα； 人胃癌細(xì)胞； 增殖； 遷移與侵襲

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)生率與死亡率分別為全球第四位與第三位[1]。據(jù)2015年最新統(tǒng)計(jì)，胃癌在我國(guó)的發(fā)生率與死亡率位于第二，每年約新發(fā)67.9萬(wàn)和死亡49.8萬(wàn)人[2]。由于患者就診時(shí)大多已發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，5年生存率低于10%[3]。因此，研究胃癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找靶點(diǎn)具有重要的意義。

維甲酸相關(guān)孤核受體α(Retinoid acid receptor related Orphan Receptor α,RORα)是核受體超家族成員之一，在調(diào)節(jié)生理與病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)RORα與腫瘤密切相關(guān)，可能是腫瘤治療靶點(diǎn)[5]。最近，本實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定二烯丙基二硫(Diallyl disulfide，DADS)處理人胃癌MGC803細(xì)胞的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)RORα蛋白表達(dá)明顯上調(diào)[6]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究DADS是否通過(guò)上調(diào)RORα抑制胃癌細(xì)胞增殖與遷移侵襲。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌MGC803細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存，miR-RORα穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[7]，置于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組分為6組：未處理對(duì)照組，DADS組，空載體組，RORα干擾組(miR-RORα)，空載體聯(lián)合DADS組，miR-RORα聯(lián)合DADS組。

1.2主要試劑BCA蛋白定量試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；RORα與β-actin抗體購(gòu)自Abcam公司；MMP-9與TIMP3 抗體和ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Santa Cruz公司；新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程公司。

1.3 MTT檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔平底培養(yǎng)板，每個(gè)樣本設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。細(xì)胞貼壁6～8 h后更換為150 μL RPMI 1640完全培養(yǎng)基，再加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄培養(yǎng)基，加150 μL DMSO溶液，室溫震蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm處測(cè)量各孔吸光值。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD570值/對(duì)照組OD570) ×100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，1 000 rpm×5 min離心，預(yù)冷PBS液重懸細(xì)胞，重復(fù)離心一次；將收集的細(xì)胞用4 ℃預(yù)冷的75%乙醇固定。上機(jī)前將乙醇固定的細(xì)胞離心洗滌，去上清搖勻；加RNA酶50 μL，37 ℃水浴30 min；加碘化丙啶50 μL，振蕩混勻，避光置冰箱30 min；300目尼龍網(wǎng)濾過(guò)，上機(jī)檢測(cè)，進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.5遷移實(shí)驗(yàn)將0.8×105個(gè)各組MGC803細(xì)胞接種在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組3個(gè)平行樣本。RPMI 1640培養(yǎng)基37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，直至形成細(xì)胞單層。用20 μL的tip頭垂直板面劃痕，無(wú)血清培養(yǎng)液洗3次，加入新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基。倒置顯微鏡下觀察、測(cè)量劃痕區(qū)相對(duì)距離。

1.6侵襲實(shí)驗(yàn)將基質(zhì)膠稀釋液鋪置在transwell小室中，放置成膜。取100 μL細(xì)胞稀釋液接種至小室上腔，取500 μL含10%胎牛血清培養(yǎng)基添加至下腔，小室放置在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后取出，擦棄小室上層細(xì)胞并用4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS液洗滌，晾干。光鏡下觀察隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。

1.7 Western blot檢測(cè)收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每組取等量樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加一抗，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 13統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 DADS上調(diào)MGC803細(xì)胞RORα表達(dá)如圖1所示，與對(duì)照組、空載體組比較，用30 mg/L DADS處理細(xì)胞24 h后， RORα蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，而miR-RORα穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞(RORα干擾組)RORα蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。miR-RORα可顯著下調(diào)DADS處理組RORα蛋白表達(dá) (P<0.05)。

圖1 DADS與miR-RORα對(duì)RORα蛋白表達(dá)的影響 1:對(duì)照組;2:空載體;3:miR-RORα;4:DADS;5:空載體聯(lián)合DADS;6:miR-RORα聯(lián)合DADS. 與對(duì)照組和空載體組比較，*P<0.05；與miR-RORα聯(lián)合DADS組比較，#P<0.05

2.2干擾RORα表達(dá)對(duì)DADS抑制MGC803細(xì)胞增殖的影響之前已證實(shí)干擾-RORα表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]。為了研究下調(diào)RORα表達(dá)是否影響DADS對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，用30 mg/L DADS分別處理miR-RORα穩(wěn)定表達(dá)MGC803細(xì)胞24，48和72 h。結(jié)果顯示，與DADS組、空載體聯(lián)合DADS組比較，miR-RORα聯(lián)合DADS組細(xì)胞增殖抑制率下調(diào) (P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1MTT檢測(cè)干擾RORα表達(dá)對(duì)DADS處理不同時(shí)間細(xì)胞增殖率的影響(%)

時(shí)間DADS空載體聯(lián)合DADSmiR-RORα+DADS24h43.02±5.1242.18+6.2125.31+2.47a48h52.97+4.2354.36+3.1834.66+3.11a72h66.92+2.1065.31+3.5433.31+4.32a

與DADS和空載體聯(lián)合DADS相同時(shí)間比較， a:P<0.05

2.3 DADS與干擾RORα表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞周期的影響如表2所示，對(duì)照組與空載體組G2/M期細(xì)胞百分率分別為21.5%與20.7%。干擾RORα表達(dá)后，G2/M期細(xì)胞比率為11.6%。用30 mg/L DADS處理24 h后，DADS組與空載體聯(lián)合DADS組G2/M期細(xì)胞比率分別為44.0%與43.6%，較對(duì)照組與空載體組明顯增加(P<0.05)，而miR-RORα聯(lián)合DADS組G2/M期細(xì)胞比率為33.1%，低于DADS組與空載體聯(lián)合DADS組。

表2DADS與干擾RORα表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞周期的影響(%)

對(duì)照組空載體組miR-RORαDADS空載體聯(lián)合DADSmiR-RORα聯(lián)合DADSG152.451.941.529.331.732.6S26.127.446.926.724.734.3G2/M21.520.711.6a44.0ab43.6ab33.1

與對(duì)照組和空載體組比較，a:P<0.05； 與 miR-RORα聯(lián)合DADS比較， b:P<0.05

2.4 DADS與干擾RORα表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞遷移的影響如圖2所示，0 h各組劃痕距離基本相同 (P>0.05)。24 h后，miR-RORα組遷移距離1.76 ± 0.19 mm明顯高于對(duì)照組1.32 ± 0.14 mm和空載體組1.29 ± 0.17 mm (P<0.05)。用30 mg/L DADS處理24 h后，DADS組和空載體聯(lián)合DADS組遷移距離分別明顯減少為0.58±0.08 mm、0.61±0.07 mm，而miR-RORα聯(lián)合DADS組遷移距離0.95±0.09 mm較DADS組和聯(lián)合DADS組遷移距離增加 (P<0.05)。

圖2 DADS與干擾RORα表達(dá)對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞遷移的影響(100×)

2.5 DADS與干擾RORα表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞侵襲的影響如圖3所示，miR-RORα組穿膜細(xì)胞172±27個(gè)明顯多于對(duì)照組147±17個(gè)和空載體組149±14個(gè)(P<0.05)。用30 mg/L DADS處理24 h后，DADS組和空載體聯(lián)合DADS組平均細(xì)胞數(shù)分別為35±4和37±8個(gè)，細(xì)胞侵襲能力均明顯減弱(P<0.05)，而miR-RORα聯(lián)合DADS組穿膜細(xì)胞97±18個(gè)，與DADS組與空載體聯(lián)合DADS組比較差異具有顯著性(P<0.05)。

2.6 DADS與干擾RORα表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞MMP-9和TIMP3表達(dá)的影響與對(duì)照組和空載體組比較，干擾RORα表達(dá)可明顯上調(diào)MMP-9、下調(diào)TIMP3蛋白表達(dá) (P<0.05)；用30 mg/L DADS處理24 h后，可明顯下調(diào)MMP-9、上調(diào)TIMP3蛋白表達(dá)(P<0.05)。干擾RORα表達(dá)后，DADS對(duì)MMP-9和TIMP3蛋白表達(dá)的作用減弱(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

3 討 論

目前認(rèn)為，RORα在腫瘤中起著抑癌基因的作用。RORα在乳腺癌表達(dá)下調(diào)和活性下降，而上調(diào)RORα表達(dá)可在體內(nèi)外抑制乳腺癌細(xì)胞增殖與侵襲和裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)SEMA3F表達(dá)上調(diào)，提示RORα是乳腺癌治療的靶點(diǎn)[5,8]。RORα及其靶基因在人結(jié)腸癌中表達(dá)降低，而RORα活化可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與遷移以及血管發(fā)生，表明RORα低表達(dá)是結(jié)腸癌發(fā)生的危險(xiǎn)信號(hào)[9]。RORα磷酸化可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合β-catenin，抑制Wnt/β-catenin通路靶基因cyclin D1、c-myc、Axin表達(dá)。RORα可依賴(lài)PGE2/PKCα途徑磷酸化減弱結(jié)腸癌細(xì)胞Wnt靶基因表達(dá)，表明RORα是腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵調(diào)控因子[10,11]。RORα在肝癌組織表達(dá)明顯下調(diào)，與血清AFP、病理分級(jí)、腫瘤復(fù)發(fā)、血管侵襲和預(yù)后密切相關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)室證實(shí)，RORα蛋白在胃癌組織表達(dá)明顯低于正常胃黏膜和癌旁黏膜，高分化腺癌明顯高于中分化與低分化腺癌，表明RORα低表達(dá)與胃癌的發(fā)生和分化相關(guān)[13]。近年來(lái)，研發(fā)促進(jìn)RORα表達(dá)的有效藥物為治療腫瘤開(kāi)拓了新的途徑[5]。植物提出物neoruscogenin可活化RORα并影響其靶基因的表達(dá)[14]。RORα 激動(dòng)劑SR1078處理腫瘤細(xì)胞可穩(wěn)定p53蛋白表達(dá)與誘導(dǎo)凋亡[15]。

圖3 DADS與干擾RORα表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞侵襲能力的影響(100×) A:對(duì)照組;B:空載體組;C:miR-RORα;D:DADS;E:空載體聯(lián)合DADS;F:miR-RORα聯(lián)合DADS

圖4 DADS與干擾RORα表達(dá)對(duì)MMP-9和TIMP3蛋白表達(dá)的影響 1:對(duì)照組;2:空載體組;3:miR-RORα;4:DADS;5:空載體聯(lián)合DADS;6:miR-RORα聯(lián)合DADS 與對(duì)照組和空載體組比較， *P<0.05； 與空載體聯(lián)合DADS 和 DADS比較，#P<0.05

二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)是大蒜中的一種脂溶性的有效成分，對(duì)多種腫瘤均有明顯的抑制作用，在調(diào)節(jié)生物酶降低化學(xué)致癌物毒性，抑制DNA加合物形成，阻滯細(xì)胞周期演進(jìn)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和調(diào)亡，組蛋白修飾，抑制遷移侵襲等方面發(fā)揮重要作用，是一種具有開(kāi)發(fā)潛力的抗腫瘤藥物[16]。前期工作證明，DADS可體內(nèi)外抑制MGC803細(xì)胞的增殖，其機(jī)制與G2/M阻滯，激活p38與抑制ERK通路，調(diào)節(jié)ATR/Chk1/Cdc25C/cyclin B1，上調(diào)組蛋白乙酰化與p21，上調(diào)miR-200b和miR-22阻斷Wnt通路等有關(guān)[16-19]。并且，DADS可通過(guò)Rac1-Pak1/Rock1通路下調(diào)LIMK1、MMP-9和上調(diào)TIMP-3，抑制人胃癌細(xì)胞EMT與侵襲[20]。最近，本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)DADS處理人胃癌MGC803細(xì)胞差異蛋白質(zhì)中，RORα蛋白明顯上調(diào)[6]。本研究結(jié)果顯示，DADS上調(diào) RORα表達(dá)，下調(diào)MMP-9和上調(diào)TIMP3表達(dá)，而干擾RORα表達(dá)可降低DADS的作用。DADS誘導(dǎo)MGC803細(xì)胞增殖抑制與G2/M期阻滯，而干擾RORα表達(dá)可削弱其作用。遷移實(shí)驗(yàn)與侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，干擾RORα表達(dá)可降低DADS對(duì)MGC803細(xì)胞遷移與侵襲的抑制作用。上述結(jié)果表明下調(diào)RORα促進(jìn)MGC803細(xì)胞增殖與遷移侵襲，DADS上調(diào)RORα與其下調(diào)MMP-9和上調(diào)TIMP3、抑制細(xì)胞增殖與遷移侵襲有關(guān)。然而，DADS上調(diào)RORα抑制人胃癌細(xì)胞增殖與遷移侵襲的分子機(jī)制尚待深入研究。

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Up-regulationofRORαInducedbyDiallylDisulfideInhibitingProliferaion,MigrationandInvasionofHumanGastricCancerMGC803Cells

SU Bo,XIANG Shulin,SU Jian,et al

(KeyLaboratoryforPharmacoproteomicsofHunanProvincialUniversity,InstituteofPharmacyandPharmacology,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate whether diallyl disulfide (DADS) inhibits human gastric cancer MGC803 cell proliferation,migration and invasion by up-regulating the expression of RORα.MethodsThe experimental group was divided into six groups,control group,vector group,DADS group,vector+DADS group,and miR-RORα+DADS group.RORα,miR-RORα,MMP-9 and TIMP3 protein levels were detected by using Western blot.MTT and flow cytometry were used for cell proliferation and cell cycle assays.Wound healing and transwell assays were performed to examine cell migration and invasion activities.ResultsDADS increased RORα and TIMP3 expression,decreased MMP-9 expression.TIMP3 was down-regulated and MMP-9 was up-regulated in miR-RORα stable expression cells.DADS induced cell proliferation inhibition and cell cycle G2/M phase arrest.Downregulation of RORα by miR attenuated these effects of DADS.Compared with control and vector groups,the migration distance was decreased and increased in DADS treated and miR-RORα expression groups,respectively.And,the mumber of cancer cells which passed through the Matrigel coated membrane was reduced and increased in DADS treated and miR-RORα expression groups,respectively.miR-RORα attenuated the inhibitory effects of DADS on cell migration and invasion.ConclusionsDADS can increase TIMP3 and decrease MMP-9 expression,suppressing proliferation,migration and invasion of human gastric cancer MGC803 cells,and its mechanism may be associated with up-regulating RORα.

diallyl disulfide; RORα; human gastric cancer cells; proliferation; migration and invasion

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.06.002

2016-06-08；

2016-11-09

國(guó)家自然科學(xué)基金(81374013,81102854),湖南省衛(wèi)計(jì)委科研課題(B2015-182).

向姝霖為并列第一作者.*

，E-mail:suqi1945@163.com.

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蔣湘蓮)