刺槐根瘤菌與纖維素分解菌對(duì)上海青和高粱的促生效應(yīng)

鄧振山， 杜 洋, 賀曉龍, 趙瑞華

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

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刺槐根瘤菌與纖維素分解菌對(duì)上海青和高粱的促生效應(yīng)

鄧振山， 杜 洋, 賀曉龍, 趙瑞華

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

通過(guò)盆栽試驗(yàn)，用刺槐根瘤菌(RhizobiumofRobiniapseudoacacia)與纖維素分解菌(Cellulose-decomposing Bacteria)對(duì)高粱和上海青進(jìn)行單獨(dú)接種和混合接種，采用針刺、浸種和涂葉3種接種方法，測(cè)量其各種生長(zhǎng)指標(biāo)。初步探究刺槐根瘤菌與纖維素分解菌聯(lián)合對(duì)禾本科作物高粱和雙子葉作物上海青兩種非豆科植物的促生效應(yīng)。結(jié)果表明，在非針刺條件下，兩種菌混接組(B組)比單獨(dú)接種根瘤菌組(D組)的促生效應(yīng)更顯著，上海青B組在滅菌條件下的根長(zhǎng)促生率比D組高出48.97%，高粱B組在非滅菌條件下干重的促生率比D組高出30.76%；而且除了高粱的B組干重以外，盆栽試驗(yàn)條件下，B、D兩組的其他生長(zhǎng)指標(biāo)在滅菌情況下的促生率比非滅菌條件下的促生率高，差別最大的為上海青B組鮮重，滅菌條件下比非滅菌條件下高出47.13%。根瘤菌與纖維素分解菌混合接種非針刺組，對(duì)高粱和上海青的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)促生效應(yīng)明顯，可為今后進(jìn)一步開(kāi)發(fā)非豆科作物菌肥提供試驗(yàn)依據(jù)。

刺槐根瘤菌；纖維素分解菌；混合接種；促生效應(yīng)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物材料 單子葉植物高粱(Sorghumvulgare)、雙子葉十字花科植物上海青(BrassicachinensisL.)種子購(gòu)自延安市某種子站。

1.1.2 盆栽實(shí)驗(yàn)土壤來(lái)源及處理 盆栽實(shí)驗(yàn)的土壤取自延安大學(xué)后山，去除表層2 cm部分，采用5點(diǎn)采樣法在2～10 cm之間取樣；將土樣采集后用孔徑為5 mm的篩子篩選，處理后的土壤與細(xì)沙按照土∶沙(質(zhì)量比)=2∶1的比例混合均勻后裝入上口直徑15 cm，下底直徑9 cm，高11.8 cm的塑料花盆中備用，每盆約裝土1.5 kg[17]。

1.1.3 供試培養(yǎng)基及營(yíng)養(yǎng)液 ①YMA培養(yǎng)基：甘露醇10 g，酵母粉1.0 g，硫酸鈉0.2 g，氯化鈣0.1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，根瘤微量元素液(硼酸5 g，鉬酸鈉5 g，蒸餾水1 000 mL)4 mL，氯化鈉0.1 g ，蒸餾水1 000 mL，瓊脂粉18～20 g，pH 7.0；②牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，pH 7.2；③剛果紅鑒別培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10 g，硫酸鎂0.25 g，磷酸氫二鉀0.5 g，氯化鈉0.25 g，瓊脂11 g，蒸餾水500 mL，加入剛果紅指示劑；④PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯100 g，蔗糖10 g，瓊脂8.5 g，蒸餾水500 mL；⑤無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液：蒸餾水1 000 mL，磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸鎂0.2 g，氯化鈉0.2 g，硫酸鈣0.1 g，碳酸鈣5.0 g，pH 7.0～7.5。

1.1.4 供試菌株 根瘤菌Rhizobiumleguminosarum，分離自刺槐根瘤，纖維素分解菌Bacillussubtilis，均由延安大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定和保藏。

1.2 方法

1.2.1 滅菌沙土盆栽法 ①接種物的準(zhǔn)備：取保藏于YMA斜面的根瘤菌菌苔1環(huán)，接種到裝有100 mL液體YMA培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，用 PBS 緩沖液(氯化鈉8 g,氯化鉀0.2 g,磷酸氫二鈉1.44 g,磷酸二氫鉀0.24 g, pH 7.4)稀釋至約2.0×108cfu/mL，備用[11]。將纖維素分解菌點(diǎn)種到剛果紅培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落周圍出現(xiàn)透明圈，將水解圈大的菌株蛇形劃線到PDA斜面培養(yǎng)基上。取經(jīng)活化的纖維素分解菌1環(huán)接種到裝有100 mL液體PDA培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，用 PBS 緩沖液稀釋至約2.0×108cfu/mL，備用[18]。②種子的處理：挑選飽滿的種子用蒸餾水洗凈，先用75%的酒精將種子浸泡5 min，然后用3%的次氯酸鈉浸泡3 min，再用無(wú)菌水清洗8次。培養(yǎng)皿及濾紙高壓滅菌處理，每個(gè)培養(yǎng)皿中放入5粒種子，并加入2 mL滅菌水于濾紙中，置于28 ℃恒溫箱中催芽。③無(wú)菌沙土盆的準(zhǔn)備：將裝有土壤的沙土盆放入高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌，每次1 h，重復(fù)滅菌3次。④接種[19]：將已催芽的種子按表1方式分為A、B、C、D和E五組。各組接種分別采用以下不同方法：a.針刺接種：用無(wú)菌解剖針在種子催出的芽上穿刺造成傷口，用無(wú)菌藥棉蘸取菌懸液和無(wú)菌水分別敷于傷口處，接種后保濕5 d；b.浸種接種：用無(wú)菌水浸泡種子24 h后，將種子放入菌懸液中浸泡12 h，用清水洗凈種子表面的細(xì)菌；c.涂葉接種：待植株生長(zhǎng)5、25、45 d后，用無(wú)菌藥棉醮取菌株培養(yǎng)液和無(wú)菌水分別涂抹株苗葉片接種，每次接種菌懸液5 mL，接種后保濕5 d。用以上方法接種時(shí)，如果為兩種菌混接，均先接種纖維素分解菌再接種根瘤菌，且間隔2 h。E組為空白對(duì)照。⑤播種[17]：將滅菌的沙土盆按表1編號(hào)，并一一對(duì)應(yīng)將上述接過(guò)菌的種子播入無(wú)菌沙土盆中，每盆5粒種子，深度約為1.5 cm，并覆土。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，自然光下培養(yǎng)并以無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液保持其水分充足。⑥測(cè)量：苗出齊后，每盆定苗3株。60 d后取樣，分別測(cè)量植株的生長(zhǎng)指標(biāo)，如株高、根長(zhǎng)、鮮重、干重和葉片的葉綠素含量(SPAD)值，并計(jì)算出A、B、C、D各組生長(zhǎng)指標(biāo)相對(duì)于空白對(duì)照E組的促生率。

促生率(%)=

表1 滅菌沙土盆栽實(shí)驗(yàn)的處理設(shè)置

注： “+”表示采用此種方法接種；“-”表示不采用此種方法接種

1.2.2 非滅菌沙土盆栽法 除不做滅菌處理，其他操作方法均與無(wú)菌沙土盆栽法相同。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件和IBM SPSS Statistics v19.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌沙土盆栽條件下接種根瘤菌與纖維素分解菌對(duì)高粱和上海青的促生效應(yīng)

通過(guò)滅菌沙土盆栽高粱和上海青并接種根瘤菌和纖維素分解菌測(cè)得對(duì)植物幼苗促生結(jié)果見(jiàn)表2。

表2結(jié)果表明，在滅菌沙土盆栽條件下，植物培養(yǎng)60 d后， B組實(shí)驗(yàn)即根瘤菌與纖維素分解菌混接且不采用針刺接種時(shí)，對(duì)高粱和上海青的促生效應(yīng)均明顯優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組的促生效應(yīng)。兩種菌混合接種且不采用針刺接種時(shí)，在株高、鮮重、干重、根長(zhǎng)和SPAD值與對(duì)照組比較對(duì)上海青的促生效應(yīng)分別增加了42.03%、111.11%、85.45%、56.86%和9.05%；對(duì)高梁的促生效應(yīng)分別增加了18.9%、52.24%、53.41%、11.1%和5.48%。D組實(shí)驗(yàn)即只接種根瘤菌且不進(jìn)行針刺接種的促生效應(yīng)次之，只接種根瘤菌且不進(jìn)行針刺接種時(shí)，在株高、鮮重、干重、根長(zhǎng)和SPAD值與對(duì)照組比較對(duì)上海青的促生效應(yīng)分別增加了19.19%、69.64%、56.36%、7.89%和6.36%；對(duì)高粱的促生效應(yīng)分別增加了2.89%、25.26%、37.82%、4.84%和2.77%。A、C兩組實(shí)驗(yàn)對(duì)這兩種植物均無(wú)促生效應(yīng)，甚至有抑制效果。

2.2 非滅菌沙土盆栽條件下接種根瘤菌與纖維素分解菌對(duì)高粱和上海青的促生效應(yīng)

通過(guò)非滅菌沙土盆栽高粱和上海青并接種刺槐根瘤菌和纖維素分解菌測(cè)得對(duì)植物幼苗促生結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 滅菌沙土盆栽條件下刺槐根瘤菌與纖維素分解菌對(duì)非豆科植物生長(zhǎng)的影響

注: 植株在 60 d 測(cè)量, 表中數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差, 不同字母表示不同的顯著性差異(P<0.05)，下表同

表3 非滅菌沙土盆栽條件下刺槐根瘤菌與纖維素分解菌對(duì)非豆科植物生長(zhǎng)的影響

表3結(jié)果表明，在非滅菌沙土盆栽條件下，植物培養(yǎng)60 d后，B組實(shí)驗(yàn)即根瘤菌與纖維素分解菌混接但不采用針刺接種時(shí)，對(duì)高粱和上海青的促生效應(yīng)均優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組的促生效應(yīng)。兩種菌混合接種且不采用針刺接種時(shí)，在株高、鮮重、干重、根長(zhǎng)和SPAD值與對(duì)照組比較對(duì)上海青的促生效應(yīng)分別增加了39.93%、63.98%、51.85%、41.72%和5.45%，對(duì)高梁的促生效應(yīng)分別增加了16.22%、48.71%、55.38%、9.84%和4.46%。D組實(shí)驗(yàn)即只接種根瘤菌且不進(jìn)行針刺接種的促生效果次之，而且B組和D組植物各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)差異變大。只接種根瘤菌且不進(jìn)行針刺接種時(shí)，在株高、鮮重、干重、根長(zhǎng)和SPAD值與對(duì)照組比較對(duì)上海青的促生效應(yīng)只增加了18.97%、27.96%、16.67%、7.53%和2.72%，對(duì)高梁的促生效應(yīng)分別增加了2.59%、 20.87%、24.62%、3.85%和1.85%。A、C兩組對(duì)上海青的各項(xiàng)指標(biāo)均有抑制作用，A、C兩組對(duì)高粱的株高、根長(zhǎng)和SPAD有抑制作用。

2.3 上海青滅菌、非滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)的促生率對(duì)比

將上海青滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)與非滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)中B組和D組的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)與E組相比較得出的促生率見(jiàn)圖1。圖1表明，上海青B組和D組在滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)條件下的促生率均高于非滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)條件下的促生率。B組滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)株高、鮮重、干重、根長(zhǎng)和SPAD值的促生率相比非滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)分別高出2.1%、47.13%、33.6%、15.14%和3.6%；D組滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)比非滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)分別高出0.22%、41.68%、39.69%、0.36%和3.64%。

圖1 上海青盆栽實(shí)驗(yàn)促生率Fig.1 The growth index growth rate of Brassicachinensis L. under the condition of pot experimentand

2.4 高粱滅菌、非滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)的促生率對(duì)比

將高粱滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)與非滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)中B組和D組的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)與E組相比較得出的促生率見(jiàn)圖2。

圖2 高粱盆栽實(shí)驗(yàn)促生率Fig.2 The growth index growth rate of Sorghum vulgare under the condition of pot experimentand

圖2表明，高粱除了B組干重以外，B組和D組在滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)條件下其他生長(zhǎng)指標(biāo)的促生率比非滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)條件下的高，但差距不大。B組滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)株高、鮮重、根長(zhǎng)和SPAD值的促生率相比非滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)分別高出2.68%、3.53%、1.26%和1.02%；D組滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)比非滅菌盆栽實(shí)驗(yàn)分別高出0.3%、4.39%、13.2%、0.99%和0.92%。

3 討 論

本研究采用滅菌沙土盆栽和非滅菌沙土盆栽兩種不同栽培方法，各具不同的條件，滅菌沙土盆栽實(shí)驗(yàn)可以達(dá)到去除微生物的理想效果，最大程度排除了其他微生物的干擾，而非滅菌沙土盆栽外部條件比較復(fù)雜。這些不同的外部條件在不同程度上影響了根瘤菌對(duì)各種植物生長(zhǎng)的作用，從而使同一組實(shí)驗(yàn)在不同的生長(zhǎng)條件下所測(cè)的生長(zhǎng)指標(biāo)也不相同。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論是滅菌沙土盆栽還是非滅菌沙土盆栽實(shí)驗(yàn)條件，兩種菌混接且都不進(jìn)行針刺接種(B組實(shí)驗(yàn))對(duì)兩種不同的非豆科植物在各項(xiàng)指標(biāo)上均表現(xiàn)出很顯著的促生作用，這是因?yàn)楦鼍梢宰鳛橹参飪?nèi)生菌侵入非豆科植物根部并定殖，從而促進(jìn)非豆科植物的生長(zhǎng)[20]。Al-Mallah等[8]直接采用植物細(xì)胞壁降解酶先降解歐洲油菜的細(xì)胞壁，再接種根瘤菌的方法，結(jié)果顯示根瘤菌不僅定殖在油菜細(xì)胞內(nèi)而且還促進(jìn)了油菜生長(zhǎng)，本研究中B組實(shí)驗(yàn)采用的纖維素分解菌產(chǎn)生的纖維素酶可能水解植物部分細(xì)胞壁，促使根瘤菌更容易侵入非豆科植物根系，并起到促進(jìn)非豆科植物生長(zhǎng)的作用，此結(jié)果與Al-Mallah等的一致。作為內(nèi)生菌，根瘤菌的促生作用表現(xiàn)在多個(gè)方面，比如可以提高非豆科植物對(duì)氮、磷等元素的吸收率、提高光合速率和植物根部的呼吸強(qiáng)度，產(chǎn)生吲哚乙酸和赤霉素等調(diào)節(jié)生長(zhǎng)的植物激素以及增強(qiáng)植物抗逆能力和對(duì)病原菌的生物控制等[21]。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，也可以看到B組實(shí)驗(yàn)在株高、鮮重、SPAD值等各方面的促生效應(yīng)都比其他組實(shí)驗(yàn)更為顯著。雖然只接種根瘤菌但不進(jìn)行針刺接種(D組實(shí)驗(yàn))的促生效果明顯不如B組，但是也有一定的應(yīng)用價(jià)值。因?yàn)楦鼍鳛榉嵌箍浦参颬GPR的一個(gè)重要種類，可以在非豆科植物比如水稻、油菜等的根際定殖，并對(duì)非豆科植物根系以及地上部分的生長(zhǎng)有很好的促進(jìn)作用，這與王平等[10]、張曉霞等[11]和馬天瑞等[12]的研究結(jié)果一致。

兩種菌混合接種且都進(jìn)行針刺接種(A組)和只接種根瘤菌且針刺接種(C組)相比對(duì)照組而言出現(xiàn)抑制作用，可能是因?yàn)獒槾探泳鷷r(shí)對(duì)植物根系造成傷害，尤其是在非滅菌沙土盆栽實(shí)驗(yàn)條件下更易導(dǎo)致病原微生物快速入侵，且病原菌一般生長(zhǎng)速度快，短期內(nèi)就成為優(yōu)勢(shì)菌，其通過(guò)獲取植物營(yíng)養(yǎng)大量生長(zhǎng)，同時(shí)還會(huì)釋放毒素及堵塞植物維管束等，導(dǎo)致植物體生長(zhǎng)期間植株矮小、莖細(xì)、葉片發(fā)黃等。

實(shí)驗(yàn)表明，每種植物B組和D組滅菌沙土盆栽實(shí)驗(yàn)條件下的促生率比非滅菌條件下的促生率高，分析原因有三點(diǎn)：① 非滅菌沙土中含病原微生物數(shù)量多，從而影響植物生長(zhǎng)，且多種微生物與根瘤菌有拮抗作用，由此影響根瘤菌生長(zhǎng)[22];②滅菌沙土盆栽實(shí)驗(yàn)中高溫高壓處理土壤時(shí)蒸汽殺死土壤中大量生物，死亡的生物細(xì)胞快速釋放出有機(jī)質(zhì)進(jìn)入土壤，從而使得土壤中可溶性有機(jī)質(zhì)含量增加，這與張輝等[23]的研究結(jié)果一致;③ 根瘤菌為好氧菌，高溫滅菌后土壤間隙增大，有利于植物與微生物的呼吸作用，這還有待于進(jìn)一步研究。盆栽條件與大田生長(zhǎng)條件相差很大，在復(fù)雜的田間環(huán)境下以上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是否穩(wěn)定發(fā)揮其促生作用，還有待田間實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究并未測(cè)定根瘤菌在植物體內(nèi)的定殖情況，有待于對(duì)根瘤菌進(jìn)行標(biāo)記，并結(jié)合激光共聚焦顯微鏡深入研究其在植物體內(nèi)的定殖及分布規(guī)律。

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Combined Rhizobium of Robinia pseudoacacia with Cellulose-decomposing Bacteria for Promoting Growth of Shanghai Green (Brassica chinensis) And Sorghum vulgare

DENG Zhen-shan, DU Yang, HE Xiao-long， ZHAO Rui-hua

(Coll.ofLifeSci.,Yan’anUni.,Yan’an716000)

The growth-promoting effect ofRhizobiumwith cellulose-decomposing bacteria (CDB) onSorghumvulgareand Shanghai green (Brassicachinensis) using pot experiment withRhizobiaand CDB single and mixed inoculation to the plants was carried out, using acupuncture, seed soaking, and leaf daubing three inoculation methods, and determine their various growth indices. The growth promotion effects ofRhizobiumcombined with CDB on sorghum of graminaceous crops and Shanghai green of dicotyledonous crops these two non-fabaceous crops were initially probed deeply into. The results showed that under the conditions of non-stab inoculation of combined with two kinds of bacteria (group B) had more significant effects on their growth promotion than that inoculated with singleRhizobium(group D). Under sterilized conditions, the growth rate of root length of Shanghai green was over 48.97% higher than that of group D, and the dried weight in group B ofS.vulgaregrew higher than 30.76%; Moreover, the other growth promotion indices of group B and D with sterilized pot experiment, the growth promotion rate was higher than that of the non-sterilized pot experiment. And in addition, the dried weight ofS.vulgarein group B, under sterilized conditions, the largest difference was the Shanghai green's fresh weight, under sterilized conditions it was higher by 47.13% than that under non-sterilized conditions. The growth promoting effect of combinedRhizobiumwith CDB onS.vulgareand Shanghai green of non-stab groups had significant effects on various growth promotion indices, these can provide an experimental foundation for further development of microbial fertilizer for crops of non-fabaceous family in the future.

RhizobiumofRobiniapseudoacacia; cellulose-decomposing bacteria (CDB); mixed inoculation; growth-promoting effect

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)計(jì)劃項(xiàng)目(2013JM3004); 陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2012CGX7，2012KTZB03-02-03)；

鄧振山 男，博士，副教授。主要從事微生物資源與利用和環(huán)境微生物研究。Tel: 0911-2332030, E-mail: zhenshandeng214@163.com

2015-03-19；

2015-05-11

Q939.96

A

1005-7021(2016)01-0036-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.007

陜西省協(xié)同創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2015XT-34)；延安大學(xué)“陜北微生物資源與利用研究中心”科研機(jī)構(gòu)專項(xiàng)基金