蚤休薯蕷皂苷聯(lián)合順鉑抑制小鼠移植瘤生長及轉(zhuǎn)移

，，，，，

(粵北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 韶關(guān) 512026)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

蚤休薯蕷皂苷聯(lián)合順鉑抑制小鼠移植瘤生長及轉(zhuǎn)移

鄧日強(qiáng)，程江濤，張宏華，楊印樓，劉清毅，謝斌

(粵北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 韶關(guān) 512026)

目的探討蚤休薯蕷皂苷(RD)聯(lián)合順鉑對小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤生長與轉(zhuǎn)移的抑制作用。方法40只C57BL小鼠皮下接種Lewis肺癌細(xì)胞建立肺腺癌移植瘤模型，隨機(jī)均分成對照組、RD組、順鉑組及RD聯(lián)合順鉑組，從接種后第4 天開始給予生理鹽水或相應(yīng)藥物干預(yù)，于接種后第29 天處死，通過免疫組化檢測皮下移植瘤組織CD34表達(dá)，熒光實時定量PCR檢測皮下移植瘤組織血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) mRNA表達(dá)，Western blotting測定皮下移植瘤組織 VEGF、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果RD聯(lián)合順鉑組抑瘤率、肺表面結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移抑制率高于RD組與順鉑組(P<0.01)，Q值為1.01；RD聯(lián)合順鉑組上述指標(biāo)改善程度優(yōu)于單獨用藥組(P<0.01)，但RD組與順鉑組相比，差異無顯著性(P>0.05)。結(jié)論RD聯(lián)合順鉑對小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤生長與轉(zhuǎn)移有相加抑制作用，其機(jī)制可能與拮抗腫瘤血管生成和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

蚤休薯蕷皂苷； 順鉑； Lewis肺癌； 血管內(nèi)皮生長因子； 凋亡

早期肺癌的治療以手術(shù)為主，輔以化療、放療，但大多數(shù)患者疾病發(fā)作時已接近中期或晚期，容易錯失最優(yōu)醫(yī)治時段[1]。近年來，從中藥及天然植物中提取高效低毒的抗腫瘤有效成分已成為國內(nèi)外抗腫瘤新藥開發(fā)的一條新途徑，具有重要的臨床意義。蚤休系百合科多年生草本植物蚤休及其同屬植物的根莖，我國野生資源十分豐富[2-3]。蚤休的主要化學(xué)成分為蚤休皂苷(重樓皂苷)，有抗炎、肝保護(hù)、抗氧化等多種藥理活性[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，蚤休皂苷也有較強(qiáng)的抗膠質(zhì)瘤[5]、皮膚癌[6]、結(jié)腸癌[7]、乳腺癌[8]作用。本文立足于RD聯(lián)合順鉑用藥的層面，探究小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤生長、轉(zhuǎn)移過程中的分子抑制機(jī)理，期望為肺癌的臨床治療提供一種新的化療藥物。

1 材料與方法

1.1動物、藥品與主要試劑Lewis肺癌(鼠源)荷瘤種鼠2只 和 C57BL小鼠40只(雌雄各半)購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，合格證號:SCXK京119-0007，其中C57BL小鼠體質(zhì)量為20±2 g，鼠齡4～5周，所有小鼠飼養(yǎng)于南華大學(xué)實驗動物學(xué)部SPF環(huán)境中。RD、順鉑分別購于天津馬克生物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)批號:980216)、江蘇豪生藥業(yè)股份有限公司(生產(chǎn)批號:040605)。原位切口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)凋亡檢測試劑盒與山羊抗兔 IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。Trizol試劑和PVDF膜(美國Invitrogen公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)、PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生工生物工程公司)、SYBR Green Real Time PCR Master Mix(日本 Toyobo公司)系上述公司產(chǎn)品。兔抗小鼠CD34、VEGF、Bcl-2、Bax、β-actin單克隆抗體由美國Santa Cruz 公司提供。

1.2肺腺癌移植瘤模型的制備按文獻(xiàn)[9]報道的方法構(gòu)建肺腺癌移植瘤的藥學(xué)模型，流程為:首先以脫頸椎致死的方法處死二只接受過Lewis肺癌荷瘤分子接種的小鼠，堅持無菌標(biāo)準(zhǔn)處理小鼠尸體，分離出腫瘤組織，并去除瘤體表層結(jié)締、壞死血管及相關(guān)病變組織，借助生理鹽水清洗瘤體，然后實施剪碎處理，接著將其放在勻漿器內(nèi)，按1 g腫瘤組織，3 mL生理鹽水的比例添加生理鹽水，研磨腫瘤組織成為細(xì)胞懸液，然后過360目鋼網(wǎng)，制成單細(xì)胞性質(zhì)的懸浮液，為使細(xì)胞密度達(dá)到1×107/mL，需要滴入部分生理鹽水。取出單細(xì)胞性質(zhì)的懸浮液0.2 mL，然后接種于每只C57BL小鼠的右腋皮下，每只0.2 mL，建立小鼠皮下移植瘤動物模型。

1.3實驗分組與給藥接種Lewis肺癌的C57BL小鼠仍然在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，所有小鼠皮下組織的移植部位已經(jīng)生成瘤，然后將其劃分作四組，分別是RD聯(lián)合順鉑組、順鉑組、RD組、對照組，每組10只。從接種后第4 天開始給藥，其中對照組予生理鹽水0.2 mL 腹腔注射，1次/天；RD組：將5 mg/kg RD溶入到生理鹽水(0.2 mL)里，并實施注射到腹腔內(nèi)，每日1次；RD聯(lián)合順鉑組：RD、順鉑按上述方法給藥。給藥時間共計26天，待給藥第29 天時，將各組小鼠處死，以作各種指標(biāo)的檢測所用。順鉑組:在生理鹽水(0.2 mL)里滴入順鉑2 mg/kg，并在實施接種之后的第5天、第12天、第19天分別注入一次，其他天數(shù)用生理鹽水進(jìn)行注射。

1.4基礎(chǔ)檢測在實施接種的前后一段時間內(nèi)，每間隔2 天測量一次小鼠體重指標(biāo)，并視體重起伏情況調(diào)改用藥劑量。實施接種以后，每間隔2天測量小鼠皮下組織的腫瘤長徑最大值與最小值，分別記作a、b。然后推算出腫瘤的體積值(V=a×b2/2)，制出腫瘤的生長變動曲線。在第29 天時，將小鼠處死，徹底分離出腫瘤，并實施稱重，推算出抑瘤率。抑瘤率=(1-各治療組瘤的平均質(zhì)量/對照組瘤的平均質(zhì)量)×100%。為了評價兩藥聯(lián)用的效果，根據(jù)金氏公式計算Q值，Q值=E(A+B)/(EA+EB-EA×EB)，這一公式中的EA代表RD組抑瘤率、EB代表順鉑組抑瘤率、E(A+B)代表RD聯(lián)合順鉑組抑瘤率，當(dāng)Q值<0.85為拮抗，介于0.85～1.15之間為相加，>1.15為協(xié)同。然后將瘤體分為兩部分，一部分放入中性甲醛(濃度是10%)中，并行固定、石蠟包裹等處理，接著切成5 μm厚的薄切片，施行免疫性染色與凋亡處理檢測；另一部分迅速放入液氮中凍存，再轉(zhuǎn)移至-70 ℃冰箱保存，用于熒光實時定量PCR和Western blotting檢測。之后剖開小鼠胸部，查看其雙肺表層腫瘤的轉(zhuǎn)移跡象，并對表層轉(zhuǎn)移的結(jié)節(jié)進(jìn)行計數(shù)，算出這些結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移率或抑制率，公式是:肺部表層結(jié)節(jié)的轉(zhuǎn)移率(或抑制率)=(1-各施藥組轉(zhuǎn)移平均結(jié)節(jié)數(shù)量/對照組轉(zhuǎn)移平均結(jié)節(jié)數(shù)量)×100%。

1.5免疫性染色處理與監(jiān)測選擇免疫性SABC方法對皮下移植瘤體組織(CD34)進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)而精確推算出微血管的密度值(microvessel density,MVD)，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)替換一抗，并將其當(dāng)作陰性的具體對照。判定MVD的標(biāo)準(zhǔn)為：不靠近腫瘤的細(xì)胞組織、微型血管、結(jié)締組織系統(tǒng)、且體現(xiàn)為棕黃色的CD34染色單皮細(xì)胞組織相互串計成一個血管，該血管肌層厚度較大。遵照MVD的計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)或參考weidner[10]法進(jìn)行計數(shù)，先于低倍鏡之下掃測切片的整體情況，然后在浸潤區(qū)內(nèi)挑選內(nèi)皮細(xì)胞顯色清楚的腫瘤，要求背景視野效果良好，且處于四個微血管最為密集的視野區(qū)內(nèi)，接著于高倍鏡的視野計數(shù)范圍中對全部顯色微血管進(jìn)行計數(shù)，測量四個微血管最為密集視野區(qū)的數(shù)量結(jié)果，都記作此切片微血管的實際數(shù)量值。

1.6腫瘤細(xì)胞的凋亡檢測以TUNEL檢測法探究腫瘤細(xì)胞的實際凋亡狀況，遵照試劑盒的操作指南開展相應(yīng)操作，并將已經(jīng)確證的陽性切片當(dāng)作對照。鑒別結(jié)果:若細(xì)胞核內(nèi)可見棕黃色的小顆粒，鑒別為陽性細(xì)胞，選取陽性細(xì)胞最為密集的顯色區(qū)，摒除壞死區(qū)域，各張檢測切片的計數(shù)相當(dāng)于10個高倍視野里凋亡陽性的細(xì)胞核數(shù)及總細(xì)胞核數(shù)，凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)=凋亡陽性的細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)×100%。

1.7熒光實時定量PCR 運用Trizol試劑提取皮下移植瘤組織總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。由上海生工生物工程公司合成VEGF、GAPDH引物，VEGF引物序列：5′-AGACAATGGGATGAAAGG-3′(sense)，5′-AAGCCAAAGGTCTGTTCC -3′ (antisense)，擴(kuò)增產(chǎn)物長度554 bp；引物序列(GAPDH)包括:5′-GTCTGGGATGGAAATTGTGA-3′(antisense)、5′-CTGCACCACCAACTGCTT-3′(sense)，擴(kuò)增產(chǎn)物長度660 bp。在Roach480熒光實時定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸2 min，總共35個循環(huán)。VEGF mRNA表達(dá)水平用ΔΔCt值法定量。

1.8 Western blotting 用蛋白裂解液釋放出皮下移植瘤內(nèi)包含的蛋白質(zhì)組織，進(jìn)而滴入一定量的5×SDS緩沖溶液、β-巰基乙醇(密度是10%)，實施10 min的100 ℃煮沸處理后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳操作，使電流移動到PVDF膜之上，放入5%的脫脂牛奶，然后將其放在室溫環(huán)境下封閉處理4 h，把1∶500稀釋的兔抗小鼠VEGF、Bcl-2、Bax、β-actin分別滴入一抗，4 ℃反應(yīng)過夜，PBS洗滌后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 500)，37 ℃孵育1 h，利用化學(xué)發(fā)光法分析各產(chǎn)物積分光密度值，計算VEGF、Bcl-2、Bax蛋白相對量。目標(biāo)蛋白表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白積分光密度值/β-actin積分光密度值。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法文中全部計量資料及相關(guān)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示，按照數(shù)據(jù)的類別選用t檢驗、q檢驗、多樣本均數(shù)間多重對比方差分析等方法，小型樣本資料使用Fisher確切概率法進(jìn)行計數(shù)，各類數(shù)據(jù)使用SPSS 10.0軟件處理，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1小鼠皮下移植瘤施予RD、順鉑后的生長情況皮下接種Lewis肺癌之后1～4天內(nèi)，成瘤率是 100%，且移植生成的腫瘤外觀較接近，各組皮下移植腫瘤組織的體積有增大趨勢，局部體現(xiàn)為結(jié)節(jié)狀的生長態(tài)勢。在第20～30天內(nèi)，對照組的移植腫瘤呈現(xiàn)出迅速生長情況，且生長速度顯著快過其余三組，各組當(dāng)中最慢的是RD聯(lián)合順鉑組。對小鼠尸體進(jìn)行解剖，查看腫瘤情況，可見腫瘤質(zhì)地比較硬，外面有包膜，部分呈侵入性生長，與周圍組織融合，表面有血管生長分布，以對照組最為明顯。如表1所示，與對照組比較，RD組、順鉑組及RD聯(lián)合順鉑組腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量明顯降低(P<0.01)，RD聯(lián)合順鉑組腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量亦低于RD組、順鉑組(P<0.01)，但RD組與順鉑組相比，差異無顯著性(P>0.05)；RD聯(lián)合順鉑組抑瘤率明顯高于RD組、順鉑組(P<0.01)，但RD組抑瘤率與順鉑組比較差異無顯著性(P<0.05)。

表1各組腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量及抑瘤率比較

組別n腫瘤體積(cm3)腫瘤質(zhì)量(g)抑瘤率(%)對照組106．69±1．546．01±1．090±0RD組104．15±0．79ab3．61±0．57ab39．42±5．49a順鉑組103．84±0．68ab3．25±0．51ab45．47±6．18aRD聯(lián)合順鉑組102．16±0．45b1．92±0．36b67．95±8．94

與RD聯(lián)合順鉑組比較，a:P<0.01;與對照組比較，b：P<0.01

2.2 RD與順鉑聯(lián)合用藥效果評價根據(jù)各用藥組的抑瘤率，應(yīng)用金氏公式計算RD聯(lián)合順鉑組的Q值，Q值為1.01，介于0.85與1.15之間，即RD與順鉑聯(lián)用對小鼠Lewis肺癌有相加抑制作用。

2.3 RD、順鉑對皮下移植瘤肺轉(zhuǎn)移的影響由表2可知，RD組、順鉑組及RD聯(lián)合順鉑組肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)較對照組減少(P< 0.01)，與RD組、順鉑組比較，RD聯(lián)合順鉑組肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)降低，肺表面結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移抑制率則升高，差異均有顯著性(P<0.01)，但RD組與順鉑組相比，肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)、肺表面結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移抑制率均無明顯變化(P>0.05)。

表2各組肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)、肺表面結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移抑制率及MVD比較

組別n肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)(個)肺表面結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移抑制率(%)MVD對照組1013．69±3．740±024．15±4．18RD組107．42±1．69ab45．78±6．49a13．29±2．45ab順鉑組106．23±1．27ab54．45±7．28a11．56±2．17abRD聯(lián)合順鉑組102．92±0．56b78．67±9．356．92±1．38b

與RD聯(lián)合順鉑組比較，a:P<0.01;與對照組比較，b：P<0.01

2.4 RD、順鉑對皮下移植瘤組織MVD的影響免疫組化染色顯示(圖1)，所有小鼠皮下移植瘤組織內(nèi)均有CD34表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕黃色。對照組皮下移植瘤組織MVD最高，予RD、順鉑或兩藥聯(lián)合處理后，MVD較對照組明顯下降(P<0.01)，此外，RD聯(lián)合順鉑組MVD低于各單獨用藥組(P<0.01)，但RD組與順鉑組比較，差異無顯著性(P>0.05)，見表2。

圖1 各組皮下移植瘤CD34表達(dá)(SABC×100)

2.5 RD、順鉑對皮下移植瘤組織VEGF mRNA與蛋白表達(dá)的影響為了進(jìn)一步揭示RD聯(lián)合順鉑拮抗Lewis肺癌新生血管形成的分子機(jī)制，運用熒光實時定量PCR、Western blotting檢測各組皮下移植瘤組織VEGF mRNA與蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示(圖2、3)，對照組VEGF mRNA與蛋白表達(dá)水平最高，RD聯(lián)合順鉑組蛋白表現(xiàn)水平和VEGF mRNA顯示為最低，同對照組比較，施藥組蛋白表現(xiàn)水平和VEGF mRNA明顯降低(P<0.01)，RD聯(lián)合順鉑組與RD組、順鉑組比較，VEGF mRNA與蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，但RD組與順鉑組相比，差異無顯著性(P>0.05)。

2.6 Lewis肺癌細(xì)胞施予RD、順鉑后的凋亡情況

凋亡細(xì)胞核是棕黃色部分，沒有凋亡細(xì)胞核是藍(lán)綠色部分(圖4)。對照組腫瘤細(xì)胞凋亡最少，RD聯(lián)合順鉑組腫瘤細(xì)胞凋亡最多，各用藥組AI較對照組明顯增加(P<0.01)，而且RD聯(lián)合順鉑組AI高于RD組、順鉑組，但RD組AI與順鉑組無區(qū)別(P>0.05，圖5)。

2.7 RD、順鉑對皮下移植瘤組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響為了初步闡明RD聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)理，運用Western blotting檢測皮下移植瘤組織Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)，圖6顯示，各施藥組Bcl-2蛋白表達(dá)都低對照組(P<0.01)，Bax蛋白表達(dá)高于對照組(P<0.01)；與單獨用藥組相比，RD聯(lián)合順鉑組Bcl-2蛋白表達(dá)水平減少(P<0.01)，Bax蛋白表達(dá)水平則增加(P<0.01)，但RD組與順鉑組比較，差異無顯著性(P>0.05)。

圖2 各組皮下移植瘤組織VEGF mRNA表達(dá) 與對照組比較，**P<0.01；與RD組、順鉑組比較，##P<0.01

圖3 各組皮下移植瘤組織VEGF蛋白表達(dá) 與對照組比較，**P<0.01；與RD組、順鉑組比較，##P<0.01

圖4 各組Lewis肺癌細(xì)胞TUNEL染色(×400)

圖5 各組Lewis肺癌細(xì)胞AI比較 與對照組比較，**P<0.01；與RD組、順鉑組比較，##P<0.01

圖6 各組皮下移植瘤組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 與對照組比較，**P<0.01；與RD組、順鉑組比較，##P<0.01

3 討 論

臨床中使用蚤休的歷史較長，其兼具消腫鎮(zhèn)痛、清火消毒、定驚疏肝等藥效，且該藥作為云南白藥中的一種重要成分，常被運用到癰腫、劇毒、動物咬傷、咽喉部位腫痛、抽搐驚風(fēng)等病癥的藥物治療中。蚤休含有脂肪酸酯、多糖、蚤休皂苷及黃酮類藥等多種化學(xué)成分，但80%為蚤休皂苷。王震等[11]用重樓皂苷VII處理人肺腺癌 A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷VII呈濃度與時間依賴性抑制腫瘤細(xì)胞增殖。另有研究證實，重樓皂苷I通過誘導(dǎo)人肺腺癌 A549細(xì)胞凋亡產(chǎn)生放射增敏作用[12]。作為從蚤休皂苷中提取的主要單體活性成分，本研究將RD和/或廣譜抗癌藥順鉑應(yīng)用于Lewis肺癌皮下移植瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)各用藥組腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量、肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯降低，以RD聯(lián)合順鉑組效果最顯著，而且RD聯(lián)合順鉑組抑瘤率、肺表面結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移抑制率高于RD組、順鉑組，應(yīng)用金氏公式評價兩藥聯(lián)用的效果，Q值介于0.85與1.15之間，提示 RD與順鉑聯(lián)用對小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的生長與轉(zhuǎn)移有相加抑制作用。

血管新生指在原有血管的基礎(chǔ)上已分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增生、遷移，并以套疊或芽生的方式形成新的毛細(xì)血管的過程，這一過程受到多種因素的調(diào)控，其中VEGF是最重要的血管生長因子，可使血管中的內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)特異性遷移、分裂及增殖，進(jìn)而生成微型血管，大幅度增強(qiáng)了血管的通透性[13-14]。血管新生在實體瘤的生長與轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，抑制新生血管的形成已成為抗腫瘤治療的重要策略[15]。已有研究證實，在缺氧條件下，重樓皂苷I明顯下調(diào)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞VEGF表達(dá)[16]。本研究中，RD組、順鉑組、RD聯(lián)合順鉑組MVD及VEGF mRNA與蛋白表達(dá)水平較對照組降低，且RD聯(lián)合順鉑組上述指標(biāo)低于RD組、順鉑組，這些結(jié)果表明，RD、順鉑同時用到體內(nèi)，可以降低VEGF的表達(dá)活性，減緩新生腫瘤的生成速度，達(dá)到抑制肺癌蔓延生長及轉(zhuǎn)移的效果。

凋亡又稱為I型程序化細(xì)胞死亡，指在多種基因調(diào)控下發(fā)生的細(xì)胞主動死亡過程。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅是由于腫瘤細(xì)胞過度增殖，還與腫瘤細(xì)胞凋亡過少有關(guān)，細(xì)胞凋亡對腫瘤進(jìn)展起到負(fù)調(diào)控作用。Bcl-2、Bax是最重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控因子，其中Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡。最近，姜福瓊等[17]用重樓皂苷II處理A375人黑素瘤細(xì)胞，導(dǎo)致凋亡率顯著增加。江皓等[18]報道，重樓皂苷I通過下調(diào)Bcl-2表達(dá)及上調(diào)Bax表達(dá)誘導(dǎo)胰腺癌 PANC-1 細(xì)胞凋亡。另有研究表明，重樓皂苷Ⅶ與順鉑聯(lián)用能有效促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡，其凋亡是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活caspase途徑實現(xiàn)的[19]。本實驗發(fā)現(xiàn)，各用藥組AI、Bax表達(dá)水平較對照組增加，而Bcl-2表達(dá)水平較對照組降低；與RD組、順鉑組相比，RD聯(lián)合順鉑組AI、Bax表達(dá)水平進(jìn)一步增加，Bcl-2表達(dá)水平進(jìn)一步降低，表明RD聯(lián)合順鉑經(jīng)減少Bcl-2/Bax比例促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡，這也是兩藥聯(lián)用發(fā)揮抗肺癌作用的重要機(jī)制。

綜上所述，以RD影響Lewis皮下移植肺癌瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況，可取得很好的抑制效果，同時增用順鉑，能夠增強(qiáng)抑制藥效。此外，該種藥用機(jī)理同阻礙腫瘤血管生長、加快腫瘤細(xì)胞凋亡有較大聯(lián)系性，這一結(jié)論為RD作為抗腫瘤藥物應(yīng)用于肺癌治療提供了理論基礎(chǔ)與實驗依據(jù)，但其抗肺癌機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

[1] Siegel R,Ward E,Brawley O,et al.Cancer statistics,2011:the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths[J].CA Cancer J Clin,2011,61(4):212-236.

[2] 張星星,童佳兵,楊程.肺癌化療毒副反應(yīng)中西醫(yī)探討[J].臨床肺科雜志，2016,21(1):152-155.

[3] 劉單,鄧述愷.鉑類藥物與肺癌化療的臨床研究進(jìn)展[J].西南軍醫(yī),2015,17(1):62-65.

[4] 何含杰,章懷云,陳麗莉,等.重樓皂苷的藥理作用和臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中藥材,2014,37(3):527-530.

[5] 鄭彬,王穗暖,屈洪濤,等.重樓皂苷Ⅰ與重樓皂苷Ⅱ?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞U251的抑制作用及其機(jī)制研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2013,12(12):1220-1223.

[6] 姜福瓊,王曉瓊,劉馨,等.重樓皂苷Ⅱ?qū)θ似つw鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞 A431 增殖的影響[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2015,36(12):21-24.

[7] 李宇華,孫陽,樊磊,等.重樓皂苷VI抑制結(jié)腸癌 LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制研究[J].華南國防醫(yī)學(xué)雜志,2015,29(8):571-574.

[8] 胡煒彥,李菊,賀智勇,等.重樓皂苷Ⅰ對人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7 體內(nèi)外生長的抑制作用[J].中成藥,2015,37(7):1582-1585.

[9] 賀兼斌,張貽秋,向志,等.蘇拉明聯(lián)合人參皂苷 Rg3抑制肺腺癌小鼠移植瘤生長的作用[J].天津醫(yī)藥,2013,41(9):887-891.

[10] Weidner N.Tumor angiogenesis:review of current application in tumor prognosis[J].Semin Diagn pathol,1999,10(4):302-313.

[11] 王震,李亞榮,郝杰,等.重樓皂苷Ⅶ對耐順鉑人肺腺癌 A549 /DDP 細(xì)胞增殖的抑制作用[J].中國老年學(xué)雜志,2013,33(1):145-147.

[12] 趙鵬軍,馮建國,馬勝林.重樓皂苷Ⅰ對肺腺癌 A549 細(xì)胞系放射增敏作用研究[J].腫瘤學(xué)雜志,2012,18(2):108-110.

[13] Marina ME,Roman II,Constantin AM,et al.VEGF involvement in psoriasis[J].Clujul Med,2015,88(3):247-252.

[14] Weathers SP,de Groot J.VEGF Manipulation in Glioblastoma[J].Oncology (Williston Park),2015,29(10):720-727.

[15] Hall RD,Le TM,Haggstrom DE,et al.Angiogenesis inhibition as a therapeutic strategy in non-small cell lung cancer (NSCLC)[J].Transl Lung Cancer Res,2015,4(5):515-523.

[16] 龍劍文,皮先明,王玉英,等.重樓皂苷Ⅰ對缺氧誘導(dǎo) HaCaT 細(xì)胞 VEGF表達(dá)的影響[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2015,29(9):891-894.

[17] 姜福瓊,鄧丹琪,王劍松,等.重樓皂苷Ⅱ?qū)?A375 人黑素瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].皮膚病與性病,2015,37(3):125-128.

[18] 江皓,趙鵬軍,馬勝林.重樓皂苷Ⅰ通過 PI3K/Akt 途徑誘導(dǎo)胰腺癌PANC-1 細(xì)胞凋亡的研究[J].腫瘤學(xué)雜志,2014,20(2):127-130.

[19] 張嘉玲,鄭長軍,楊瑞琦,等.重樓皂苷Ⅶ聯(lián)合順鉑通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡[J].中國實驗診斷學(xué),2015,19(1):6-9.

InhibitoryEffectsofRhizomeDioscinCombinedwithCisplatinonSubcutaneousTransplantedTumorGrowthandMetastasisofLewisLungCarcinomainMice

DENG Riqiang,CHENG Jiangtao,ZHANG Honghua,et al
(DepartmentofRespiratoryMedicine,theYueBeiPeople’sHospital,Shaoguan,Guangdong512026,China)

ObjectiveTo study the fleas Hugh yam saponins combined cisplatin on Lewis lung carcinoma in mice subcutaneous transplantation tumor growth and metastasis inhibition.Methods40 C57BL mice subcutaneously vaccinated Lewis lung cancer cell adenocarcinoma of lung transplantation tumor model is set up,and randomly divided into control group,the RD group,cisplatin group and RD with cisplatin group,since 4 days after inoculation to saline or corresponding drug intervention,29 days after inoculation executed by subcutaneous transplantation tumor tissue expression of CD34 immunohistochemical detection,real-time fluorescent quantitative PCR detection of subcutaneous transplantation tumor tissue vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA expression,Western blotting determination of subcutaneous transplantation tumor tissue VEGF,Bcl-2,Bax protein expression.ResultsThe inhibitory rate and lung surface nodal metastasis inhibition rate of RD with cisplatin group were higher than the RD and cisplatin group (P<0.01),with Q value of 1.01;RD with cisplatin group improved the index,which was better than the single drug group (P<0.01),but the RD group compared with cisplatin group,had no significant difference (P>0.05).ConclusionCombination of RD and cisplatin has an additive inhibitory effect on subcutaneous transplanted tumor growth and metastasis of Lewis lung carcinoma in mice,which is involved in blockade of angiogenesis and induction of tumor cell apoptosis.

rhizome dioscin; cisplatin; Lewis lung carcinoma; vascular endothelial growth factor; apoptosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.05.006

2016-03-16；

2016-08-18

廣東省韶關(guān)市衛(wèi)生局立項編號Y15023；韶關(guān)市衛(wèi)計局項目.

R734.2

A

蔣湘蓮)