煤礦污染土壤降解苯并(a)芘微生物多樣性及降解能力研究

費瑩瑩， 曾獻春*， 鄭李娟， 杜為軍

(1．新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054)

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煤礦污染土壤降解苯并(a)芘微生物多樣性及降解能力研究

費瑩瑩1， 曾獻春1*， 鄭李娟1， 杜為軍2

(1．新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054)

以苯并(a)芘(50 mg/L)為唯一碳源，對新疆蘆草溝煤礦開采區(qū)土壤微生物進行3代脅迫培養(yǎng)(每代60 d)；采用PCR-DGGE方法了解不同污染程度土樣中降解苯并(a)芘的微生物類群和多樣性特點；利用高效液相色譜(HPLC)測定脅迫培養(yǎng)每代培養(yǎng)物混合菌群對苯并(a)芘的降解能力。PCR-DGGE結(jié)果顯示：不同污染程度原始樣品與苯并(a)芘脅迫培養(yǎng)第3代培養(yǎng)物的微生物香濃指數(shù)(H)、豐度(S)和均勻度(E)有所不同，其中重度污染培養(yǎng)物降解苯并(a)芘的微生物類群最豐富。對優(yōu)勢條帶進行克隆，其主要歸屬于變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)。經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)重度污染樣品中的群體微生物對苯并(a)芘的降解率明顯高于輕度和中度污染樣品，達到78.4%。研究表明新疆蘆草溝煤礦開采區(qū)污染的土壤中可能蘊藏著降解苯并(a)芘的微生物資源。

煤炭污染；苯并(a)芘；微生物多樣性；生物降解

新疆的自然生態(tài)環(huán)境具有復(fù)雜性和脆弱性特點[1]。煤炭開采過程對生態(tài)環(huán)境、土地資源、水體及大氣環(huán)境等造成不良影響，致使本就脆弱的干旱區(qū)生態(tài)系統(tǒng)進一步被破壞。新疆煤炭資源主要分布在新疆北部和東部，很大一部分煤礦分布在山區(qū)，地處河流上游，如烏魯木齊河、頭屯河、庫車河、伊犁河等上游都有一定數(shù)量的煤礦分布[2]。多環(huán)芳烴類(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)化合物是自然環(huán)境中最常見的有機污染物，分布廣，多產(chǎn)生于石油開采、煤炭開采和煤炭焦化過程。目前新疆煤炭開采區(qū)的PAHs主要來源于煤和煤矸石的自燃[3-4]，可通過土壤、水體、空氣等進入環(huán)境，對開采區(qū)域的環(huán)境造成較大污染[5]。多環(huán)芳烴類物質(zhì)(PAHs)主要有苯并(a)芘、萘、蒽等。苯并(a)芘結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難溶于水，是一種強致癌物和誘變劑，能引起多器官的癌變，被認(rèn)為是多環(huán)芳烴環(huán)境致癌物的標(biāo)志物，對人類健康造成潛在的威脅[6-7]。煤炭開采礦區(qū)產(chǎn)生的苯并(a)芘可以造成土壤和水體的污染，影響到整個生態(tài)系統(tǒng)。長時間的污染將對生態(tài)環(huán)境中的生物和環(huán)境周圍的人類產(chǎn)生較嚴(yán)重后果。本研究立足于新疆煤炭開采環(huán)境中多環(huán)芳烴類化合物對生態(tài)環(huán)境的不良影響，對煤炭開采區(qū)污染的土壤樣品，以苯并(a)芘為唯一碳源脅迫培養(yǎng)，獲得可降解苯并(a)芘的微生物類群，利用PCR-DGGE在微生物多樣性應(yīng)用的成熟技術(shù)[8]，了解新疆煤炭開采區(qū)降解苯并(a)芘的微生物組成，并對其群體降解能力進行研究，以獲得來源于新疆煤炭開采區(qū)，可降解苯并(a)芘的微生物，為煤炭開采區(qū)環(huán)境保護與治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 采集新疆蘆草溝煤礦開采區(qū)(80°59′～80°52′ E，44°13′～44°14′ N)污染的土樣。煤礦開采出口為重度污染區(qū)(W)，距離開采出口20～40 m處為中度污染區(qū)(M)，40 m以外為輕度污染區(qū)(L)。在不同程度污染區(qū)分別選擇10個位點取表層0～20 cm土壤樣品，用無菌袋收集混勻，做好標(biāo)記帶回實驗室置于4 ℃保存，備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 脅迫培養(yǎng)基：Na2HPO30.6 g， KH2PO30.4 g， CaCl·2H2O 0.02 g， MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·7H2O 0.02 g， FeSO4·7H2O 0.01 g， NH4NO31 g，苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品50 mg(Sigma公司)，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器 PCR儀(加拿大 BBI公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Gene Genius公司)；U-3010紫外-可見分光光度計(Hitachi公司)；旋渦混合器(XW-80A，上海醫(yī)大儀器廠)，超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠)，高效液相色譜儀(Agilent 1200) 等。

1.2 方法

1.2.1 脅迫培養(yǎng) 相同污染區(qū)域的土樣混合，無菌稱取來源于不同污染的土樣10 g轉(zhuǎn)入90 mL加玻璃珠無菌水中震蕩3 h，靜置30 min。移取10 mL靜置的上清液接種到90 mL含有苯并(a)芘終濃度為50 mg/L的脅迫培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r/min避光培養(yǎng)，每一種污染程度設(shè)置3個平行，每隔60 d移取10 mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到上述新鮮的培養(yǎng)基，培養(yǎng)3代，共180 d。

1.2.2 培養(yǎng)物基因組DNA的提取 稱取3不同污染區(qū)原始土樣各10 g，分別轉(zhuǎn)入90 mL無菌水中震蕩3 h后，離心收集原始土樣中菌體(L-0、M-0、W-0)和第3代脅迫培養(yǎng)物中菌體(L-3、M-3、W-3)，采用十六烷基三甲基溴化銨法(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide,CTAB)提取各樣品總DNA[9]。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) 將3種不同污染程度的原始土樣和脅迫培養(yǎng)第3代培養(yǎng)物的總DNA送至北京億鳴復(fù)興生物技術(shù)有限公司進行DGGE分析，根據(jù)結(jié)果進行多樣性分析。

1.2.4 DGGE條帶的序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 對脅迫培養(yǎng)第3代樣品中清晰可見的22個條帶(圖1)進行克隆、測序。將測序結(jié)果用DNAstar和Cluster軟件進行序列分析，采用MEGA軟件，Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)(bootstrap)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-DGGE分析降解苯并(a)芘微生物的多樣性

2.1.1 PCR 產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE) 新疆煤炭開采區(qū)不同污染程度原始土壤樣品(L-0、M-0、W-0)以及以苯并(a)芘脅迫培養(yǎng)第3代(L-3、M-3、W-3)的微生物PCR-DGGE指紋圖譜如圖1所示，根據(jù)圖譜中的條帶數(shù)目、遷移率和灰度等信息可以看出：不同污染程度的土壤樣品中微生物豐富性均較高，隨著脅迫培養(yǎng)代數(shù)增加，微生物原有類群減少，但特異性類群富集。

圖1 PCR產(chǎn)物的DGGE電泳圖和模式圖Fig.1 PCR-DGGE electrophoresis diagram and schematic diagramL-0：輕度污染土壤樣品；M-0：中度污染土壤樣品;W-0：重度污染土壤樣品；L-3、M-3、W-3:對應(yīng)脅迫培養(yǎng)第3代樣品Lightly, moderate, severe pollution of soil samples were marked as L-0,M-0,W-0,and corresponding stress training samples of the third generation were marked as L-3,M-3,W-3

通過計算戴斯系數(shù)可以得到群落之間細(xì)菌種類差異的信息，如圖2所示，6個樣品中污染程度相同的L-0與L-3、M-0與M-3、W-0與W-3的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性分別是42%、40%、67%，但3個污染程度不同的樣品之間微生物群落結(jié)構(gòu)相似性比較低，最低為28%。由此可知，煤炭污染程度不同，可降解苯并(a)芘的微生物類群有所不同。

圖2 依據(jù)樣品間的相似系數(shù)構(gòu)建聚類圖(UPGMA)Fig.2 According to the similarity coefficient between the sample cluster diagram

2.1.2 降解苯并(a)芘微生物的遺傳多樣性 根據(jù)電泳圖譜中每條條帶的信息，對各樣品中的細(xì)菌香濃指數(shù)(H)、豐度(S) 和均勻指數(shù)(E) 等指標(biāo)進行綜合分析，結(jié)果如表1 所示，實驗中始終以高濃度苯并(a)芘(50 mg/L)作為唯一碳源，脅迫培養(yǎng)3代后，一些不能夠耐受苯并(a)芘的微生物數(shù)量逐漸減少，甚至消失。重度污染區(qū)的樣品中，降解苯并(a)芘微生物多樣性比中度和輕度污染區(qū)微生物更為豐富。說明隨著煤炭污染程度的增加，能夠降解苯并(a)芘的微生物種類增多。

表1 各樣品之間的微生物多樣性分析

2.1.3 樣品降解苯并(a)芘優(yōu)勢條帶序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 將脅迫培養(yǎng)第3代樣品中22個優(yōu)勢電泳條帶回收、克隆、測序，結(jié)果與GenBank中的序列進行比對，得到條帶所代表的細(xì)菌類型，每個回收條帶選取3個克隆進行了序列測定，結(jié)果如表2。采用MEGA5軟件，Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)(bootstrap)為1 000，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

由表2結(jié)果分析可知，新疆蘆草溝煤礦出口污染區(qū)土壤樣品中能夠降解有機污染物苯并(a)芘的微生物主要歸屬于變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)。其中優(yōu)勢菌為變形菌門(Proteobacteria)，主要有中華根瘤菌屬、發(fā)菌屬、布氏桿菌屬、甲基營養(yǎng)菌屬、斯氏假單胞菌屬、豬布魯士桿菌屬、貪銅菌屬、無色桿菌屬、固氮氏螺菌屬，占克隆條帶的68%；屬于放線菌門(Actinobacteria)的有小單胞菌屬、分枝桿菌屬、中華單胞菌屬，占克隆條帶的23%；屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)的包括發(fā)菌屬、鞘氨醇菌屬，占克隆條帶的9%。

圖3 基于V3區(qū)序列構(gòu)建的煤礦降解菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the V3 sequence of colliery degrading bacteria and related species

樣品來源樣品編號最相似菌株名稱登錄號相似度/%菌門L?3MK1費氏中華根瘤菌SinorhizobiumfrediiNR＿10291999Proteobacteri變形菌門L?3MK5甲基營養(yǎng)菌MethylobacteriumextorquensNR＿07413899Proteobacteri變形菌門L?3MK8費氏中華根瘤菌SinorhizobiumfrediiNR＿102919100Proteobacteri變形菌門L?3MK30斯氏假單胞菌PseudomonasstutzeriNR＿074829100Proteobacteri變形菌門L?3MK45貪銅菌屬CupriaviduspauculusNR＿02494498Proteobacteri變形菌門L?3MK68無色桿菌AchromobacterinsolitusNR＿02568598Proteobacteri變形菌門L?3MK60甲基營養(yǎng)菌MethylobacteriumextorquensNR＿074138100Proteobacteri變形菌門L?3MK69無色桿菌AchromobacterinsolitusNR＿02568599Proteobacteri變形菌門

續(xù)表2

2.2 HPLC測定混合菌對苯并(a)芘降解能力的分析

經(jīng)高效液相色譜法分析，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)、濃度(x)為橫坐標(biāo)，得到苯并(a)芘含量在10～60 mg/L的線性回歸方程為y=117.16x+871.85，相關(guān)系數(shù)R=0.999，結(jié)果表明，在此濃度范圍內(nèi)所得苯并芘的峰面積與濃度線性關(guān)系良好。以標(biāo)樣加入法測定該萃取方法的回收率，結(jié)果如表3所示，該方法萃取苯并(a)芘的回收率在80.2%～91.6%。

表3 不同污染程度樣品中苯并(a)芘的回收率與降解率

煤礦不同污染程度的土壤微生物菌群對苯并(a)芘的降解率，經(jīng)HPLC測定結(jié)果如表3所示，計算出降解率如圖4所示，輕度(L)、中度(M)、重度(W)煤炭污染土樣菌群在脅迫培養(yǎng)第1代后，對苯并(a)芘的降解率達到65.8%、81.9%、54.7%。

經(jīng)第三代脅迫培養(yǎng)，輕度污染和中度污染的樣品降解能力減弱為31.7%、42.4%，而重度污染的樣品降解能力增長為78.4%。樣品通過180 d脅迫培養(yǎng)，群體微生物活力和數(shù)量都受到抑制，其中低污染度和中污染度的樣品在苯并(a)芘長時間脅迫培養(yǎng)中菌群數(shù)量減少，群體降解率下降。重度污染樣品脅迫第3代后對苯并(a)芘的降解率穩(wěn)定保持在78.4%，說明重度污染土壤中可降解苯并(a)芘的微生物類群較多，可適應(yīng)長時間、高濃度苯并(a)芘的培養(yǎng)環(huán)境，能較好利用和轉(zhuǎn)化苯并(a)芘，因此其降解能力明顯高于輕度和中度污染區(qū)。

圖4 不同污染程度煤礦土壤微生物對苯并(a)芘的降解Fig.4 Benzo(a)pyrene biodegradation by Microorganisms from different microbial

3 討 論

近年來, 國內(nèi)外對苯并(a)芘污染土壤的微生物降解報道較多[10-14]。從水體、海洋的水樣和沉積物、被石油污染的土壤中均分離到能夠降解苯并(a)芘的微生物，它們主要歸屬于分枝桿菌屬(Mycobacterium)[15-17]。本實驗從新疆煤礦污染區(qū)土壤樣品中分離出能夠降解有機污染物苯并(a)芘的微生物，主要歸屬于變形菌門(Proteobacteria) 、擬桿菌門( Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)，其中優(yōu)勢菌主要歸屬于變形菌門(Proteobacteria)。采用PCR-DGGE對污染程度不同的樣品中可降解苯并(a)芘的微生物類群進行研究，可以發(fā)現(xiàn)不同污染程度的環(huán)境中降解苯并(a)芘的微生物類群的數(shù)量和種類有一定的差異。污染嚴(yán)重的環(huán)境中降解菌的種類和數(shù)量都較多，隨著污染程度的不斷減弱，降解菌的類群和數(shù)量也隨之減少。說明在長期受污染嚴(yán)重的環(huán)境中的微生物為了適應(yīng)不良條件，能夠利用污染物作為營養(yǎng)物質(zhì)進行能量代謝，微生物與污染物在自然環(huán)境中相輔相助，可以幫助受污染土壤進行自身修復(fù)，也促進了苯并(a)芘的有效降解[18-19]。

目前國內(nèi)外關(guān)于煤礦污染區(qū)土壤微生物對苯并(a)芘的降解少有研究，主要集中在石油土壤和海洋微生物對苯并(a)芘的降解研究。如鄭天凌等[20]從九龍江口鳳林灣紅樹林區(qū)、廈門近海海域、熱帶太平洋中部和東部的多金屬結(jié)核區(qū)深海沉積物中分離得到39株能利用苯并(a)芘作為唯一碳源和能源的混合菌，對苯并(a)芘的降解率在5.15%～52.43%。本實驗中，重度污染樣品經(jīng)長期脅迫培養(yǎng)后，群體微生物對苯并(a)芘的降解率明顯高于輕度和中度污染樣品，達到78.4%。本研究后期將進一步完成降解單菌的分離、純化、鑒定和降解能力的研究，希望能夠獲得來源于新疆煤炭開采區(qū)可降解苯并(a)芘的微生物資源。

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Benzo(a)pyrene-Degrading Microbial Diversity &Degradation Ability in Coal Mine Polluted Soil

FEI Ying-ying1, ZENG Xian-chun1, ZHENG Li-juan1, DU Wei-jun2

(1.Coll.ofLifeSci., 2.Coll.ofChem. &Chem.Engin.,XinjiangNormalUni.,Urumqi, 830054)

Soil microbes from coal mining areas of Lucaogou coal mine in Xinjiang was studied with medium supplemented with benzo(a)pyrene (50 mg/L) as the sole carbon source training for three generations (60 days per generation); PCR-DGGE approach was adopted to understand benzo(a)pyrene-degrading microbial taxa features and diversity from the different level of polluted soil samples collected from the mining areas; High performance liquid chromatography (HPLC) was used to measure degradation ability of benzene(a)pyrene of every generation of stress training microbial group. The PCR-DGGE results showed that: there are differences in microbial aroma and thickness index (H), abundance (S), and evenness (E) from different pollution levels of the original samples and the third generation of stress culture samples with benzo(a)pyrene. Among them the culture of heavily polluted soil had the most abundant benzo(a)pyrene degradable microbial cluster. Clones of dominant bands mainly belong to Proteobacteria, Bacteroidetes, and Actinobacteria. It was found through HPLC determination that the degradation rate of benzo(a)pyrene by cluster microbe from heavily polluted sample obviously higher than those from lightly and/or moderate polluted samples, the gap was as high as 78.4%. The studies suggested that the polluted soil in coal extractive area in Lucaogou coal mine in Xinjiang may store benzo(a)pyrene degradable microbial resources.

coal pollution; benzo(a)pyrene; microbial diversity; biodegradation

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(2011211A032)

費瑩瑩 女，碩士研究生。研究方向為應(yīng)用微生物。E-mail：124021518@qq.com

* 通訊作者。女，碩士生導(dǎo)師，教授。研究方向為應(yīng)用微生物。Tel：0991-4351488，E-mail:zengxc2004@163.com

2014-10-29；

2015-01-26

Q939

A

1005-7021(2016)01-0069-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.012